多糖化學(xué)結(jié)構(gòu)鑒定方案總結(jié).doc

經(jīng)過分級(jí)純化的多糖在測(cè)定結(jié)構(gòu)前須檢查其純度及測(cè)定分子量。檢查純度最常用的判斷方法：（1）用G C 、HPLC 測(cè)定組成多糖的單糖的摩爾比是否恒定。用不同的柱型測(cè)定結(jié)果更為可靠。 （2）電泳只出現(xiàn)一條帶。如可用聚丙烯酰胺凝膠電泳、乙酸纖維素薄膜電泳及玻璃纖維紙電泳。對(duì)于中性多糖可采用高壓電泳，以硼酸鹽為緩沖液，可增大其遷移速度。（3）凝膠柱層析圖呈現(xiàn)對(duì)稱的單峰。若有“拖尾”現(xiàn)象，說明其均一性不夠好。陰離子交換層析純化用DEAE一纖維素52(2.6x100cm)柱層析,0.lmol/LNaCl洗脫,流速6ml/h,按2ml一管分部收集,苯酚一硫酸法逐管檢測(cè),繪制收集體積與糖含量之間的關(guān)系曲線。看是否有單一對(duì)稱峰。按照Ye等報(bào)道,采用DEAE一52一纖維素交換柱層析法(2.6x30cm)對(duì)鮑氏層孔菌菌絲體粗多糖進(jìn)行初步分離。DEAE一纖維素凝膠預(yù)處理:稱取DEAE一52一纖維素凝膠干粉,加入約10倍體積質(zhì)量比(ml/g)的0.5mol/LNa0H溶液浸泡30分鐘,倒出上清液,用大量去離子水反復(fù)浸洗至pH值近中性;再用相同體積的0.5mol/LHCI溶液浸泡30分鐘,倒出上清液,用大量去離子水反復(fù)浸洗至pH值近中性;最后用相同體積的0.5mol/lNaOH溶液再浸泡30分鐘,用大量去離子水反復(fù)浸洗至pH值中性。處理完畢后,進(jìn)行濕法裝柱,用去離子水0.5mol/LNaCl溶液,去離子水依次分別平衡(流速1.0ml/min)2一3個(gè)柱體積備用.糖樣100mg溶于5ml的去離子水中,離心除去不溶物,上樣于DEAE一52一纖維素陰離子層析柱(2.6x30cm,Cl-1型),分別采用去離子水0.1和0.3mol/LNaCI溶液進(jìn)行分段梯度洗脫,流速1.0ml/min,自動(dòng)收集器分部收集(10ml/管),每梯度20管。用硫酸一苯酚法跟蹤檢測(cè)各管多糖含量(490nm處吸收值),以收集的管數(shù)為橫坐標(biāo)。吸光值(490nm)為縱坐標(biāo)繪制DEAE一52一纖維素色譜柱洗脫曲線。依據(jù)洗脫峰型,合并相同組分,50旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮,對(duì)去離子水透析48h以去除NaCI及小分子雜質(zhì),最后將透析內(nèi)液冷凍干燥,得初步純化產(chǎn)品。初步純化多糖得率計(jì)算公式:多糖得率(%)=純化多糖質(zhì)量/粗多糖質(zhì)量x100%葡聚糖凝膠層析純化采用Sephadex G-100凝膠層析法對(duì)DEAE-52一纖維素初步純化的不同組分的多糖樣品進(jìn)一步純化。葡聚糖凝膠(sephadexG一100)的預(yù)處理:稱取sephadexG一100凝膠干粉,加入30倍體積質(zhì)量比(ml/g )的去離子水,沸水浴5小時(shí)使其溶脹。冷卻后用去離子水反復(fù)浸洗,減壓脫氣后進(jìn)行濕法裝柱,用0.1MNa2SO4;溶液平衡(流速0.25ml/min)2一3個(gè)柱體積備用。分別稱取經(jīng)DEAE一纖維素一52初步純化的各多糖組分樣品20mg,溶于2 ml 0.1 MNa2SO4溶液中,上樣于SephadexG一100層析柱(2.6x60cm)用0.1MNa2SO4溶液溶液洗脫,流速0.25 ml/min,分步收集(5ml/管)。 用硫酸一苯酚法跟蹤檢測(cè)各管多糖含量(490nm處吸收值),以收集的管數(shù)為橫坐標(biāo)。吸光值(490nm)為縱坐標(biāo)繪制sePhadexG一100色譜柱洗脫曲線。依據(jù)洗脫峰型,合并相同組分,50旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮,對(duì)去離子水透析48h以去除Na2SO4;及小分子雜質(zhì),最后將透析內(nèi)液冷凍干燥,得不同純化產(chǎn)品。純化多糖得率計(jì)算公式:純化多糖得率(%)=純化多糖質(zhì)量/粗多糖質(zhì)量x100%（鮑氏層孔菌菌絲體粗多糖）（4） 紙層析法呈單一集中斑點(diǎn)。取0.5%的多糖樣品溶液50ul,點(diǎn)樣于新華中速濾紙(3cmx20cm)距端點(diǎn)1cm處的中部,以正丁醇:濃氨水:水(4O:50:5)為展開劑,飽和2小時(shí)以上,在室溫下展開6h,取出吹干,用0.5%甲苯胺藍(lán)液染色,立即用95%乙醇漂洗至背景褪色,看是否只有一個(gè)清晰的斑點(diǎn)。