乙型腦炎病毒研究.docxVIP

中文摘要目的：流行性乙型腦炎是危害人類(lèi)健康比較嚴(yán)重的蟲(chóng)媒病毒。盡管目前乙腦的發(fā)病率有所下降，但發(fā)病區(qū)域仍呈現(xiàn)不斷擴(kuò)大的趨勢(shì)。加強(qiáng)乙腦的監(jiān)測(cè)，就可以評(píng)估該地區(qū)乙腦的流行狀況。蚊子是JEV的主要傳播媒介，對(duì)蚊子的流行性乙型腦炎病毒和蟲(chóng)媒病毒進(jìn)行分子流行病學(xué)監(jiān)測(cè)，對(duì)疾病預(yù)防具有防范意義。 方法：首先將云南省景洪縣采集15份蚊蟲(chóng)樣品研磨接種BHK-21和C6/36單層細(xì)胞，待出現(xiàn)細(xì)胞病變。提取病毒RNA，并反轉(zhuǎn)錄cDNA進(jìn)行PCR鑒定將目的基克隆到pMD18-T載體，送上海生工測(cè)序。同時(shí)進(jìn)行蓋塔病毒、辛德畢斯、基孔肯雅病毒的PCR鑒定，回收并測(cè)序。在此基礎(chǔ)上構(gòu)建了乙腦基因I型標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒，建立了基于SYBR Green I染料的Real-time PCR檢測(cè)方法，選取Ct值制作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。結(jié)果：乙腦PCR擴(kuò)增目的基因經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證為乙腦基因I型，然后構(gòu)建應(yīng)用熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒。研究建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)能夠準(zhǔn)確定量目的基因，線(xiàn)性相關(guān)度很高，呈現(xiàn)良好的重復(fù)性，熔解曲線(xiàn)為單一峰型，未出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增。SYBR Green I Real-time PCR與傳統(tǒng)方法相比靈敏度要高10倍，而且與豬藍(lán)耳病毒等，均不發(fā)生非特異性擴(kuò)增，具有良好的特異性。結(jié)論：鑒定了基因I型乙腦病毒，并構(gòu)建了快速檢測(cè)乙腦I型的檢測(cè)方法。通過(guò)實(shí)驗(yàn)初步驗(yàn)證了其具備良好的靈敏性和重復(fù)性，為以后乙腦的流行病學(xué)調(diào)查奠定了基礎(chǔ)。關(guān)鍵詞：乙型腦炎病毒 基因I型 蟲(chóng)媒病毒 熒光定量PCR 前 言乙型腦炎病毒，主要引起病毒性腦炎，每年可導(dǎo)致10,00015,000人死亡，然而乙型腦炎是一個(gè)被忽視的熱帶病。本病容易引發(fā)中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病，臨床上以高熱、意識(shí)障礙、呼吸衰竭等神經(jīng)癥狀為特征，具有明顯的季節(jié)性和地域性。本病的致死率為25-30%，相當(dāng)一部分為嬰兒，50%可造成永久性后遺癥。乙型腦炎病毒分布區(qū)域已經(jīng)廣泛而且還在不斷地向亞洲和大洋洲區(qū)域擴(kuò)展，因此乙型腦炎病毒被認(rèn)為是新發(fā)和再度出現(xiàn)的病原菌。盡管有許多有效的免疫措施，乙型腦炎依然是一個(gè)影響全球健康的疾病。乙型腦炎病毒可能是通過(guò)野生或者馴養(yǎng)的環(huán)境傳播前者，主要是野鳥(niǎo)作為擴(kuò)散宿主，后者主要是豬作為擴(kuò)散宿主。庫(kù)蚊，特別是三帶喙庫(kù)蚊，是最主要的媒介。乙腦目前有5個(gè)基因型流行，研究發(fā)現(xiàn)基因型I已經(jīng)取代基因型III為主導(dǎo)乙腦病毒基因型。在據(jù)報(bào)道在1949年中國(guó)大陸的報(bào)道了第一個(gè)JE病例，之后中國(guó)有成為亞洲的高度流行區(qū)。20世紀(jì)50年代以來(lái)，100余株乙腦病毒從不同的宿主分離到。因此JE是在中國(guó)法律上報(bào)告?zhèn)魅静?。雖然近年來(lái)乙腦的發(fā)病率和死亡率均下降，但對(duì)于在中國(guó)流行的乙腦病毒各地方株之間的差異所知甚少。蟲(chóng)媒病毒由蚊子和蜱傳播的疾病。蟲(chóng)媒病毒主要分布于溫帶、熱帶和亞熱帶，世界上大多數(shù)地區(qū)都有蟲(chóng)媒病毒的分離。蟲(chóng)媒病毒引起諸多癥狀如全身性發(fā)熱、關(guān)節(jié)炎、出血和腦炎等, 甚至導(dǎo)致神經(jīng)麻痹及損傷，嚴(yán)重的還可以引起死亡。蟲(chóng)媒疾病的發(fā)病率一般隨季節(jié)性變化，受溫度或降雨的波動(dòng)影響及脊椎動(dòng)物宿主豐富程度。疫情發(fā)生則是當(dāng)環(huán)境條件有利于蟲(chóng)媒病毒傳播周期內(nèi)顯著擴(kuò)增。近年來(lái)隨著中國(guó)與東盟等國(guó)家的貿(mào)易、旅游等活動(dòng)的進(jìn)一步發(fā)展，中國(guó)存在著蟲(chóng)媒病毒暴發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)本研究選取在云南省報(bào)道過(guò)的蟲(chóng)媒病毒，蓋塔病毒、基孔肯雅和辛德畢斯，進(jìn)行分子生物學(xué)調(diào)查和病毒分離。 文獻(xiàn)綜述1 乙型腦炎病毒的研究進(jìn)展流行性乙型腦炎（乙腦）又稱(chēng)日本乙型腦炎病毒（Japanese encephalitis virus，JEV）是由蚊子傳播的病毒性腦炎疾病，嚴(yán)重危害人類(lèi)的健康。過(guò)去的幾十年，動(dòng)物傳染性疾?。ㄓ梢吧蝻曫B(yǎng)動(dòng)物傳染給人）的發(fā)病率顯著增加了70%或更多1。乙型腦炎病毒作為為親神經(jīng)的黃病毒科黃病毒屬成員，可通過(guò)蚊子將病毒從動(dòng)物傳播給人。在人類(lèi)中，這種人畜共患疾病在世界范圍內(nèi)引起流行性病毒性腦炎，影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)（CNS) 2-3。有關(guān)乙型腦炎的發(fā)病機(jī)理和本病的臨床表現(xiàn)（包括嚴(yán)重的神經(jīng)癥狀）的一些因素已被深入研究4-5。本病潛伏期為5-15天，乙型腦炎的致死率為25-30%，相當(dāng)一部分為嬰兒，50%可造成永久性后遺癥。1871年在日本，乙型腦炎第一次發(fā)現(xiàn) 6。盡管1941年研究出了有效疫苗，而且隨著的國(guó)家性的免疫措施大大降低了乙型腦炎的發(fā)病率，但仍有一些零星感染事件發(fā)生，而且在南亞，東亞，東南亞以及大洋洲地區(qū)仍舊廣泛地傳播7。目前，超過(guò)30億人生活在乙型腦炎流行的國(guó)家。雖然所有年齡段的人都可能感染乙型腦炎病毒，但兒童乙型腦炎的發(fā)病率更高，這主要是因?yàn)榇蟛糠殖赡耆司哂忻庖吡?。目前，每年大約有68000例乙型腦炎，至少導(dǎo)致10000-15000人死亡9-10。1.1乙腦基因結(jié)構(gòu)日本腦炎病毒是黃病毒科家族成員，是單股正鏈RNA病毒11，外面有衣殼包被, 呈二十面體結(jié)構(gòu)。乙腦基因組大約11kb，包含一個(gè)開(kāi)放閱讀框（ORF）編碼的蛋白。