細(xì)胞傳代培養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程.doc

細(xì)胞傳代培養(yǎng)（消化法）標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程一、原理 細(xì)胞在培養(yǎng)瓶長成致密單層后，已基本上飽和，為使細(xì)胞能繼續(xù)生長，同時(shí)也將細(xì)胞數(shù)量擴(kuò)大，就必須進(jìn)行傳代（再培養(yǎng)）。傳代培養(yǎng)也是一種將細(xì)胞種保存下去的方法。同時(shí)也是利用培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行各種實(shí)驗(yàn)的必經(jīng)過程。懸浮型細(xì)胞直接分瓶就可以，而貼壁細(xì)胞需經(jīng)消化后才能分瓶。二、材料和試劑1. 無菌磷酸生理緩沖液(PBS)2. 胰酶-EDTA溶液(0.05%胰酶-0.53mM EDTA-4Na): 以10ml分裝于15 ml無菌離心管中，保存于20，使用前放在37 水槽回溫。3. 新鮮培養(yǎng)基4. 無菌吸管/離心管/培養(yǎng)瓶 三、操作步驟1. 傳代前準(zhǔn)備（1）預(yù)熱培養(yǎng)用液：把已經(jīng)配制好的裝有培養(yǎng)液、PBS液和胰蛋白酶的瓶子放入37水浴鍋內(nèi)預(yù)熱。 （2）用75酒精擦拭經(jīng)過紫外線照射的超凈工作臺(tái)和雙手。（3）正確擺放使用的器械：保證足夠的操作空間，不僅便于操作而且可減少污染。 （4）點(diǎn)燃酒精燈：注意火焰不能太小。 （5）準(zhǔn)備好將要使用的消毒后的空培養(yǎng)瓶。 （6）取出預(yù)熱好的培養(yǎng)用液，用酒精棉球擦拭好后方能放入超凈臺(tái)內(nèi)。（7）從培養(yǎng)箱內(nèi)取出細(xì)胞：注意取出細(xì)胞時(shí)要旋緊瓶蓋，用酒精棉球擦拭顯微鏡的臺(tái)面，再在鏡下觀察細(xì)胞。（8）打開瓶口：將各瓶口一一打開，同時(shí)要在酒精燈上燒口消毒。2. 胰蛋白酶消化（1）加入消化液：小心吸出舊培養(yǎng)液，用PBS清洗（沖洗），加入適量消化液（胰蛋白酶液），注意消化液的量以蓋住細(xì)胞最好，最佳消化溫度是37。 （2）顯微鏡下觀察細(xì)胞：倒置顯微鏡下觀察消化細(xì)胞，若胞質(zhì)回縮，細(xì)胞之間不再連接成片，表明此時(shí)細(xì)胞消化適度。（3）吸棄消化液加入培養(yǎng)液：棄去胰蛋白酶液，注意更換吸管，加入新鮮的培養(yǎng)液。3. 吹打分散細(xì)胞 （1）吹打制懸：用滴管將已經(jīng)消化細(xì)胞吹打成細(xì)胞懸液。 （2）吸細(xì)胞懸液入離心管：將細(xì)胞懸液吸入10ml離心管中。 （3）平衡離心：平衡后將離心管放入臺(tái)式離心機(jī)中，以1000轉(zhuǎn)/分鐘離心6-8分鐘。 （4）棄上清液，加入新培養(yǎng)液：棄去上清液，加入2ml培養(yǎng)液，用滴管輕輕吹打細(xì)胞制成細(xì)胞懸液。4. 分裝稀釋細(xì)胞（1）顯微鏡下觀察細(xì)胞：倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞量，必要是計(jì)數(shù)。注意密度過小會(huì)影響傳代細(xì)胞的生長，傳代細(xì)胞的密度應(yīng)該不低于5105/ml。最后要做好標(biāo)記。（2）分裝：將細(xì)胞懸液吸出分裝至23個(gè)培養(yǎng)瓶中，加入適量培養(yǎng)基旋緊瓶蓋。 （3）繼續(xù)培養(yǎng)：用酒精棉球擦拭培養(yǎng)瓶，適當(dāng)旋松瓶蓋，放入CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。傳代細(xì)胞2小時(shí)后開始貼附在瓶壁上。5. 懸浮型細(xì)胞的傳代（1）吸出細(xì)胞培養(yǎng)液，放入離心管中，離心1000 rpm 5 分鐘。（2）吸掉上清液，加入適量之新鮮培養(yǎng)基，混和均勻后，依稀釋比例轉(zhuǎn)移至新的培養(yǎng)瓶中，以正常培養(yǎng)條件培養(yǎng)。注意事項(xiàng)：1.嚴(yán)格的無菌操作。 2.適度消化：消化的時(shí)間受消化液的種類、配制時(shí)間、加入培養(yǎng)瓶中的量等諸多因素的影響，消化過程中應(yīng)該注意培養(yǎng)細(xì)胞形態(tài)的變化，一旦胞質(zhì)回縮，連接變松散，或有成片浮起的跡象就要立即終止消化。附：EDTA（0.02乙二胺四乙酸二鈉）消化液配方：EDTA 0.20g，NaCl 8.00g， KCl 0.20g， KH2PO4 0.02g， 葡萄糖 2.00g，0.5酚紅4ml，加入蒸餾水定容至1000ml。10磅20min高壓滅菌，使用時(shí)調(diào)節(jié)PH值到7.4。注意EDTA不能被血清中和，使用后培養(yǎng)瓶要徹底清洗，否則再