（5）瓊脂糖(Agarose)凝膠電泳法在瓊脂糖板(厚度為0.2cm)上點(diǎn)樣3一5ul采用濃度為0.075mol/L,pH8.6的巴比妥緩沖液,電泳1-1.5h,電壓為64一80V,甲苯胺藍(lán)(濃度為1%)染色,醋酸乙醇混合溶液(醋酸:乙醇:水=0.1:5:5)脫色。多糖純品經(jīng)電泳展開后,看是否呈現(xiàn)單一斑點(diǎn),斑點(diǎn)是否清晰。（6）紫外分光光度法將多糖PWZ加0.9%NaCI溶液溶解,配成濃度為1mg/ml的溶液,采用UV一16OA紫外可見光譜儀掃描(200nm一30Onm)觀察260nm、280nm處是否有吸收峰。多糖的分子量測(cè)定：過去用超速離心沉降法、光散射法、滲透壓法、粘度法等，這些方法操作復(fù)雜且誤差較大，現(xiàn)已少用?，F(xiàn)在較常用的方法有凝膠過濾法和高效凝膠液相色譜法，這兩種方法須先用已知分子量的標(biāo)準(zhǔn)多糖對(duì)照測(cè)定樣品的分子量。 一般來說，多糖結(jié)構(gòu)分析包括以下幾點(diǎn)：（1） 單糖組成分析：研究確定單糖的種類及摩爾比；完全酸水解后用高效液相色譜方法(HPLC)或氣相色譜方法測(cè)定。（2） 糖苷鍵類型：研究確定糖苷鍵及支鏈點(diǎn)連接位置；甲基化分析方法 高碘酸氧化法與Smith降解法（3） 糖環(huán)大?。貉芯看_定糖苷鍵為呋喃糖或吡喃糖； 紅外光譜（4） 異頭碳構(gòu)型：研究確定糖苷殘基的a-或P-構(gòu)型； 2D NMR.(Two dimensional Nuclear Magnetic Resonance)光譜分析方法測(cè)（5） 確定單糖殘基和重復(fù)單元的序列甲基化分析方法與磁共振光譜分析方法結(jié)合分析，一般會(huì)參考多糖的單糖組成及摩爾比信息以利于解析多糖結(jié)構(gòu)。高碘酸氧化法薄層層析(TLc)定性，氣相色譜法（6） 取代基團(tuán)位點(diǎn)：研究0H-修飾基團(tuán)的種類和取代位點(diǎn)，如0-磷酸化，乙醜基取代，0-硫酷化等； 比色分析方法（7） 多糖分子量分布的研究。紫外光譜定性與定量方法薄層層析：殘基定性氣相色譜：殘基定量氣質(zhì)聯(lián)用：殘基定量高效陰離子色譜法：殘基定量鑒定結(jié)構(gòu)常用物理化學(xué)方法：高效液相色譜:確定單糖組分和相對(duì)分子量紅外光譜分析:測(cè)定多糖的官能團(tuán)，不僅可以檢測(cè)酮糖、酵糖的恥喃糖環(huán)或呋喃糖環(huán)的構(gòu)象和糖苷鍵的構(gòu)型核磁共振:-構(gòu)型與-構(gòu)型殘基的比例；判斷異頭碳構(gòu)型；推斷主鏈和支鏈連接鍵型鑒定結(jié)構(gòu)復(fù)合方法：甲基化分析:推斷出多糖樣品中糖基的連接方式及各種連接鍵型的比例高碘酸氧化法與Smith降解法:判斷糖苷鍵的位置、直鏈多糖的聚合度及支鏈多糖的分支數(shù)目糖睛乙酸酷衍生物的氣相色譜法:單糖組成和摩爾比各種多糖化學(xué)結(jié)構(gòu)鑒定方法的具體實(shí)施方案1、 酸水解（1） 完全酸水解 稱 取 20mg 樣品 , 加入 2mL 2molL-1的H2SO4于安培管中沸水浴水解 8h, 水解液用 BaCO3中和至pH =7 , 離心 , 取上清夜置冰箱冷藏備測(cè) 。（阿魏側(cè)耳子實(shí)體多糖分離純化及其化學(xué)結(jié)構(gòu)的初步研究）（2） 部分酸水解 稱取糖樣 70mg，80條件下，0.05M 三氟乙酸水解 2h。降至室溫后，離心（4000r/min，10min），將沉淀干燥，留做 GC 分析。上清用無水乙醇除酸至中性(pH 為 67)，蒸餾水透析 48h：將袋外透析液濃縮，真空干燥，留做 GC 分析；袋內(nèi)液濃縮至 5ml 左右，加 10 倍體積無水乙醇，醇沉過夜，離心(4000r/min，10min)，沉淀常規(guī)干燥，作 GC 分析；上清濃縮， 真空干燥，留做 GC 分析。2、 高效液相色譜 確定樣品的單糖組成色譜條件為 :色譜柱為Shodex KS804 Sugar(300mm 7.8mm)柱溫40度 流動(dòng)相為水流速0.8mLmin-1檢測(cè)用 410R示差檢測(cè)器，數(shù)據(jù)處理用810GPC軟件進(jìn)行。同時(shí)用鼠李糖、阿拉伯糖、甘露糖、半乳糖、木糖、果糖、葡萄糖、巖藻糖8種單糖進(jìn)行對(duì)照, 根據(jù)峰值確定樣品的單糖組成。分子量的測(cè)定以標(biāo)準(zhǔn)分子量的葡聚糖 Pulluan 作分子量測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)。