整個(gè)基因組編碼三個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白（C，M，E）和7個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白（NS1，NS2a，NS2b，NS3，NS4a，NS4b，NS5）。非編碼區(qū)（5和3）在開(kāi)放閱讀框的兩側(cè)，順序?yàn)椋?-C-prM/M-E-NSl-NS2a-NS2b-NS3-NS4a-NS4b-NS5-3。C蛋白結(jié)合RNA形成衣殼12。PrM與E蛋白形成異源二聚體，直到病毒被釋放13。在病毒粒子釋放之前，PrM 蛋白是由furin-like蛋白酶來(lái)切割形成成熟的（M）蛋白。與E蛋白結(jié)合形成二聚體從而被激活。糖基化包膜蛋白（E）和膜蛋白（M），形成二十面體衣殼嵌入在磷脂雙分子層14。E蛋白是較大的結(jié)構(gòu)蛋白，有500個(gè)氨基酸和兩個(gè)潛在的糖基化位點(diǎn)組成。這些抗原域已經(jīng)通過(guò)X射線(xiàn)晶體學(xué)鑒定15。E蛋白參與許多重要的生物學(xué)過(guò)程，包括血凝、病毒中和、病毒顆粒組裝。硫酸乙酰肝素分子最近已確定為黃病毒進(jìn)入細(xì)胞的受體。病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞通過(guò)內(nèi)吞作用。隨后的脂質(zhì)膜與內(nèi)吞體膜的融合讓病毒RNA滲透到感染細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中。E蛋白在毒力表型中起主要作用并且單個(gè)氨基酸取代可能造成嗜神經(jīng)毒性的丟失。在一項(xiàng)關(guān)于RP9（強(qiáng)毒）和臺(tái)灣乙腦分離（NT109）（減毒株）的R2（弱毒株）表型差異的研究發(fā)現(xiàn)10，這種差別歸因于在E蛋白的不同，E蛋白138位RP9為Glu，RP2為L(zhǎng)ys，其他的差異在于PrM蛋白第43位氨基酸RP9為T(mén)yr，RP2為His。因?yàn)镻rM N末端92個(gè)氨基酸被裂解并且不存在于成熟的JEV病毒粒子，因此認(rèn)為E蛋白改變第138位置單一氨基酸導(dǎo)致其毒力的差異。非結(jié)構(gòu)病毒蛋白為乙腦病毒的復(fù)制提供功能性監(jiān)管酶。 1.2乙型腦炎病毒的基因型及進(jìn)化1.2.1基因型通過(guò)對(duì)C/PrM和E（衣殼，前體膜和囊膜）基因進(jìn)行核酸測(cè)序，已經(jīng)鑒定出五種乙型腦炎病毒的基因型?；騃型大多數(shù)病毒株分離自泰國(guó)北部，柬埔寨和韓國(guó); II型分布在泰國(guó)南部，印度尼西亞，馬來(lái)西亞和澳大利亞16-17; III型分布在亞洲的大部分是溫帶地區(qū)日本，韓國(guó)，中國(guó)，臺(tái)灣，菲律賓，印度和斯里蘭卡;IV型分布在印尼東部; V型僅限于馬來(lái)西亞18，但最近在中國(guó)和韓國(guó)發(fā)現(xiàn)了該型的分離株。IV型和V型是乙型腦炎病毒最古老的家族成員，他們起源于印度尼西亞-馬來(lái)西亞地區(qū)。因此，乙型腦炎病毒最初的傳播可能來(lái)源于此。乙腦I型，II型和III型流行最廣泛，占到1935年-2009年間所分離病毒株的98%19。1.2.1病毒進(jìn)化 直到現(xiàn)在，影響乙型腦炎基因型的歷史，出現(xiàn)和傳播的地域因素尚未十分清楚。事實(shí)上，基因型的出現(xiàn)和傳播似乎與環(huán)境因素有關(guān)20。在一些從來(lái)沒(méi)出現(xiàn)過(guò)乙型腦炎的地區(qū)（例如，在西藏，這被認(rèn)為是無(wú)乙腦病毒的寒冷和高海拔地區(qū)出現(xiàn)了V型乙腦病毒的基因型，在澳洲出現(xiàn)了I型腦炎病毒）現(xiàn)在也被一些優(yōu)勢(shì)基因型代替了（比如III型向I型轉(zhuǎn)變）21。這些變化被認(rèn)為是日本乙型腦炎病毒找到了一個(gè)新的合適的載體或者宿主有關(guān)22。更有可能的是與環(huán)境因素（例如，澳大利亞蚊通過(guò)風(fēng)傳播），動(dòng)物生態(tài)學(xué)（如動(dòng)物的遷徙），人類(lèi)活動(dòng)（例如I型乙型腦炎病毒通過(guò)生豬貿(mào)易傳入澳大利亞），氣候變化有關(guān)，他們可能影響著日本乙型腦炎病毒的分布和基因型的產(chǎn)生。1.3乙型腦炎病毒的流行病學(xué)1.3.1分子流行病學(xué)最近亞洲溫帶地區(qū)的流行的基因型主要是I型和III型，而熱帶地區(qū)的流行的基因型主要是II和IV型。因此有人推測(cè)乙型腦炎病毒的流行病學(xué)差異可能與基因型有關(guān)23。然而，最新的發(fā)現(xiàn)表明基因型可能與流行病學(xué)或流行區(qū)域無(wú)關(guān)。的確，大洋洲的熱帶地區(qū)分離到乙腦I型，II型在1970s之前在韓國(guó)的溫帶地區(qū)流行24-25，目前III型僅在印度出現(xiàn)主要在南印度島（流行性）和北方流行（地方性）26。 乙型腦炎病毒基因組的差異也許可以解釋本病的表型變化。在實(shí)驗(yàn)室中對(duì)E基因的改變，發(fā)現(xiàn)與老鼠和猴子神經(jīng)侵染性和神經(jīng)毒性的喪失和獲得有關(guān)。盡管如此，有關(guān)乙型腦炎病毒野生株對(duì)小鼠神經(jīng)毒性的實(shí)驗(yàn)表明并不存在明顯的基因型-表型關(guān)系27-30。因此仍然沒(méi)有確鑿的證據(jù)表明乙型腦炎病毒基因型的流行在毒力上有所不同。然而，另一個(gè)與黃病毒相近的登革熱病毒2型被證實(shí)存在這種基因型依賴(lài)性特征31，如對(duì)人病毒性致病性和埃及伊蚊腸病毒性復(fù)制。到目前為止，對(duì)乙型腦炎病毒分子標(biāo)志的研究仍不夠充分，有待于進(jìn)一步研究32。乙型腦炎病毒流行病學(xué)模式似乎由一系列復(fù)雜的因素包括環(huán)境，生態(tài)和免疫因素所影響的，而不是僅僅由病毒遺傳因素所決定的。1.3.2空間流行病學(xué)乙型腦炎病毒的分布區(qū)域一直在擴(kuò)大。有時(shí)，乙型腦炎病毒分離株的基因型會(huì)發(fā)生地方性地改變。有報(bào)道稱(chēng)在越南和泰國(guó)的北部，存在II型和I型的轉(zhuǎn)變33。在北溫帶地區(qū)（如日本，南朝鮮和中國(guó)東北），I型逐漸地取代了III型而且變成了主要的基因型34?；騃型很可能是目前亞洲最流行的基因型，而且發(fā)現(xiàn)其對(duì)人類(lèi)是致命的35。然而，迄今為止僅有基因III型株的疫苗，這些疫苗對(duì)各種流行基因型，變種和基因型的交叉反應(yīng)中和抗體的保護(hù)水平需要進(jìn)一步的研究36。特別是對(duì)基因I型的免疫應(yīng)答不明顯，持續(xù)時(shí)間有待解決。1.4傳播媒介超過(guò)30種蚊子（屬于伊蚊，瘧蚊，阿蚊，庫(kù)蚊和曼蚊屬）是潛在的能夠攜帶乙型腦炎病毒的37，但并不是所有的蚊子都能夠傳播病毒。不同蚊子種屬之間或內(nèi)部的敏感性有差異，而且可能與基因型具有協(xié)同性，這在登革熱和基孔肯雅熱病毒中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)出來(lái)38-39。