甘草有效成分的提取分離實(shí)驗(yàn)方案.docx

甘草有效成分的提取分離實(shí)驗(yàn)方案實(shí)驗(yàn)?zāi)康模和ㄟ^(guò)對(duì)甘草中甘草黃酮、甘草酸和甘草多糖的提取分離，進(jìn)一步理解他們的理化性質(zhì)，并且初步掌握提取分離的方法。實(shí)驗(yàn)原理：黃酮類(lèi)化合物則泛指兩個(gè)苯環(huán)（A環(huán)與B環(huán)）通過(guò)中央三碳相互聯(lián)接而成的一系列化合物。根據(jù)中央三碳的氧化程度、是否成環(huán)、B環(huán)的聯(lián)接位點(diǎn)等特點(diǎn)，可將該類(lèi)化合物分為多種結(jié)構(gòu)類(lèi)型。代表化合物有甘草黃酮、甘草素、異甘草素、甘草甙、異甘草甙、甘草查爾酮等。甘草中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的黃酮類(lèi)化合物有一百多種，本實(shí)驗(yàn)只對(duì)其進(jìn)行粗提，并且測(cè)定其總含量。甘草酸是一類(lèi)三萜類(lèi)皂苷，主要以甘草酸鉀、鈣鹽的形式存在，是甘草次酸的二葡萄糖醛酸甙，含量在4-20%之間；甘草酸水解脫去糖酸鏈變形成了甘草次酸。超臨界CO2萃取甘草總黃酮的萃取率是1. 35%，含量32. 45%，是索氏提取法提取甘草總黃酮的提取率的2.2倍，索氏提取溶劑用量是超臨界CO2萃取的6倍。本實(shí)驗(yàn)采取超臨界CO2萃取法提取甘草黃酮?！?】大孔樹(shù)脂適于物質(zhì)水溶液的分離純化，超臨界C02萃取提取的甘草總黃酮中乙醇含量過(guò)高，即使對(duì)萃取液進(jìn)行濃縮處理，其中乙醇的含量仍然很高，所以大孔樹(shù)脂的吸附、解吸附的效果不好。萃取液濃縮近干加入水后，所要分離的物質(zhì)析出變混濁，也不適合用大孔樹(shù)脂進(jìn)行分離純化。與大孔樹(shù)脂層析比較，硅膠柱層析可以更有效的分離純化甘草黃酮。使用硅膠柱層析可以有效地使甘草黃酮類(lèi)物質(zhì)的含量達(dá)到55%以上，收率1. 12%，符合國(guó)家中藥二類(lèi)新藥的原料要求。【1】綜合考慮，本實(shí)驗(yàn)選擇硅膠柱層析對(duì)甘草黃酮進(jìn)行分離純化。甘草酸和甘草次酸的極性比黃酮類(lèi)物質(zhì)的極性大，更易溶于極性大的低濃度乙醇中，采用85%乙醇作為夾帶劑，使得在二氧化碳超臨界萃取甘草黃酮類(lèi)物質(zhì)過(guò)程中，大部分甘草酸和甘草多糖仍然留在殘?jiān)小ｈb于甘草酸和甘草多糖都溶于水的性質(zhì)，本實(shí)驗(yàn)采用超聲或微波輔助法對(duì)它們同時(shí)進(jìn)行提取3。對(duì)于提取后的甘草酸和甘草多糖的分離，可查閱到的方法包括醇沉酸沉法3。考慮到大孔吸附樹(shù)脂對(duì)糖類(lèi)的吸附能力很差，也可以嘗試用大孔樹(shù)脂對(duì)甘草酸和甘草多糖進(jìn)行分離。本實(shí)驗(yàn)采用前者進(jìn)行分離。一、甘草黃酮的提取：超臨界C02萃取法工藝【1】：原料粒度:40-60目投料量:180g/罐萃取壓力:30Mpa萃取溫度:50 0C夾帶劑及液固比: 85%乙醇，液固比(V：W)為5:1C02流量:l0kg/h萃取時(shí)間:5小時(shí)分離壓力:5. 5Mpa.分離溫度:400C二、甘草黃酮的分離純化：硅膠柱層析工藝【1】：萃取液濃縮干品:硅膠量=0.5:20流速：1.0倍柱體積/小時(shí)流動(dòng)相：CHCl3 : CH30H=4 :1 三、甘草酸和甘草多糖的提?。撼曒o助溶劑提取法工藝【1】：溶劑：水提取次數(shù)：3次，每次25min溫度：450C固液比=1: l0超聲功率：1000W四、甘草酸和甘草多糖的分離：醇沉酸沉法5(1)萃余相用95乙醇或無(wú)水乙醇調(diào)節(jié)至乙醇濃度為5080，靜置824小時(shí)，過(guò)濾，上清液備用，濾渣干燥得甘草多糖粗品。(2)上清液濃縮至20時(shí)的比重為1.051.20，用硫酸或鹽酸調(diào)pH至1.52.0，室溫或410低溫靜置848小時(shí)，去上清液，沉淀物用冷水或冷酸水洗滌至洗滌水pH35，沉淀物干燥得甘草酸粗品。五、含量測(cè)定：分光光度法1、甘草黃酮含量測(cè)定1標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：精密稱(chēng)取在105干燥恒重的蘆丁對(duì)照品適量，用95%乙醇溶解，搖勻，定容使之成為濃度為1mg/ml的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液，作為貯備液。精密量取上述溶液0, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4. 0.5, 0.6m1，分別加水至3m1，加5%亞硝酸鈉水溶液0. 5m1，放置6分鐘，加10%硝酸鋁0.5m1,混勻后放置5分鐘，加入5%氫氧化鈉溶液25m1,混勻，放置15分鐘后，蒸餾水定容至lOml。用721紫外分光光度計(jì)，在=500nm處測(cè)吸收度。以對(duì)照品濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)做標(biāo)準(zhǔn)曲線。含量測(cè)定：測(cè)出樣品吸光度，帶入回歸方程，計(jì)算得出樣品濃度。2、甘草多糖含量測(cè)定3標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備：精密稱(chēng)取干燥恒重的葡萄糖0.0194g,配成1OOml溶液，濃度為0.194mg/ml。從中精密吸取O.lml, 0.2m1,0.3m1, O.5ml, 0.7m1, 0.9m1，分別加入1 ml苯酚溶液和5ml濃硫酸，300C恒溫O.5h，冷水浴冷卻至室溫，定容到5Oml，在490nm處測(cè)定吸光度。以不加樣為空白。以濃度C對(duì)吸光度A回歸,做回歸方程。含量測(cè)定：測(cè)出樣品吸光度，帶入回歸方程，計(jì)算得出樣品濃度。3、甘草酸含量測(cè)定3標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備：精密稱(chēng)取適量甘草酸標(biāo)準(zhǔn)品，配成0.4217mg.m1-1的標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別精密量取1.00m1, 2.00m1, 3.00m1,4.00m1的標(biāo)準(zhǔn)溶液，用50%的乙醇溶液稀釋至250m1,在最大吸收波長(zhǎng)max= 259nm處測(cè)吸收度，以空白為參比液，得線性回歸方程.含量測(cè)定：測(cè)出樣品吸光度，帶入回歸方程，計(jì)算得出樣品濃度。1付玉杰. 甘草黃酮和甘草酸提取純化工藝研究D.東北林業(yè)大學(xué),2002.2王巧娥. 甘草有效成分的新型提取技術(shù)及高速逆流色譜分離方法研究D. 廈門(mén)大學(xué),