讓其通過高壓液相色譜柱, 條件同上, 先以分子量對(duì)數(shù)與對(duì)應(yīng)的保留時(shí)間作標(biāo)準(zhǔn)曲線, 從標(biāo)準(zhǔn)葡聚糖Pulluan 的工作曲線上可以求得該成分分子量 。例如：（阿魏側(cè)耳子實(shí)體多糖分離純化及其化學(xué)結(jié)構(gòu)的初步研究）將水解后的多糖樣品PW2進(jìn)行HPLC分析,結(jié)果如表所示:阿魏側(cè)耳子實(shí)體多糖PW2經(jīng)過酸水解后,得到2種單糖:葡萄糖和半乳糖,摩爾比例1.771。例如：經(jīng)HPLC測(cè)定后對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線得多糖PW2的分子量為3.18104。（阿魏側(cè)耳子實(shí)體多糖分離純化及其化學(xué)結(jié)構(gòu)的初步研究）4、 甲基化分析 (1)基本原理 先將多糖中各種單糖殘基中的游離羥基全部甲基化，然后將多糖中的糖苷鍵進(jìn)行完全酸水解，水解后得到的化合物，其羥基所在的位置，即為原來單糖殘基的連接點(diǎn)。同時(shí)根據(jù)不同甲基化單糖的比例，可以推測(cè)出此種連接鍵型在多糖重復(fù)結(jié)構(gòu)中所占的比例。 用此種方法得到的羥基及NaBH4還原醛基后產(chǎn)生的羥基，經(jīng)乙?；傻玫郊谆奶谴家宜狨?此產(chǎn)物易揮發(fā)，可進(jìn)行GC分析)，再經(jīng)GC與GC-MS分析，通過氣相色譜的出峰順序和對(duì)質(zhì)譜譜圖的主要離子碎片的分析便可以較準(zhǔn)確地確定糖的連接鍵型。 反應(yīng)通式如下:（2)甲基化反應(yīng) 取充分干燥的多糖樣品10 mg，溶解在2.0 ml的二甲基亞礬（DMSO)中。在N2保護(hù)下快速加入干燥的NaOH粉50 mg，用N2排出空氣，加蓋密封，室溫反應(yīng)1.0 h并間歇振蕩。在N2保護(hù)下緩慢滴加碘甲烷1.0 ml，用N2排出空氣，加蓋密封，室溫繼續(xù)反應(yīng)1.0 h并間歇振蕩，反應(yīng)完成后加0.5 ml水終止反應(yīng)。反應(yīng)液先用自來水流水透析48 h，再用蒸餾水透析24 h，透析液冷凍干燥得第一次甲基化樣品。第一次甲基化樣品繼續(xù)甲基化，反應(yīng)步驟同上，得第二次甲基化樣品。如此重復(fù)甲基化三次。甲基化后的樣品用紅外光譜檢測(cè)，3700 cm-13100 cm-1，附近無羥基的特征吸收峰，表明甲基化反應(yīng)完全。（3)甲基化樣品的衍生化 上述完全甲基化多糖樣品加入2 mol/1的三氟乙酸(TFA ) 3.0 ml, 120密閉水解2.0 h。冷卻后50減壓蒸發(fā)干，加2.0 ml甲醇再蒸發(fā)干，重復(fù)三次，最后蒸發(fā)干得完全甲基化多糖的水解產(chǎn)物。加蒸餾水2.0 ml使其溶解，再加硼氫化鈉25 mg，振蕩后室溫還原反應(yīng)2.0 h。反應(yīng)完后滴加0.1 mol/1醋酸分解過量的硼氫化鈉并調(diào)pH值至5.57.0弱酸性。反應(yīng)液50減壓蒸發(fā)蒸干，加2.0 ml甲醇再蒸干，重復(fù)三次，最后蒸發(fā)干。 上述蒸發(fā)干樣品加入1.0 ml醋酸酐和1.0 ml吡啶，封管后在沸水浴中反應(yīng)1.0 h。反應(yīng)液50減壓蒸發(fā)干，加2.0 ml甲醇再蒸發(fā)干，重復(fù)三次，最后蒸發(fā)干。加入丙酮1.0 ml，用0.45ul尼龍微孔濾膜過濾，取樣進(jìn)行GC/MS分析。(4)衍生化樣品的GC/MS分析多糖樣品經(jīng)甲基化、水解、還原、乙?；蟮玫郊谆谴家宜狨?，進(jìn)行GC/MS聯(lián)機(jī)分析，根據(jù)文獻(xiàn)的相對(duì)保留時(shí)間和不同單糖的主要離子碎片(m/e），推斷出多糖樣品中糖基的連接方式及各種連接鍵型的比例。本實(shí)驗(yàn)采用的條件為:GC ( Varian CP3800型)和MS （Varian Satum 2200型)氣相一質(zhì)譜聯(lián)用儀，DB-5MS石英毛細(xì)管柱(30 m X0.25 mm X0.25um);程序升溫，初溫80，保持1 min，以8 /min升至210，保持1 min，再以20 /min升至260,保持1 min;氦氣作載氣，進(jìn)樣口溫度250，分流比1: 50，柱流速1.0 ml/min;電子電離源(EI源)70 eV，倍增器電壓350 V，燈絲電流250uA，接口溫度260,離子源溫度180，質(zhì)荷比(m/z)掃描范圍30450，掃描速率2.5 scan/sec。