不同種蚊子對(duì)不同基因型的乙型腦炎病毒的感受狀態(tài)和傳染性沒(méi)有變化，這已經(jīng)被證實(shí)。庫(kù)蚊是乙型腦炎病毒最強(qiáng)的媒介，同樣伊蚊是登革熱病毒的最強(qiáng)媒介40。媒介的生態(tài)，特別是宿主取食的偏好性可以解釋病毒對(duì)媒介低的可塑性，因?yàn)楹苌傥米右砸倚湍X炎病毒宿主為食。例如，澳洲大陸的環(huán)紋庫(kù)蚊是乙型腦炎病毒的主要媒介，主要以有袋目動(dòng)物為食，以此保持乙型腦炎病毒的傳播循環(huán)41-42。乙型腦炎病毒的傳播主要通過(guò) 環(huán)紋庫(kù)蚊，環(huán)面蚊，棕頭庫(kù)蚊，雜鱗庫(kù)蚊復(fù)合群以及水稻種植區(qū)的三帶喙庫(kù)蚊43。三帶喙庫(kù)蚊是乙型腦炎病毒的主要媒介，因?yàn)槠渚哂休^強(qiáng)的敏感性，而且在乙型腦炎病毒流行的地區(qū)廣泛分布44。乙型腦炎病毒的媒介具有很高的嗜血性，尤其對(duì)禽，牛，豬和人類(lèi)45。因此，媒介的攝食偏好性是影響病毒適應(yīng)性的主要生態(tài)因素。感受能力的變化可能是由于蚊子腸內(nèi)和唾液腺感染的敏感性差異，因此病毒的分泌和傳播的效率存在差異。對(duì)乙型腦炎病毒的易感性可能部分依賴(lài)于病毒的E基因序列46。該基因編碼的一個(gè)蛋白，首先參與病毒通過(guò)附著細(xì)胞膜受體進(jìn)入細(xì)胞過(guò)程，然后參與乙型腦炎病毒和宿主細(xì)胞膜融合過(guò)程47-48。盡管針對(duì)這一問(wèn)題有一些研究，但沒(méi)有數(shù)據(jù)證明針對(duì)不同基因型乙型腦炎病毒的各種蚊種媒介的感受能力和傳播能力有重要變化。根據(jù)媒介飛行范圍內(nèi)病毒血癥分析，宿主對(duì)病毒的生態(tài)學(xué)也起到重要的作用，最終，我們可以得到乙型腦炎病毒的傳播循環(huán)類(lèi)型：一種是與鳥(niǎo)相關(guān)的野生循環(huán)，一種是和豬有關(guān)的農(nóng)村馴養(yǎng)循環(huán)。1.4.1與鳥(niǎo)相關(guān)的野生循環(huán)雖然在野外多種動(dòng)物（蝙蝠，鳥(niǎo)類(lèi)，嚙齒動(dòng)物，蛇，野豬）可能感染乙型腦炎病毒，一些哺乳動(dòng)物和鳥(niǎo)類(lèi)有較高的血清陽(yáng)性率，但他們都是終末宿主而且無(wú)法感染蚊子。但是，超過(guò)90種鳥(niǎo)類(lèi)是已知的乙型腦炎病毒的放大和儲(chǔ)存宿主。其中，野生禽，特別是鷺科家族的白鷺和蒼鷺極易受到乙型腦炎病毒感染。它們代表了主要有效的動(dòng)物宿主，具有高的病毒效價(jià)，而且它們是蚊子感染的主要來(lái)源。由于它們大部分廣泛分布而且能夠遷徙，因此鷺科物種被懷疑是病毒的來(lái)源。野生動(dòng)物物種被認(rèn)為是替代乙腦病毒循環(huán)的一部分：在新加坡野豬被懷疑是散發(fā)的人類(lèi)JE病例來(lái)源，在日本野生哺乳動(dòng)物（浣熊，野豬，貉）和澳大利亞飛狐檢測(cè)到乙腦抗體反應(yīng)呈陽(yáng)性49-51。在中國(guó)，乙腦病毒從兩個(gè)蝙蝠中分離到。在野外循環(huán)周期中，乙腦媒介傳播模式更可能與給定的環(huán)境有關(guān)。在這個(gè)周期的附近人類(lèi)有可能被意外感染53。1.4.2農(nóng)村圈養(yǎng)豬的生活周期在農(nóng)村，牛，雞，狗，鴨，羊，馬，豬的生活周期中都有可能感染乙腦病毒，但只有其中少數(shù)能使病毒有效擴(kuò)增。豬作為主要的病毒擴(kuò)增宿主。其他一些圈養(yǎng)的哺乳動(dòng)物（牛，狗，山羊）也跟豬一樣顯示了高血清陽(yáng)性率。然而，病毒在豬的體內(nèi)具有快速?gòu)?fù)制的能力，從而，豬具有最高的病毒血癥54。由于在東亞和東南亞集約化生豬養(yǎng)殖，豬是圈養(yǎng)周期的主要組成部分。特別是，這幾十年在許多國(guó)家（中國(guó)，緬甸，泰國(guó)，越南）生豬養(yǎng)殖已廣泛發(fā)展起來(lái)，產(chǎn)業(yè)化提高了乙腦病毒在存欄生豬體內(nèi)的擴(kuò)增的效率，從而促成提高乙腦病毒傳播的風(fēng)險(xiǎn)。因此，人類(lèi)和牲畜之間的高接近成為人群感染的主要的危險(xiǎn)因素55。圈養(yǎng)宿主和病原體之間的相互作用取決于幾個(gè)因素56，比如，宿主基因，生理?xiàng)l件，農(nóng)業(yè)等等。首先，對(duì)于許多疾病，牲畜的抵抗力和耐受力有遺傳的因素，包括品種的遺傳性狀。而宿主對(duì)感染的抵抗力限制了病原體在群體中的傳播和維持，耐受力反而不限制病毒傳播。用外來(lái)物種（大白，長(zhǎng)白，杜洛克）代替本國(guó)物種有可能改變家養(yǎng)豬對(duì)日本乙型腦炎的易感性57。然而，還缺乏證據(jù)說(shuō)明本土豬和引進(jìn)豬對(duì)乙型腦炎增殖作用的能力是否有差別。其次，不同的養(yǎng)殖場(chǎng)之間的生豬易感性取決于生理?xiàng)l件和農(nóng)業(yè)要素。第三，農(nóng)場(chǎng)里面循環(huán)淘汰豬的強(qiáng)度由農(nóng)場(chǎng)所飼養(yǎng)量，屠宰它們的年齡，繁殖率和接種工作決定。乙腦病毒在圈養(yǎng)宿主體內(nèi)的流行病學(xué)受多因素影響的復(fù)雜的模式，這種模式有待研究58。蚊子存在于野生傳輸周期也大大影響其在農(nóng)村生活周期59。雖然大多數(shù)蚊種通常食用鳥(niǎo)，牛，和豬血，然而巧合的是這似乎也是由于蚊子經(jīng)常以豬場(chǎng)的廢水處作為繁殖的場(chǎng)所60。因?yàn)槲米语@示出自然攜帶乙腦病毒的能力，也顯示出傳播病毒的能力。庫(kù)蚊是另一個(gè)有潛在傳播日本乙腦病毒的能力的媒介61。它代表了感染人類(lèi)的重要潛在來(lái)源，它在繼城市化和人類(lèi)擴(kuò)張之前未出現(xiàn)，而在一些城市家庭與人口密集和飼養(yǎng)豬的地方數(shù)量劇增。1.5 影響JEV流行病學(xué)主要因素1.5.1環(huán)境因素 蟲(chóng)媒和人畜共患疾病的（再）出現(xiàn)，以及疾病變化的風(fēng)險(xiǎn)和發(fā)病率的強(qiáng)度受環(huán)境因素的推動(dòng)。其中最相關(guān)的因素是氣候，土地覆蓋率和土地使用情況，人的活動(dòng)和對(duì)地球表面的生物物理屬性都有影響62。然而，這些變化出現(xiàn)在許多不同的地理范圍。長(zhǎng)期以來(lái)，乙腦流行病學(xué)調(diào)查在全球范圍討論主要針對(duì)氣候變化（如降雨和溫度），因?yàn)樗鼈儑?yán)重影響傳播病毒的載體的密度。最近，米勒等人確定雨季中有利于庫(kù)蚊的最佳的溫度范圍63。他們還發(fā)現(xiàn)，大部分乙腦病例發(fā)生在攜帶它們的媒介密度高的地方，同時(shí)他們還強(qiáng)調(diào)氣候變化，媒介生態(tài)學(xué)和人類(lèi)健康的聯(lián)系。此外，溫度也許會(huì)影響媒介的基因型從而影響攜帶病毒的能力，如西尼羅河病毒64。 在以前的研究中，各個(gè)大洲是根據(jù)他們的人類(lèi)起源，生物，地理和物理因素，氣候條件，生物群落和土地使用來(lái)劃分的。對(duì)乙腦病毒基因型的地區(qū)歷史進(jìn)行了分析（即乙腦病毒的分離數(shù)和各基因型的比例）。