「細胞轉染簡介【學習資料】」.ppt

基因轉染 1 學習資料 報告內容 一轉染的簡介二轉染的分類三轉染的方法四轉染后篩選 2 學習資料 一 轉染的簡介 1 基因轉染 將具生物功能的核酸轉移或運送到細胞內并使核酸在細胞內維持其生物功能 2 基因轉染技術已廣泛應用于基因組功能研究和基因治療研究 3 學習資料 二 轉染的分類 4 學習資料 三 轉染的方法 基因轉染的基本方法可以分為 1 重組子的構建 2 基因轉染真核細胞的方法 5 學習資料 重組子的構建 1 目的基因的制備和獲取2 哺乳動物細胞表達載體的選擇3 DNA片斷的重組連接4 DNA重組體的鑒定 6 學習資料 1 目的基因的制備和獲取 1 目的基因是所要研究或應用的基因 也就是將要克隆或表達的基因或基因的一個片段 2 目的基因常用的制備方法 7 學習資料 A 限制酶切除a 從原核基因組DNA制備 視原核基因組物理圖譜已知或未知 克隆方法不同 b 從真核基因組DNA制備c 從已克隆的DNA片段制備 8 學習資料 B PCR或RT PCR方法制備目的基因a 獲取已知基因據已發(fā)表的基因序列 或基因兩側序列已知 設計 合成一對引物 PCR 基因組DNA為模板 RT PCR mRNA為模板 從組織或細胞制備目的基因b 構建RT PCR文庫法獲取未知基因據mRNA末端如polyA尾設計共同引物 將所用mRNA并逆轉錄成cDNA利用工具酶在cDNA末端加尾 采用一對共用引物擴增所有cDNA 插入適當載體 構成PCR cDNA文庫篩選 9 學習資料 C 計算機克隆 即利用GenBank信息 利用不同種屬同源性設計引物 嘗試獲取未知基因片段 這有賴于各種計算機軟件的應用 D 化學合成法制備基因片段 用DNA合成儀 對目的基因分段合成 連接 可以得到所需的目的基因 10 學習資料 2 哺乳動物細胞表達載體的選擇 哺乳動物細胞表達載體有2大類 質粒型載體和病毒型載體 1 質粒型載體哺乳動物細胞質粒型載體大多數是通過細菌質粒而獲得的 主要是在質粒的基礎上插入了一些病毒或其他一些物種及人的基因表達調控序列 A 典型的哺乳動物細胞表達載體需要以下順式作用元件 a 啟動子b 增強子c 多聚腺苷酸化信號d 藥物選擇標記基e 報告基因f 表位標簽 11 學習資料 B 常用的哺乳動物表達質粒載體a pcDNA3 lb pSIc pCMV HAd pBudCE4 1e pTRE 12 學習資料 2 病毒型載體病毒型載體已被廣泛地用于將外源基因導入哺乳動物細胞或替換哺乳動物細胞中的缺陷基因 這類載體將來在基因治療中將具有非常重要的價值 目前應用的病毒類型包括 逆轉錄病毒 腺病毒 牛痘病毒和桿狀病毒等 A 逆轉錄病毒載體逆轉錄病毒的優(yōu)點是 可以使外源基因整合到基因組中 因而可以被穩(wěn)定傳代和表達 但是 由于逆轉錄病毒的插入位點是隨機的 因而在基因組內的整合有可能破壞一些內源基因的結構 尤其是當插人到一些重要的基因位點時會導致細胞的異常 13 學習資料 B 腺病毒載體易于培養(yǎng) 純化 在感染過程中復制與轉錄依賴于宿主細胞的聚合酶 可插入較大的外源基因片段 且腺病毒基因不會發(fā)生整合 是研究真核基因的良好模型 14 學習資料 3 DNA片斷的重組連接 15 學習資料 4 DNA重組體的鑒定 外源DNA片斷是否插入載體構成重組DNA分子 而插入片斷大小 是否突變及插入位置 順序及方向則關系到構建載體是否擴增 我們所需要的基因或表達 表達相應的產品 所以需要進一步鑒定DNA重組體 1 酶切鑒定是必需的 基于下述 A 限制性圖譜個體特異性 不同的載體或DNA分子物理圖譜不同 酶切后片段大小不一樣 電泳圖譜不一樣 B 同一載體連接不同的DNA片斷 不同的載體連接同一片段 片段上也有位點 酶切圖譜是不同的 16 學習資料 C 插入法 單酶單切點 或替代法 雙酶雙位點 酶切 一般來說用3種限制酶切 可鑒定載體及 插入片段的大小 方向 切后并電泳分析 以確定是否得到預期的rDNA 2 若構建DNA重組體是為了克隆某個基因 可進行在序列測定 3 若構建表達載體 可進行表達產物鑒定 17 學習資料 基因轉染真核細胞的方法 18 學習資料 1 DEAE 葡聚糖是最早應用哺乳動物細胞轉染的試劑之一 DEAE 葡聚糖是陽離子多聚體 它與帶負電的核酸結合后接近細胞膜而被攝取 DEAE一葡聚糖轉染已成功地應用于瞬時開始 但用于穩(wěn)定轉染卻不可靠 19 學習資料 2 磷酸鈣共沉淀轉染法由于試劑易得 價格便宜而被廣泛用于瞬時轉染和穩(wěn)定染的研究 方法是 先將DNA和氯化鈣混合 然后加人到PBS中慢慢形成DNA磷酸鈣沉淀 后把含有沉淀的混懸液加到培養(yǎng)的細胞上 通過胞膜的內吞作用攝人DNA 20 學習資料 3 脂質體介導法 目前應用最廣泛 原理 陽離子脂質體試劑與DNA混合后 形成一種穩(wěn)定的脂質雙層復合物 