（胞式層孔菌菌絲體多糖分離純化、結(jié)構(gòu)鑒定及其生物活性研究）流程圖如下：（MAEP-2a-2b是安絡(luò)小皮傘菌絲體多糖的某個(gè)過程中第某個(gè)樣品）例如：經(jīng)過甲基化反應(yīng)的 MAEP-2b-2a 通過 GC-MS 分析，結(jié)合其各峰位保留時(shí)間和質(zhì)譜碎片峰，判斷樣品的結(jié)構(gòu)并計(jì)算摩爾百分比。從表 14 中，可以看出 MAEP-2b-2a 中糖部分是以（12,16）連接的 Man（甘露糖） 為主鏈。（12）連接的 Man（甘露糖） 在其 4 位上有分枝點(diǎn),（16）連接的 Man 在其 2 位上有分枝點(diǎn)。在這些分枝點(diǎn)上，連接著由 Gal 和 Glu 為主組成的側(cè)鏈。MAEP-2b-2a 的非還原末端是由 Gal,Man,Glu 組成。從甲基化結(jié)果的摩爾百分比計(jì)算，各分枝點(diǎn)摩爾百分比之和低于非還原末端摩爾百分比之和，由 PMP 衍生化組成糖分析結(jié)果可知，MAEP-2b-2a 尚含約9%的 GalA，糖醛酸在復(fù)雜多糖中可能以分枝點(diǎn)的形式存在，故推測(cè)在 MAEP-2b-2a 中還有大量的 GalA 作為分枝點(diǎn)而存在。（絡(luò)小皮傘菌絲體多糖）（茶源多糖結(jié)構(gòu)鑒定）5、紅外光譜分析 取干燥樣品微量 , 壓片 , 全波段掃描 。例如：阿魏側(cè)耳子實(shí)體多糖分離純化及其化學(xué)結(jié)構(gòu)的初步研究圖中顯示在 4000cm-1 650cm-1區(qū)內(nèi)的是具有多糖類物質(zhì)的一般特征。 3372cm-1的吸收峰是 O-H 和 N-H 的伸縮振動(dòng)峰, 2931cm-1為 C-H 的吸收峰, 即為-CH 和-CH2的共振吸收鋒。這兩類是糖類的特征吸收峰。848cm-1吸收峰表明在PW2（文中提純的第二種成分）多糖純品結(jié)構(gòu)中存在型(即 端基差向異構(gòu)體),1026cm-1、1081cm-1和 1152cm-1的吸收峰表明 PW2 中的糖環(huán)為吡喃糖環(huán), 這是由醚鍵 C-O-C 振動(dòng)而產(chǎn)生的吸收峰;而呋喃糖環(huán)在此區(qū)間上只有兩個(gè)強(qiáng)吸收峰。 在 890cm-1處有微弱吸收, 表明樣品中含有少量 型糖苷鍵, 而在 810cm-1處沒有振動(dòng)吸收峰表明沒有甘露糖的存在。 928cm-1為糖類分子振動(dòng)吸收峰, 即D-吡喃糖的非對(duì)稱環(huán)伸縮振動(dòng)產(chǎn)生。而1725cm-1的存在, 表明多糖含有糖醛酸基團(tuán), 即 PW2 為酸性多糖。3、 核磁共振將樣品 10mg , 溶于 D2O(重水)中 , 溶解溫度 80, 分別在400MHz和500MHz上測(cè)定1HNMR和13CNMR 。（阿魏側(cè)耳子實(shí)體多糖分離純化及其化學(xué)結(jié)構(gòu)的初步研究）（1）氫譜分析例如：5.39 吸收峰表明樣品的主要構(gòu)型為-構(gòu)型, 由于存在4.97 吸收峰的存在 , 表明存在少量的-構(gòu)型(-構(gòu)型C-1信號(hào)在 103 以下, H-1信號(hào)在5.0 以上;-構(gòu)型C-1信號(hào)在104 以上, H-1信號(hào)在5.0 以下)。且-構(gòu)型與-構(gòu)型殘基的比例為 10.2843。（2） 碳譜分析例如： 由圖及表 2 可以看出 :C-1 信號(hào)在 100.4ppm, 即處在 90-103 之間, 表明多糖的異頭碳的構(gòu)型為-構(gòu)型, 同時(shí)可以看到存在一個(gè)微弱的 117ppm 峰, 表明樣品中有少量的-構(gòu)型, 峰的相對(duì)高度正比于碳的數(shù)目, 即-構(gòu)型與-構(gòu)型殘基的比例為 10.29, 這個(gè)結(jié)果和紅外光譜以及氫譜的結(jié)論完全吻合。圖中 70 76 之間的碳共振峰分別是未被取代的 C-2、C-3 、C-4, 其中 ,與 兩種構(gòu)型的共振峰重疊嚴(yán)重 , 由于 77.906為被取代的 C-4 的糖苷鍵的共振峰, 圖中可以看出存在重疊峰, 這是由于與 兩種構(gòu)型和兩種單糖造成的, （小邱：不是很明白它的意思，后面推測(cè)說應(yīng)該是C-4上有支鏈）C-6部分共振峰由61.114向低場(chǎng)移動(dòng)到69.977 表明多糖 PW2 存在 1-6糖苷鍵, 根據(jù)峰高比例可以大約看出多糖 PW2 的主鏈為 1-6糖苷鍵, 存在 1-4 糖苷鍵的支鏈。 由 C-1 和 C-6 的峰高比例可以看出多糖 PW2 的支鏈不多。