然后，發(fā)現(xiàn)乙腦傳播比較密集的兩個(gè)區(qū)域：首先是古北生物地理的區(qū)域（包括俄羅斯東部，日本，韓國(guó)和中國(guó)北方),還有就是種植了許多水稻的熱帶地區(qū)包括印度支那半島（柬埔寨，老撾，緬甸，泰國(guó)和越南），中國(guó)南方，臺(tái)灣。 事實(shí)上，土地覆蓋和土地利用變化已經(jīng)帶動(dòng)日本乙型腦炎發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。在亞洲，自上世紀(jì)60年代初種植水田面積不斷上升65。稻田、養(yǎng)殖場(chǎng)地也吸引了不少涉水鳥(niǎo)類(lèi)覓食和休息，養(yǎng)殖場(chǎng)加強(qiáng)流蚊子的繁殖和擴(kuò)大了涉水鳥(niǎo)類(lèi)種群。因此，在一些水稻灌溉廣泛的農(nóng)業(yè)地區(qū)，乙腦病毒傳播可能變得不那么依賴(lài)于降雨。 同樣，由于自1960年以來(lái)生豬的頭份有所增加，工業(yè)化的養(yǎng)豬場(chǎng)已經(jīng)為蚊子提供了一個(gè)持續(xù)增加的，有潛力的“餐源地”66。 此外，更精細(xì)的尺度空間分析，有助于更好地了解環(huán)境結(jié)構(gòu)如何影響乙腦流行病學(xué)。 一旦乙腦被引進(jìn)，其生態(tài)可持續(xù)性的確依賴(lài)于其易感宿主群體的生長(zhǎng)，并通過(guò)載體向宿主傳播。然后，偶然感染到人類(lèi)的危險(xiǎn)性取決于周?chē)沫h(huán)境中疾病傳播的可能性。要把疾病傳染給人類(lèi)需要67：1、攜帶病毒的蚊子作為媒介；2、能使病毒有效儲(chǔ)存并繁殖擴(kuò)增的宿主；3、在攜帶病毒的媒介和病毒儲(chǔ)存宿主之間有免疫力低下的人群。在這個(gè)過(guò)程中，三大環(huán)境要素分別是是水田，養(yǎng)豬場(chǎng)和人類(lèi)居住地。周?chē)h(huán)境的排布是決定媒介到底是靠近還是遠(yuǎn)離人類(lèi)的重要因素68。在給定的環(huán)境中，這種生物之間的接觸很可能有力地影響著乙型腦炎傳播的力度。 1.5.1非環(huán)境因素 疫苗接種是減少乙腦在人體中的發(fā)病率的最有效方式，但其對(duì)JEV傳播沒(méi)有影響。家畜，特別是豬，接種減少了病毒的擴(kuò)增，降低蚊子感染的比率，隨后也降低了對(duì)人類(lèi)感染的危險(xiǎn)69。此外，對(duì)豬的監(jiān)測(cè)可以預(yù)測(cè)日本乙型腦炎在附近人口爆發(fā)的可能性。其他因素也強(qiáng)烈地影響著日本乙型腦炎病毒的傳播，無(wú)論是幼小或感染動(dòng)物的運(yùn)動(dòng)，如飛翔的脊椎動(dòng)物的遷移、家畜的貿(mào)易和運(yùn)輸。這些運(yùn)動(dòng)使人類(lèi)暴露于乙腦病毒之中，因此需要衛(wèi)生系統(tǒng)的特別關(guān)注。 在東南亞，活畜交易發(fā)生在農(nóng)場(chǎng)之間，在當(dāng)?shù)氐氖袌?chǎng)，更重要的是在印度支那半島和中國(guó)之間，同時(shí)還有香港和新加坡70。比如，有病毒血癥的鳥(niǎo)類(lèi)，可能是將乙腦病毒傳播到印度，臺(tái)灣，巴布亞新幾內(nèi)亞。候鳥(niǎo)有可能是日本乙型腦炎病毒的傳播者。然而，主要的水禽活動(dòng)傳播乙腦病毒的模式還鮮為人知。 此外，乙腦可通過(guò)風(fēng)吹分散感染的蚊子來(lái)傳播，這被認(rèn)為是乙腦病毒從巴布亞新幾內(nèi)亞傳播到澳大利亞北部，從中國(guó)傳播到日本的途徑71。此外，也沒(méi)有證據(jù)表明，乙腦需要一個(gè)從鳥(niǎo)生長(zhǎng)周期傳播到圈養(yǎng)豬生長(zhǎng)周期適應(yīng)的過(guò)程。如果野生和圈養(yǎng)宿主同時(shí)在有帶毒的媒介的地方密切接觸的話(huà)，乙腦病毒是很容易從一個(gè)宿主傳播到另一個(gè)宿主。1.6發(fā)病機(jī)制感染的蚊子叮咬后，病毒在進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)前，病毒在外周擴(kuò)增產(chǎn)生的瞬態(tài)血癥。周邊擴(kuò)增的部位先是真皮組織，然后淋巴結(jié)。JEV跨越血腦屏障的機(jī)制目前不清楚。在實(shí)驗(yàn)利用倉(cāng)鼠模型的研究，圣路易斯腦炎通過(guò)嗅覺(jué)進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)路線(xiàn)。鼻內(nèi)噴霧也是猴子感染乙腦的有效途徑。人類(lèi)的免疫組織化學(xué)染色尸檢標(biāo)本表明大腦的感染提示有出血點(diǎn)。在實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭?，黃病毒可以在內(nèi)皮復(fù)制，并可能穿越血-腦屏障72。在JEV中，被動(dòng)轉(zhuǎn)移跨過(guò)內(nèi)皮細(xì)胞是其有可能的機(jī)制。其他的因素可能導(dǎo)致破壞血液-腦屏障，導(dǎo)致如腦膜炎，頭部外傷和腦囊蟲(chóng)病共感染可能增加JEV的嗜神經(jīng)的風(fēng)險(xiǎn)。許多研究報(bào)道嚴(yán)重的日本腦炎與過(guò)高的數(shù)量的囊蟲(chóng)共存的現(xiàn)象73。電子顯微鏡研究感染的小鼠的腦發(fā)現(xiàn)病毒的復(fù)制是在粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體。JEV侵入神經(jīng)元后形成血管周?chē)涮?，浸?rùn)炎癥細(xì)胞和感染細(xì)胞。死亡病例腦部血管周?chē)淇赥細(xì)胞針對(duì)CD8+和CD8-單克隆抗體74。這兩種類(lèi)型的細(xì)胞被發(fā)現(xiàn)在中樞神經(jīng)系統(tǒng)急性感染病例。在急性死亡病例，炎癥的病理組織學(xué)證據(jù)可能沒(méi)有，但免疫組織病理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)病毒抗原存在于形態(tài)正常的神經(jīng)元。這也許可以解釋在一些嚴(yán)重JE患者發(fā)現(xiàn)正常的CSF 75。1.7免疫JEV感染后發(fā)生體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答。原發(fā)感染（第一次感染JEV），數(shù)天內(nèi)在血清和腦脊液產(chǎn)生快速和有效的IgM反應(yīng)。到了第七天，所有的患者IgM抗體滴度都得到提高。通常該病毒不能分離到；然而IgM應(yīng)答失敗導(dǎo)致病毒分離和致命的結(jié)果76。在病毒穿過(guò)血腦屏障前，乙腦病毒抗體在病毒血癥期通過(guò)限制病毒復(fù)制保護(hù)宿主。從其他黃病毒感染證據(jù)表明，乙腦抗體降低損害通過(guò)中和細(xì)胞外病毒和通過(guò)抗體依賴(lài)的細(xì)胞毒性作用裂解感染的細(xì)胞。在生存患者，免疫球蛋白類(lèi)發(fā)生轉(zhuǎn)化; IgM抗體下降，IgG抗體開(kāi)始上升，30天大部分患者血清中IgG能對(duì)抗乙腦病毒。無(wú)癥狀感染乙腦病毒也有血清中IgM的升高，但腦脊液并沒(méi)有升高。在患者繼發(fā)感染，或已經(jīng)感染了不同黃病毒，有一個(gè)共同的黃病毒組抗原回憶應(yīng)答。