DNA被包在脂質體中間 這種脂質雙層復合物可直接加到培養(yǎng)的細胞中 脂質體粘附到細胞表面并與細胞膜融合 DNA被釋放到胞漿中 21 學習資料 此圖所示是脂質體介導轉染的示意圖 它顯示了外源質粒進入細胞的一般過程 22 學習資料 主要應用 瞬時轉染穩(wěn)定轉染 特點 使用方法簡單 可攜帶大片段DNA 通用于各種類型的裸露DNA或RNA 能轉染各種類型的細胞 沒有免疫原性 雖在體外基因轉染中有很高的效率 但在體內 能被血清清除 并在肺組織內累積 誘發(fā)強烈的抗炎反應 導致高水平的毒性 很大程度上應用受限制 23 學習資料 利用脂質體轉染法最重要的就是防止其毒性 因此脂質體與質粒的比例 細胞密度以及轉染的時間長短和培養(yǎng)基中血清的含量都是影響轉染效率的重要問題 通過實驗摸索的合適轉染條件對于效率的提高有巨大的作用 24 學習資料 此圖為脂質體轉染后熒光蛋白的表達 25 學習資料 物理方法 包括電穿孔 顯微注射及基因槍等方法 1 電穿孔法利用高壓電脈沖對細胞膜的干擾 使其形成利于核酸進人的微孔 電穿孔技術可用于瞬時轉染和穩(wěn)定轉染 可方便地用于懸浮細胞 重現性好 但需要較多的細胞 影響轉染效率的主要因素是脈沖強度和持續(xù)時間 必須找到能夠使核酸有效釋放而又不殺死細胞的最佳平衡點 26 學習資料 2 顯微注射法該法雖然費力 但卻是非常有效的將核酸導人細胞或細胞核的方法 這種方法常用來制備轉基因動物 但不適用于需要大量轉染細胞的研究 3 基因槍法該法依靠攜帶了核酸的高速粒子而將核酸導人細胞內 這種方法適用于培養(yǎng)的細胞和在體的細胞 27 學習資料 病毒顆粒是一類十分有效的基因釋放系統(tǒng) 因此 它是將外源基因導人大量細胞最有效的方法 病毒感染具有高效率 可穩(wěn)定遺傳 適用于各種不同來源的細胞及操作簡單等優(yōu)點 但多數病毒有其潛在的危險性 操作者需要有一定的病毒操作經驗和良好的設施 1 逆轉錄病毒 2 腺病毒 28 學習資料 四轉染后篩選 篩選所選用的抗生素跟轉染所用的質粒上所帶的真核篩選抗性基因有關的 標有neo 實際上應該是neoresistance 的載體 指載有降解新霉素的基因 新霉素作用于原核和真核細胞 對兩者都有殺傷作用 用于轉染后 穩(wěn)定表達外源基因細胞的陽性篩選 29 學習資料 標有amp 實際上應該是ampresistance 的載體 指載有降解氨芐青霉素的基因 內酰胺酶 作用于原核細胞 只對敏感菌有作用 用于克隆菌的篩選 最常見的載體上帶有新霉素抗性基因neo 所以篩選的時候用G418 G418是目前獲得穩(wěn)轉最常用的試劑之一 30 學習資料 G418是一種氨基糖苷類抗生素 其結構與新霉素 慶大霉素 卡那霉素相似 通過影響80S核糖體功能而阻斷蛋白質合成 對原核和真核細胞等都有毒性 包括細菌 酵母 植物和哺乳動物細胞 也包括原生動物和蠕蟲 細菌Tn5轉座子序列 neo抗性基因 攜帶的氨基糖苷類磷酸轉移酶可以將G418轉變成無毒性狀 31 學習資料 當neo基因被整合進真核細胞基因組合適的地方后 則能啟動neo基因編碼的序列轉錄為mRNA 從而獲得抗性產物氨基糖苷磷酸轉移酶的高效表達 使細胞獲得抗性而能在含有G418的選擇性培養(yǎng)基中生長 目前G418的這一特性已在基因轉移 敲除 抗性篩選以及轉基因動物等方面得以廣泛應用 32 學習資料 轉染是否成功的影響因素很多 如需要轉染的細胞類型 對于困難的細胞系尤其如此 需要被轉染的分子 DNA RNA 寡核苷酸 蛋白質 轉染試劑等 但無論在何種情況下 轉染的成功均取決于轉染效率 低細胞毒性以及重現性這幾個要素 33 學習資料 1細胞 1 分裂細胞相比較非分裂細胞 2 貼壁細胞相比較懸浮細胞 3 傳代次數 4 細胞數量 融合率 34 學習資料 2交叉污染如果同一個實驗室同時培養(yǎng)不同種類的細胞 那就有可能發(fā)生交叉污染 即使遵循最嚴格的分離操作規(guī)程這種情況也有可能發(fā)生 如有許多細胞系被HeLa細胞所污染 和其他細胞系之間的交叉污染不總是能通過鏡檢發(fā)現 如果有少量某種生長快速的細胞摻入到培養(yǎng)細胞種 幾個月過后它們就會完全取代目標培養(yǎng)物 35 學習資料 3載體DNA一般原則 對純化所得的載體進行質量鑒定 確定維持其正常功能的基因序列是否適合于您的細胞體系 在測定細胞體系的參數時 一定要選用一種已知具有功能的載體做對照 1 載體完整性 2 載體制備物 36 學習資料 4組織培養(yǎng)試劑一般原則 優(yōu)化您的細胞生長條件 只使用新鮮配制的培養(yǎng)基和添加劑 并盡可能減少所用試劑的變更 1 基礎培養(yǎng)基 2 胎牛血清 3 添加劑 37 學習資料 5轉染方案一般原則 建立一套適當的轉染方案