6、 高碘酸氧化法與Smith降解法（1）原理高碘酸氧化是一種選擇性的氧化反應(yīng)，它只能作用于多糖分子中連二輕基及連三輕基處。當(dāng)連二輕基的C-C鍵被斷開后，產(chǎn)生相應(yīng)的醛;當(dāng)斷裂連三輕基的C-C鍵時(shí)，產(chǎn)生甲酸及相應(yīng)的醛。此反應(yīng)定量進(jìn)行，每斷開1 mol C-C鍵，消耗1 mol高碘酸，由此可知，每生成1 mol甲酸必然對(duì)應(yīng)消耗2 mol高碘酸。因此，通過測(cè)定高碘酸消耗量及甲酸生成量，便可以判斷糖苷鍵的位置、直鏈多糖的聚合度及支鏈多糖的分支數(shù)目等。高碘酸氧化產(chǎn)物經(jīng)NaBH4還原，得到的多糖醇用稀酸在溫和條件下水解，可發(fā)生特異性降解，即Smith降解。Smith降解的特點(diǎn)是只打斷被高碘酸破壞的糖苷鍵，而未被高碘酸氧化的糖殘基仍連在糖鏈上。這樣，多糖醇經(jīng)Smith降解，就可以得到小分子的多元醇和未被破壞的多糖或寡糖片段，對(duì)這些產(chǎn)物進(jìn)行分析，便可以推斷出糖苷鍵的鍵型及其位置。(2)高碘酸鈉標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 各取適量的NaI04 (15 mmol/L)和NaIO3 (15 mmol/L)溶液，以5: 0, 4: 1, 3:2, 2: 3, 1: 4和0: 5的體積比分別相混合。取不同比例的混合液0.1 ml稀釋250倍至25 ml，分光光度計(jì)測(cè)量各管223 nm處的吸光值。以混合液中的NaI04濃度(mmol/L)為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)，繪制NaIO4標(biāo)準(zhǔn)曲線。(3)高碘酸氧化 精確稱取多糖樣品25 mg，用15 mmol/1的NaIO4溶液將多糖配成1.0 mg/ml溶液，振蕩使其溶解。2h后取多糖溶液0.1 ml稀釋250倍至25 ml，分光光度計(jì)測(cè)量223 nm處的吸光值。多糖溶液置4冰箱，暗處反應(yīng)，并間歇振蕩。間隔6h取樣0.1 ml稀至25 ml，測(cè)223 mn處吸光值，直至吸光值基本穩(wěn)定。根據(jù)反應(yīng)前后的吸光值和NaIO4標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出NaIO4消耗量。加乙二醇1.0 ml，靜置反應(yīng)1h以還原過量的高碘酸。取反應(yīng)液1.0 ml，加50ul酚酞指示劑，用0.5 mmol/L的NaOH溶液滴定，計(jì)算甲酸的生成量。反應(yīng)液加硼氫化鈉50mg，靜置反應(yīng)20 h以還原多糖醛成穩(wěn)定的多羥基化合物。用0.1 mol/L的乙酸調(diào)反應(yīng)體系的pH值為5.5-7.0，分解多余的硼氫化鈉。反應(yīng)液用自來水流水透析48 h，再用蒸餾水透析24 h。透析液50減壓蒸發(fā)至干，加入甲醇2.0 ml，再蒸干，如此重復(fù)3次，最后蒸干獲多糖的高碘酸氧化產(chǎn)品待作Smith降解使用。（4) Smith降解及GC分析 將減壓蒸干的多糖高碘酸氧化產(chǎn)品，進(jìn)行三氟乙酸(TFA)水解，再制備糖腈乙酸酯衍生物，最后用GC進(jìn)行檢測(cè)。7、糖腈乙酸酯衍生物的氣相色譜法（鮑氏層孔菌菌絲體多糖的結(jié)構(gòu)分析）（1）多糖樣品水解采用完全酸水解法。稱取多糖樣品5mg置安瓶瓶中,加入2 mol/1三氟乙酸(TFA)2ml封管,120水解2小時(shí)。水解液50條件下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干,加入甲醇約2ml,再蒸發(fā)干,如此重復(fù)3次,最后蒸干待作衍生化使用。(2)糖腈乙酸酯衍生物的制備水解后的糖樣中加入10 mg鹽酸羥胺、5 mg肌醇(內(nèi)標(biāo)物)、0.6 ml吡啶，封口，放入90水浴中加熱反應(yīng)3 0 min并振蕩。冷至室溫，再加入1.0 ml醋酸酐，90水浴中繼續(xù)反應(yīng)30 min，冷卻后得糖腈乙酸酯衍生物。反應(yīng)產(chǎn)物可直接用于氣相色譜分析。(3)衍生物的氣相色譜檢測(cè)本實(shí)驗(yàn)采用的條件為:Agilent 6890N氣相色譜儀，5%苯甲基硅氧烷毛細(xì)管色譜柱HP-5， 30.0 mX320um X0.25um;氫火焰離子檢測(cè)器(FID );色譜柱程序升溫:1200C保持3min，以30C / min速度升溫至2100C, 2100C再保持4 min;進(jìn)樣口、檢測(cè)器溫度分250、 280;進(jìn)樣體積1.0ul,氮?dú)狻錃夂涂諝獾牧魉俜謩e是25 ml/min,30 ml/min, 400 ml/min。