此抗體活化的次級(jí)模式的特點(diǎn)是一個(gè)IgG的早期崛起與后續(xù)IgM抗體的緩慢上升77。入侵中樞神經(jīng)系統(tǒng)之前，細(xì)胞免疫應(yīng)答通過(guò)限制病毒復(fù)制預(yù)防疾病。無(wú)胸腺裸鼠增加了JEV易感性。免疫接種弱毒的小鼠脾細(xì)胞能轉(zhuǎn)移免疫性感染。通過(guò)血液輸入JEV，JEV復(fù)制能抑制的動(dòng)物的大腦。有報(bào)道說(shuō)，艾滋病患者較容易形成路易斯腦炎風(fēng)險(xiǎn)，可能是細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞可能在清除和控制乙腦病毒中起到重要的作用，這種現(xiàn)象已經(jīng)在流感，HIV和登革病毒感染見(jiàn)到。在7天恢復(fù)期JE患者和JE接種，T細(xì)胞應(yīng)答均出現(xiàn)應(yīng)答。 T細(xì)胞的增殖，包括CD4+和乙腦病毒特異性CD8 +T淋巴細(xì)胞。乙腦病毒的特異性和黃病毒交叉反應(yīng)性CD4 + T淋巴細(xì)胞識(shí)別E蛋白。神經(jīng)元損傷和JE宿主防御已被歸因于大量的促炎細(xì)胞因子和趨化因子的數(shù)目78。在乙腦感染，小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞的活化是一種常見(jiàn)的人類(lèi)和動(dòng)物研究的組織學(xué)特征?；罨男∧z質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子吸引炎性細(xì)胞。趨化因子在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用。細(xì)胞因子如IFN /，IFN-?和TNF-激活抗病毒途徑的之后，他們結(jié)合到感染細(xì)胞的表面病毒受體。在JE患者血漿和腦脊液中檢測(cè)到內(nèi)源性干擾素（INF a）。其它細(xì)胞因子，如IL-1的/，IL-2，IL-6，IL-12，IL-13和IL-18被認(rèn)為是抗病毒反應(yīng)。在另一方面，它也已表明，細(xì)胞因子在發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)反應(yīng)和炎癥反應(yīng)的同時(shí)，但某些細(xì)胞因子如IL-1和TNF-還可以有直接的細(xì)胞毒作用。在JE研究中發(fā)現(xiàn)，死亡與存活病例中腦脊液腫瘤壞死因子，IL-6和IL-8較高。此外，在病毒中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染動(dòng)物模型已證實(shí)，Th2應(yīng)答其特征是IL-4生產(chǎn)似乎具有保護(hù)作用，而Th1細(xì)胞其特征在于，IFN-?反應(yīng)有利于激活細(xì)胞毒性T細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，從而產(chǎn)生促炎細(xì)胞因子和活性氧和氮中間體。該機(jī)制該規(guī)范的表達(dá)，不同的細(xì)胞因子的釋放是密切相關(guān)的。腫瘤壞死因子誘導(dǎo)IL-6和TGF的表達(dá)。同樣地，IL-1可誘導(dǎo)的IL-6，腫瘤壞死因子和TGF表達(dá)。而TGF抑制腫瘤壞死因子的生產(chǎn)。2 總結(jié)與展望乙腦依然是危害人類(lèi)健康的蟲(chóng)媒病，特別是南亞和東南亞的一些國(guó)家和地區(qū)。目前缺乏有效的治療，只能進(jìn)行支持療法和對(duì)癥治療。因此必須采取預(yù)防措施控制蚊子數(shù)量，改善環(huán)境。加強(qiáng)科技和衛(wèi)生事業(yè)的發(fā)展，同時(shí)尋找積極有效的治療措施和免疫策略來(lái)預(yù)防此類(lèi)疾病。 第一章乙腦基因I型的分離和鑒定1 材料與方法1.1 材料1.1.1 蚊蟲(chóng)樣品采集時(shí)間和地點(diǎn)2013年夏季7-8月份進(jìn)行蚊蟲(chóng)標(biāo)本的采集，每天采集時(shí)間段約為晚間20:00-次日6:00,時(shí)間跨度12小時(shí)左右，基本覆蓋夜間蚊蟲(chóng)活動(dòng)高峰。采集地點(diǎn)為云南省景洪市東風(fēng)農(nóng)場(chǎng)。1.1.2 采集工具誘蚊燈購(gòu)自武漢市吉星環(huán)?？萍脊?；交通工具(車(chē)輛)、雨衣、雨鞋；蚊蟲(chóng)分類(lèi)用鑷子、放大鏡、記號(hào)筆、記錄本；凍存管、醫(yī)用膠布。1.1.3 蚊蟲(chóng)標(biāo)本的處理采集地點(diǎn)多選擇選擇房屋、牛羊圈舍周?chē)约柏i養(yǎng)殖場(chǎng)等蚊蟲(chóng)聚集區(qū)域。蚊蟲(chóng)標(biāo)本的處理收集網(wǎng)置于-20冰箱中冷凍30min，將蚊蟲(chóng)冷凍死亡后，取出收集。1.1.4 蚊蟲(chóng)標(biāo)本的分類(lèi)和運(yùn)輸蚊蟲(chóng)倒在白瓷盤(pán)中開(kāi)始分類(lèi),蚊蟲(chóng)計(jì)數(shù)。按蚊種的不同分別裝入凍存管,每只管內(nèi)裝1000只，并將管子外進(jìn)行編號(hào)，編號(hào)1-13、15為三帶喙庫(kù)蚊，14號(hào)為雜蚊和中華按蚊子；蚊蟲(chóng)裝入凍存管后立即放入-20冰箱內(nèi),收集完成后放入-80中保存。1.1.5 病毒分離用細(xì)胞C636細(xì)胞、倉(cāng)鼠腎細(xì)胞(BHK-21、DH5感受態(tài)由本實(shí)驗(yàn)室保存提供。1.2 方法1.2.1 引物設(shè)計(jì)根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道的云南省設(shè)計(jì)了乙腦引物。如下表所示：引物名稱(chēng)Primer names引物序列Primers Sequences產(chǎn)物大小/bpProduction length位置GeneJEV NS1DJEV NS2U5-CAAGTTTACAGCATTAGCCCC-3 5- ATGCCACTTCCACACCTCATC -3429bpNS1乙腦病毒PCR鑒定的反應(yīng)體系：模板5l，2Mix Buffer 12.5l，H2O 4.5l，上游、下游引物各1l，總體系25l。反應(yīng)條件：94變性30s，60退火30s，72 30s，共35個(gè)循環(huán)，最后72延伸10min。1%瓊脂糖凝膠跑電泳。1.2.2 蚊蟲(chóng)樣品研磨將15份蚊樣品編號(hào)為1-15。加800uL 雙無(wú)DMEM到-80冷凍的研缽中研磨，研磨成勻漿。將研磨液吸入EP管中，412000r/min離心10min。吸取上清液放-80冰箱保存。1.2.3 單層細(xì)胞的制備取長(zhǎng)滿(mǎn)單層BHK細(xì)胞，棄去原液，加入1mL無(wú)血清DMEM洗滌棄去。加1mL胰蛋白酶消化細(xì)胞，置37恒溫箱內(nèi)1分鐘。然后加入細(xì)胞液重懸細(xì)胞。細(xì)胞計(jì)數(shù)后，以6105個(gè)/mL傳于新的6孔細(xì)胞培養(yǎng)板。每孔補(bǔ)足細(xì)胞生長(zhǎng)液至2mL，置于37 5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。取長(zhǎng)滿(mǎn)單層C636細(xì)胞棄去原液，加入1mL無(wú)血清1640洗滌棄去。加1mL胰蛋白酶消化細(xì)胞，置37恒溫箱內(nèi)1分鐘。然后加入細(xì)胞液重懸細(xì)胞。細(xì)胞計(jì)數(shù)后，以6105個(gè)/mL傳于新的6孔細(xì)胞培養(yǎng)板。每孔補(bǔ)足細(xì)胞生長(zhǎng)液至2mL，置于37 CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。1.2.4 病毒分離樣品研磨液上清100uL加入900uL培養(yǎng)基，接種于生長(zhǎng)旺盛的BHK-21和C636單層細(xì)胞，吸附2h后加入2%維持液，置于5%CO2 37培養(yǎng)，每隔12小時(shí)觀察一次，一般2-3天出現(xiàn)細(xì)胞病變。1.2.5 病毒RNA提取 樣品研磨液上清200uL進(jìn)行總RNA提取，按上海生工總RNA試劑盒說(shuō)明書(shū)操作步驟進(jìn)行。操作過(guò)程：加入500L TRIzol裂解液，顛倒混勻放置10min；加入200L氯仿，劇烈振蕩30sec，放置3min；412000r/min 10min；吸取上層水相于干凈離心管中，加入250L無(wú)水乙醇，混勻后放入吸附柱中，靜置3min，12000r/min 3min；棄濾液，加500L RPE Solution，靜置2min，10000r/min離心30sec，棄廢液，重復(fù)一次后將吸附柱放入收集管，10000r/min離心2min；加入30L DEPC-treated ddH2O 3 min，12000r/min離心2min，將得到RNA反轉(zhuǎn)錄。反轉(zhuǎn)錄步驟：取13uL RNA依次加入1L DEPC ddH2O和1uL Primer(9mers)后放入 75 水浴5min，再迅速冰浴采用8-10min；反轉(zhuǎn)錄體系5.5L DEPC ddH2O、6uL 5RNA PCR Buffer、1.5uL dNTP (10mmom/L)、RNase和M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶各1uL，42水浴2h，75滅活15min，即獲得cDNA，-20保存。1.2.6 病毒的RT-PCR鑒定利用得到cDNA為模板，進(jìn)行引物的PCR鑒定。1.2.7 目的基因的克隆樣品RT-PCR鑒定為陽(yáng)性樣品的經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后，回收目的處片段并與pMD18-T載體連接。16 12h；轉(zhuǎn)化DH5感受態(tài)冰浴30min，42熱激90s；冰浴8-10min，加入800L無(wú)抗性L(fǎng)B； 37搖床，240r /min，60 min；6000r/min離心1min，棄上清后，50L菌液吹打均勻后均勻涂布于含Amp抗性的LB平皿中；3712后挑取單個(gè)菌落。1.2.8 重組質(zhì)粒的小量提取挑取單個(gè)轉(zhuǎn)化菌落接種于含氨芐抗性L(fǎng)B液體培養(yǎng)基中，37振搖(220rpm)培養(yǎng)12h后。提取質(zhì)粒按照質(zhì)粒DNA小量試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。過(guò)程如下步驟：收集3次菌液于Ep管中12000r/min離心1min，棄上清加250L Buffer S1溶液，懸浮均勻；加250L Buffer S2溶液，溫和的上下顛倒46次；立即加350L Buffer S3溶液，上下顛倒68次，12000r/min 10min。轉(zhuǎn)移上清到吸附柱12000r/min 1min；加500L Buffer W1溶液12000r/min 1min；棄濾液加700L Buffer W2溶液12000r/min離心1min，重復(fù)一次；空離12000r/min離心2min，最后加50L Eluent 洗脫液，1min，12000r/min 1min，-20保存。1.2.9陽(yáng)性質(zhì)粒的PCR鑒定和測(cè)序陽(yáng)性質(zhì)粒DNA進(jìn)行PCR鑒定。取10uL產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳。將經(jīng)PCR鑒定陽(yáng)性質(zhì)粒進(jìn)行序列測(cè)定，由上海生物工程公司完成。 2 結(jié)果 2.1 細(xì)胞病變?cè)趩螌覤HK-21細(xì)胞接種蚊懸液樣品的上清液2天后，細(xì)胞開(kāi)始變圓、脫落，見(jiàn)(圖1、圖2)。在單層C6/36細(xì)胞接種蚊懸液樣品的上清液2天后，細(xì)胞開(kāi)始變圓、脫落，見(jiàn)(圖3、圖4)。2.2 蚊蟲(chóng)研磨樣品RT- PCR鑒定結(jié)果研磨后提取的RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA為模板，進(jìn)行乙腦的RT- PCR鑒定。經(jīng)1瓊脂糖凝電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物，部分?jǐn)U增產(chǎn)物電泳結(jié)果見(jiàn)(圖5)。 2.3 質(zhì)粒的PCR鑒定小量提取質(zhì)粒后乙腦引物鑒定，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，可見(jiàn)大小為460bp左右的片段部分結(jié)果見(jiàn)(圖6)，與預(yù)期結(jié)果相符。2.4 目的基因的測(cè)序結(jié)果將RT-PCR產(chǎn)物克隆到pMD18-T載體中進(jìn)行序列測(cè)定：擴(kuò)增的目的基因全長(zhǎng)463bp經(jīng)分子生物學(xué)鑒定，根據(jù)Chen等建立的乙腦病毒株C/PrM基因核苷酸序列基因分型法，確定本次實(shí)驗(yàn)得到的乙腦病毒為基因I型測(cè)序結(jié)果：ATGGTCGCTGCACACGGACCAGGCATTCCAAASBCTTGCGACAATCAAGAAGTCTACGTGCAGTATGGTCGCTGCACACGGACCAGGCATTCCAAAURYCGAAGCAGAAGATCCGTTTCAGTCCAAACGCATGGGGAAAGCTCACTAGTGAACAAAAAASBCTCGAAGCAGAAGATCCGTTTCAGTCCAAACGCATGGGGAAAGCTCACTAGTGAACAAAAAAURYGGGGCTTGGCTGGATTCGACGAAGGCCACGCGATACCTCATGAAAACGGAGAACTGGATCSBCTGAGGCTTGGCTGGATTCGACGAAGGCCACGCGATACCTCATGAAAACGGAGAACTGGATCURYATAAGGAACCCTGGTTATGCTTTCCTGGCGGCGGCACTTGGATGGATGCTTGGCAGCAACSBCTATAAGGAACCCTGGTTATGCTTTCCTGGCGGCGGCACTTGGATGGA3 小結(jié)成功擴(kuò)增出乙腦片段，并構(gòu)建了克隆測(cè)序質(zhì)粒，經(jīng)測(cè)序結(jié)果正確，為后期乙腦基因I型的研究奠定了基礎(chǔ)。 