(4)標(biāo)準(zhǔn)單糖衍生與檢測(cè)鼠李糖、巖藻糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖以及半乳糖等標(biāo)準(zhǔn)單糖同樣進(jìn)行糖睛乙酸酷衍生化，然后以同樣條件進(jìn)行氣相色譜分析。根據(jù)色譜圖中各色譜峰的出峰時(shí)間、峰面積以及單糖本身的摩爾質(zhì)量可知樣品的單糖組成和摩爾比。計(jì)算公式:Wx = (Ax * Wi )/(Ai*f)。公式中Wx一樣品中單糖質(zhì)量(mg ); Wi一樣品中加入內(nèi)標(biāo)的質(zhì)量(mg); AX樣品中單糖的峰面積; Ai樣品中內(nèi)標(biāo)的峰面積; f相對(duì)校正因子:f = Wi* As/ ( Ws * Ai ) 。8、 薄層層析(TLc)單糖殘基的定性分析(猴頭菌實(shí)體多糖)薄層層析(TLc)：取2mg多糖樣品放入薄壁長(zhǎng)試管中,加入2mol/L三氟乙酸(TFA)4mL,在110下水解,中性多糖樣品水解2h,含糖醛酸樣品水解4h。樣品水解溶液減壓蒸干(低于40)后,加入3mL甲醇再蒸干,重復(fù)以上步驟4一5次,以完全除去TFA。再向樣品中加入0.5mL左右的蒸餾水使樣品完全溶解,取5uL在纖維素板上進(jìn)行薄層層析,展開劑采用乙酸乙酯:吡啶:醋酸:水(5:5:1:3),顯色劑為苯胺一鄰苯二甲酸,110加熱10min后顯色,以標(biāo)準(zhǔn)單糖樣品為對(duì)照。(山藥多糖)9、 氣相色譜法（猴頭菌體多糖）（1）標(biāo)準(zhǔn)單糖樣品的乙?；?精密稱取等摩爾(2 mmol/L)的半乳糖、巖藻糖、木糖、鼠李糖、葡萄糖、甘露糖和阿拉伯糖，分別溶于3 mL蒸餾水中，加入20-30 mg硼氫化鈉(NaBH4 )，于室溫下，間歇振蕩，還原3h，然后用冰醋酸中和過量的NaBH4，至溶液不再產(chǎn)生氣泡為止，pH應(yīng)在4-5之間，加入3mL甲醇，減壓濃縮蒸干，重復(fù)4-5次，以除去反應(yīng)副產(chǎn)物硼酸及水分，然后置于真干燥器中過夜。次日，110烘箱中加熱15 min，充分除去殘留的水分后，加入4 mL醋配，100反應(yīng)1h，冷卻，然后加入3 mL甲苯，減壓濃縮蒸干，重復(fù)4-5次，以除去多余的醋酐。將乙?；蟮漠a(chǎn)物用3 mL氯仿溶解后轉(zhuǎn)移至分液漏斗，加入少量蒸餾水充分震蕩后，除去上層水溶液，如此重復(fù)4次。氯仿層以適量的無水硫酸鈉干燥，定容至10 mL待GC和GC-MS分析。（2）樣品的乙?；幚砣? mg多糖樣品，放入薄壁長(zhǎng)試管中，加入2 mol/L的三氟乙酸(TFA)4 mL，在110水解2h。將水解液低于40減壓蒸干，然后加入3 mL甲醇蒸干，重復(fù)上述操作4-5次，以完全除去TFA。然后按照上述的方法進(jìn)行還原、乙酞化，用氯仿定容至5m1，待GC和GC-MS分析。（3） GC分析及定量 分別用單個(gè)單糖的標(biāo)樣按（1）法處理后用GC測(cè)定，確定每個(gè)單糖的保留時(shí)間。然后用單糖的混標(biāo)按（1）法處理后用GC測(cè)定，重復(fù)進(jìn)樣6次，確定混合標(biāo)準(zhǔn)樣品的氣相色譜圖和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD1)。最后按（1）法平行處理六個(gè)混標(biāo)樣品后用GC測(cè)定，確定其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD2)。 糖的定量分析:計(jì)算各糖組分的峰面積，利用面積歸一法求出各糖組分的百分比例，并計(jì)算每種單糖的響應(yīng)因子。然后根據(jù)等摩爾的標(biāo)樣組分，計(jì)算出樣品的摩爾比。（4）色譜條件 氣相色譜儀(GC)配備DB-23石英毛細(xì)管柱，30 m X 0. 25 mm X 0. 25 um。氫火焰離子化檢測(cè)器(FID)，高純氮作載氣。程序升溫:柱初溫120 ，以15 /min升至240 ，恒6. 5 min。進(jìn)樣口溫度250 ，分流比1:50。檢測(cè)器溫度250 氫氣35 mL/min，空氣350 mL/min，尾吹氣30 mL/min。柱流速為1 mL/min。10、 高效陰離子色譜法（猴頭菌體多糖） 取2 mg多糖樣品放入薄壁長(zhǎng)試管中，加入2 mol/L三氟乙酸(TFA ) 4 mL，在110下水解，中性多糖樣品水解2h，用超純水溶解定容至100 mL容量瓶，稀釋100倍后上樣測(cè)定。