第二章蟲(chóng)媒病毒的分子流行病學(xué)調(diào)查1 材料與方法1.1 材料1.1.1 主要試劑經(jīng)典總RNA提取試劑盒購(gòu)自上海生工有限公司；DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液、1640細(xì)胞培養(yǎng)液購(gòu)自HyClone；血清購(gòu)自長(zhǎng)春博源公司；DL2000 Marker購(gòu)自TaKaRa公司；其它試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。1.1.2 主要儀器低溫臺(tái)式離心機(jī)購(gòu)自Eppendoff公司； -40低溫冰箱，購(gòu)自海爾公司；PCR擴(kuò)增儀購(gòu)自PERKIN ELMER公司；CO2培養(yǎng)箱購(gòu)自SANYO公司。1.2 方法1.2.1 引物設(shè)計(jì)根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道的云南省曾經(jīng)報(bào)導(dǎo)的蟲(chóng)媒病毒，利用DNAstar軟件分別設(shè)計(jì)、基孔肯雅、辛德畢斯和蓋塔引物，由上海生工合成。如下表所示：GeneSize of productsSequenceDescription蓋他病毒1004 bp5-CGTGACACCAGAGGATGCCCAG-3Forward5-GCCTGATGCCTCCTCCTTCTTG-3Reverse基孔肯亞354 bp5-GCCCACACTGTGAGCGCGTAC-3 Forward5-TTCGGACTTCTCCACATGTGC-3Reverse辛德畢斯353bp5-GCCCCTTCCCCGCCCCCACAT-3Forward5-GCCTATCACTTCGCCTGCTTC-3ReversePCR的反應(yīng)體系：模板5l，2Mix Buffer 12.5l， H2O 4.5 l，上游、下游引物各1l，總體系25l，。蓋他病毒反應(yīng)條件：94變性30s，60退火30s，72延伸30s，共35個(gè)循環(huán)，最后72延伸10min。1%瓊脂糖凝膠電泳。基孔肯亞反應(yīng)條件：反應(yīng)條件：94變性30s，55退火30s，72延伸30s，共35個(gè)循環(huán)，最后72延伸10min。1%瓊脂糖凝膠電泳。 辛德畢斯反應(yīng)條件：94變性30s，58退火30s，72延伸30s，35個(gè)循環(huán)，最后72延伸10min。1%瓊脂糖凝膠電泳。1.2.2 目的基因的克隆樣品RT-PCR鑒定為陽(yáng)性樣品的經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后，回收目的處片段并與pMD18-T載體連接。16孵育12h，轉(zhuǎn)化DH5感受態(tài)；冰浴30min，42熱激90s；冰浴8-10min，加入800L無(wú)抗性L(fǎng)B； 37搖床，240r /min，60 min；6000r/min離心1min，棄上清后，5 0L菌液吹打均勻后均勻涂布于含Amp抗性的LB平皿中；3712后挑取單個(gè)菌落。1.2.4 重組質(zhì)粒的小量提取樣品RT-PCR鑒定為陽(yáng)性樣品的經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后，回收目的處片段并與pMD18-T載體連接。16孵育過(guò)夜，轉(zhuǎn)化DH5感受態(tài)；冰浴30min，42熱激90s；冰浴8-10min，加入800L無(wú)抗性L(fǎng)B； 37搖床，240r /min，60 min；6000r/min離心1min，棄上清后，5 0L菌液吹打均勻后均勻涂布于含Amp抗性的LB平皿中；3712后挑取單個(gè)菌落。1.2.5 疑似陽(yáng)性測(cè)序 疑似陽(yáng)性質(zhì)粒進(jìn)行序列測(cè)定，由上海生物工程公司完成。 2 結(jié)果2.1 蚊蟲(chóng)研磨樣品RT- PCR鑒定結(jié)果研磨后提取的RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA為模板，進(jìn)行RT- PCR鑒定。經(jīng)1瓊脂糖凝電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物，蓋塔病毒擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果見(jiàn)(圖1)，辛德畢斯病毒擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果見(jiàn)(圖2)，基孔肯雅病毒擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果見(jiàn)(圖3)。2.2 疑似陽(yáng)性的測(cè)序結(jié)果將RT-PCR產(chǎn)物克隆到pMD18-T載體中進(jìn)行序列測(cè)定，發(fā)現(xiàn)本次實(shí)驗(yàn)并未發(fā)現(xiàn)相應(yīng)的蟲(chóng)媒病毒。3 小結(jié)本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)蚊子樣品進(jìn)行蟲(chóng)媒病毒的分離，并未獲得預(yù)期的結(jié)果，可能與采樣主要為三帶喙庫(kù)蚊庫(kù)蚊為主，蟲(chóng)媒病毒在較小地域分布不均有關(guān)，為以后探索蟲(chóng)媒病毒的分離奠定基礎(chǔ)。 第三章 JEV 基因I型熒光定量PCR方法的建立1 材料與方法1.1 材料1.1.1 病毒毒株 實(shí)驗(yàn)室分離到乙腦毒株，PRRSV等毒株為本實(shí)驗(yàn)室保存。1.1.2 主要試劑經(jīng)典總RNA提取試劑盒，購(gòu)自上海生工生物工有限公司；DNA小量凝膠回收試劑盒為Axygen；T4 DNA連接酶購(gòu)自TaKaRa；反轉(zhuǎn)錄酶M-MLV及RNA 酶抑制劑均購(gòu)自普洛麥格公司；其他化學(xué)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。1.1.3 主要儀器設(shè)備低溫臺(tái)式離心機(jī)，購(gòu)于Eppendoff公司； ABI 7500型熒光定量PCR儀購(gòu)自ABI公司；-80超低溫冰箱，SANYO公司產(chǎn)品；NANODROP2000分光光度計(jì)；TanonGIS-2008凝膠成像系統(tǒng)購(gòu)自上海天能公司； SYBR Green Real-time PCR Master Mix購(gòu)自日本東洋紡。1.2 方法1.2.1 引物的設(shè)計(jì)與合成根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室在云南地區(qū)分離的JEV的核苷酸序列，設(shè)計(jì)了針對(duì)E基因的Real-time PCR引物JEV YG1/JEV YG2(表1)。以上引物均由大連寶生物工程有限公司合成。引物名稱(chēng)Primer names引物序列Primers Sequences產(chǎn)物大小/bpProduction length位置GeneJEVYG1JEVYG25-GGCAAACGACAAACCAACATT-3 5-ATCAGCTCGCTTCTCGTTGTG-3160bpE1.2.2 乙腦RNA的提取提取乙腦病毒提取RNA按照上海生工總RNA提取試劑盒。用于標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒的構(gòu)建和熒光定量PCR過(guò)程中的特異性檢測(cè)。1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒的構(gòu)建以提取的乙腦病毒總RNA反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板，以JEV E1/JEV E2為引物擴(kuò)增乙腦病毒基因片段，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后，回收處片段并與pMD18-T載體連接，16連接12h。轉(zhuǎn)化DH5涂布于帶有Amp抗生素(50ug/mL)的LB平板， 37培養(yǎng)12h。挑取單個(gè)轉(zhuǎn)化菌落接種于含Amp LB液體培養(yǎng)基試管中，3712h。質(zhì)粒的小量提取。測(cè)OD260nm/OD280nm 1.86?？截悢?shù)計(jì)算公式：拷貝數(shù)(copies/mL)=質(zhì)粒濃度(g/mL)阿弗加德羅常數(shù)/質(zhì)粒分子質(zhì)量；質(zhì)粒分子質(zhì)量一個(gè)堿基對(duì)的平均分子質(zhì)量重組質(zhì)粒堿基數(shù)。1.2.4實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法的建立1.2.4.1最佳反應(yīng)條件的優(yōu)化 優(yōu)化PCR擴(kuò)增條件：退火溫度、延伸溫度、循環(huán)次數(shù)。在PCR擴(kuò)增過(guò)程中，通過(guò)反復(fù)試驗(yàn)確定PCR的最佳反應(yīng)條件95 30s ；60 30 s；40 Cycles。1.2.4.2標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的建立 將標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒10倍系列稀釋標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒7個(gè)梯度10-1 10-7 (2.61002.6106 copies/ul)。熒光定量完成后選取這些不同Ct值建立標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。1.2.4.3重復(fù)性檢驗(yàn) 在每次試驗(yàn)中對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品每個(gè)稀釋度都做3個(gè)重復(fù)孔，同時(shí)對(duì)樣品重復(fù)三次，根據(jù)同一批次組內(nèi)的差異性和不同批次組間的差異，判斷該方法的重復(fù)性和穩(wěn)定性。1.2.4.4 靈敏度檢測(cè) 標(biāo)準(zhǔn)品用10倍系列稀釋樣度10-1 10-10 (11001106 copies/ul)，同時(shí)設(shè)置陰性對(duì)照進(jìn)行Real-time PCR反應(yīng)，以檢測(cè)實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法能夠檢出最低病毒含量。 1.2.4.5 特異性檢測(cè) 在相同條件下對(duì)PRRSV、CSFV、SINV、PCV-2為模板進(jìn)行特異性的檢測(cè)，同時(shí)設(shè)置陰陽(yáng)性對(duì)照，根據(jù)擴(kuò)增曲線(xiàn)驗(yàn)證該方法的特異性。1.2.4.6 熔解曲線(xiàn) 以溫度為橫軸，以不同溫度下熒光值的變化速率為縱軸，建立熔解曲線(xiàn)。2 結(jié)果2.1 標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒pMD18-T-JEV-E的PCR的擴(kuò)增用JEV E1/JEV E2引物PCR擴(kuò)增，結(jié)果與預(yù)期大小相一致(E基因目的條帶為475bp，見(jiàn)圖1)。2.2 標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒和乙腦病毒核酸濃度、純度的測(cè)定經(jīng)測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒pMD18-T-JEV-E的濃度為477ug/mL，OD260nm/OD280nm1.86，標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒pMD18-T-JEV-E的拷貝數(shù)=1.041014 copies/mL；乙腦病毒核酸濃度為36.54ug/mL，乙腦病毒核酸拷貝數(shù)=5.35109 copies/mL。5uL模板中含有乙腦病毒核酸2.7107 copies。2.3 Real-time PCR的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)以10倍系列稀釋的7個(gè)梯度(2.61002.6106 copies/ul)的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒pMD18-T-JEV-E為模板進(jìn)行Real-time PCR反應(yīng)，選取至少5個(gè)Ct值和其標(biāo)準(zhǔn)品的拷貝數(shù)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。結(jié)果顯示，標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)Ct值和標(biāo)準(zhǔn)DNA濃度間呈現(xiàn)良好的線(xiàn)性關(guān)系(見(jiàn)圖16)。陰性對(duì)照沒(méi)有出現(xiàn)特異性的擴(kuò)增曲線(xiàn)。2.4 Real-time PCR的靈敏度分析 用10倍系列稀釋樣本核酸(2.71002.7106 copies/ul)，以該7個(gè)數(shù)量級(jí)梯度為模板進(jìn)行Real-time PCR反應(yīng)。結(jié)果顯示，當(dāng)樣品中含有2.7101 copies cDNA時(shí)，用建立的Real-time PCR方法檢測(cè)仍能產(chǎn)生很好的特異性擴(kuò)增。陰性對(duì)照沒(méi)有出現(xiàn)特異性擴(kuò)增。2.5 Real-time PCR的重復(fù)性分析 以10倍系列稀釋的7個(gè)梯度(2.61002.6106 copies/ul)的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒pMD18-T-JEV為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。結(jié)果表明，建立的Real-time PCR 在組間和組內(nèi)都具有良好的重復(fù)性(P0.05)，相關(guān)系數(shù)大于0.99。陰性對(duì)照沒(méi)有出現(xiàn)特異性擴(kuò)增。陽(yáng)性模板拷貝數(shù)同一批次3個(gè)重復(fù)的Ct值平均值標(biāo)準(zhǔn)差變異系數(shù)1232.610611.23711.16911.18811.1980.0350.3132.610514.24814.10014.13714.1610.0770.5432.610417.32717.24317.18917.2530.0690.4032.610320.406