色譜條件:分離柱采用Dionex公司CarboPacTMPA20預(yù)處理、CarboPacTMPA20檢測(cè)柱;脈沖安培檢測(cè)器工作參數(shù):E1為100 mv, 400 ms; E2為-2000mv, 20 ms; E3為600 mV, 10 ms; E4為-100 mV, 70 ms。流動(dòng)相:分別采用濃度為2.5 mmol/L的NaOH作淋洗液;淋洗方法采用單一濃度淋洗。流速:0.45mL/min;上樣量:25 uL;溫度30。11、 氣質(zhì)聯(lián)用（猴頭菌體多糖）取處理的乙?；a(chǎn)物，上GC-MS，色譜條件:氣相一質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MS)配備DB-5MS石英毛細(xì)管柱，30 m X 0. 25 mm X 0. 25 um。程序升溫:柱初溫80，保持1 min，以5 0C/min至200 0C，再以2 0C/min至215 ，最后以20 /min至270 氦氣作載氣，進(jìn)樣口溫度250 ，分流比1:50，柱流速為1 mL/min。 EI (70eV)，倍增器電壓350 v，燈絲電流250 uA，接口溫度200，離子源溫度250，質(zhì)量數(shù)掃描范圍42-462 amu，掃描速率2. 5 scan/秒。 根據(jù)HEPF1的總離子流圖(圖3. 6)，通過各峰的保留時(shí)間和質(zhì)譜可以確定其含有巖藻糖、葡萄糖和半乳糖，但是在保留時(shí)間22. 58 min處有一未知物峰。根據(jù)22. 58min處的質(zhì)譜圖(圖3. 7)可知，該組分在m/z 43, 87, 101, 117, 129, 143, 189和203處有碎片離子峰。其中m/z 203和189是3-0-甲基一甲基戊糖糖醇乙酸醋衍生物的一級(jí)片段，而耐z 129和143是由一級(jí)片段m/z 189和203部分裂解產(chǎn)生乙酸根(-AcOH,-60)而產(chǎn)生的二級(jí)片段，與文獻(xiàn)完全一致。由此可以斷定此峰是3- 0-甲基一甲基戊糖的糖醇乙酸酷衍生物。由于3-0-甲基一甲基戊糖有兩種存在形式，3- 0-甲基一鼠李糖或3- 0-甲基一巖藻糖，判斷具體的哪一種，還需要進(jìn)一步驗(yàn)證。12、苯酚硫酸法總糖含量測(cè)定（1）標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品在105烘箱條件下干燥至衡重，取20 mg于500 mL容量瓶中定容。分別吸取0.4 mL, 0.6 mL, 0.8 mL, 1.0 mL, 1.2 mL, 1.4 mL, 1.6 mL, 1.8 mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液于試管中，并加水補(bǔ)至2.0 mL。加入配制好的6%苯酚溶液1.0 mL，用移液管吸取5.0 mL濃硫酸，待靜止10 min后搖勻，再在室溫下放置20 min，待反應(yīng)完全。于490nm下測(cè)吸光度，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。（2）樣品含量測(cè)定 配制1 mg/mL的粗多糖溶液。稀釋后，測(cè)定吸光值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算總糖含量。13、糖醛酸含量測(cè)定（1）試劑配制 間輕基聯(lián)苯(m-hydroxydiphenyl)試劑:0.15%間輕基聯(lián)苯，以0.5%氫氧化鈉配制，置于冰箱中保存，1月內(nèi)穩(wěn)定。 四硼酸鈉一硫酸試液:配制0.0125 mol/L四硼酸鈉的濃硫酸溶液。 半乳糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)溶液:精密稱取半乳糖醛酸60 mg，置于100 mL容量瓶中，加水溶解，定容。稀釋標(biāo)準(zhǔn)溶液至60ug/mL，定容后備用。（2）標(biāo)準(zhǔn)曲線制作 分別精確量取0uL， 5uL，100uL，150 uL, 200uL，250 uL, 300 uL, 350uL半乳糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)溶液于比色管中，補(bǔ)加水至0.25 mL，在冰水浴中預(yù)冷，加入1.5 mL四硼酸鈉硫酸試液。振搖混合后，在沸水浴中加熱5 min。冰水浴冷卻至室溫后，加25uL間經(jīng)基聯(lián)苯試液。搖勻后，在520 nm處測(cè)定吸光值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。(3)樣品測(cè)定 取0.1 mg/mL多糖水溶液0.1 mL，加水補(bǔ)足至1mL，余操作同標(biāo)準(zhǔn)曲線，平行測(cè)定三次，根據(jù)吸光度從標(biāo)準(zhǔn)曲線上求得糖醛酸含量。14、分子質(zhì)量測(cè)定 示差折光指數(shù)增量(dn/dc )通過OPTILAB折光儀在633 nm和25下測(cè)定，dn/dc值為0.14。 dn/dc描述的是大分子溶液折光指數(shù)相對(duì)于溶質(zhì)濃度的變化，它的值得大小有其自身性質(zhì)決定的，受溶劑、溫度、測(cè)量波長(zhǎng)等因素的影響，也是用光散射測(cè)定聚合物分子量不可少的常數(shù)。 光散射(LS)測(cè)定角度為900， TFP1的流出體積為28 mL。根據(jù)方程6-1和6-2，通過Kc/R。對(duì)sin2(/2)+Kc作圖得到 Zimm曲線(圖15(b)，在縱坐標(biāo)的交點(diǎn)為重均分子量Mw的倒數(shù)。公式中字母的意義:K為光學(xué)常數(shù)，c 為多糖溶液的濃度(mg/mL ) ， R為瑞利因子，n為溶劑的折光指數(shù)，0為入射光波長(zhǎng)，z1/2均方根旋轉(zhuǎn)半徑，NA為Avogadro常數(shù)，I0和I分別為入射光強(qiáng)和散射光強(qiáng)，代表光源到測(cè)量點(diǎn)得距離。 根據(jù)Zimm圖計(jì)算得到TFPl在NaCl溶液中各個(gè)參數(shù)見表1 , TFPl的重均分子量(Mw)大小為5.832xl06Da; Z均方根旋轉(zhuǎn)半徑(z1/2)是用來描述大分子的尺寸,它的大小可以用來判斷聚合物的伸展范圍和剛性,該值比較大時(shí)說明多糖是伸展的剛性鏈,值比較小則代表緊密纏繞的線團(tuán), TFP1的 z1/2為191.3 nm說明TFP1是伸展的剛性鏈;多分散系數(shù)(Mw/Mn)為1.005,說明TFP1分子量分布均勾。所以用本研究中的提取純化方法得到的銀耳多糖TFP1是分子量較大的均一多糖,糖鏈?zhǔn)巧煺沟膭傂枣湣?4、碘-碘化鉀反應(yīng)銀耳多糖TFP1溶液與碘試劑(含0.02% 12的0.2% KI溶液)混勻,測(cè)定300-700 nm范圍內(nèi)的吸收光譜,若在565 nm處有最大吸收則說明多糖有較少的分支和較短的側(cè)鏈161。如圖16所示,TFP1與I2-KI的反應(yīng)物最大吸收峰在351nm,而565 nm處并沒有最大吸收,說明TFP1可能存在較長(zhǎng)的側(cè)鏈和較多的分支。另外,TFP1與I2-KI反應(yīng)呈陰性,說明不含淀粉。15、剛果紅實(shí)驗(yàn) 剛果紅是一種酸性染料,分子式C32H22N6Na2O6S2,分子量696.66,能溶于水和乙醇,可與具有三股螺旋構(gòu)象的多糖形成絡(luò)合物,絡(luò)合物的最大吸收波長(zhǎng)同剛果紅相比發(fā)生相對(duì)位移,在一定的NaOH濃度范圍內(nèi),表現(xiàn)為最大吸收波長(zhǎng)特征性變化(變成紫紅色),當(dāng)NaOH濃度大于0.3 mol/L后最大吸收波長(zhǎng)急劇下降。若隨著NaOH的濃度升高,多糖最大吸收波長(zhǎng)相應(yīng)減小,但相對(duì)于剛果紅本身最大吸收波長(zhǎng)減少明顯緩慢,則說明多糖未表現(xiàn)出三股螺旋結(jié)構(gòu)。如圖17,隨著NaOH的濃度升高,剛果紅與銀耳多糖形成的絡(luò)合物的最大吸收波長(zhǎng)相應(yīng)減小,但相對(duì)于剛果紅本身最大吸收波長(zhǎng)減小的緩慢,說明銀耳多糖TFP1可能不具有三螺旋結(jié)構(gòu)。16、粘度檢測(cè)高分子的粘度是流體力學(xué)性質(zhì)的內(nèi)容,反映高分子之間的摩擦力,特性粘度值反映的是單個(gè)高分子在特定濃度下對(duì)溶液粘度的貢獻(xiàn),其值的大小并不隨濃度改變而改變,多糖溶液特性粘度()與分子量大小有關(guān)。Kh和Kk分別為高分子在特定條件下某溶劑中的常數(shù);,特性粘度;sp增比粘度;r相對(duì)粘度;C,高分子溶液濃度。由Huggins方程(y= 1146547.14x + 1508.83 )和Kraemer方程(y = -189179x+ 1507.8)計(jì)算的TFPl的特性粘度=1508.3 mL/g (如圖18)。表2中是一些生物多糖在25 并以0.1 mol/L NaCl作為溶劑的條件下測(cè)定的特性粘度,銀耳多糖與其它一些樣品相比占有相對(duì)較大的流體力學(xué)體積,一定條件下特性