基因工程載體.ppt

載體的定義 能夠承載外源基因 并將其帶入受體細胞得以相對穩(wěn)定維持的dna分子稱為基因載體 基因工程載體 載體的作用 1 將外源基因帶入受體細胞并保持穩(wěn)定2 為外源基因提供復制能力或整合能力3 為外源基因擴增或表達提供必要的條件 克隆載體 cloningvector 為使插入的外源dna序列被擴增而特意設計的載體稱為克隆載體 表達載體 expressionvector 為使插入的外源dna序列可轉(zhuǎn)錄翻譯成多肽鏈而特意設計的載體稱為表達載體 載體應具備的條件 1 至少有一個克隆位點 2 至少有一個復制起點 3 必須含有標記基因 4 安全的 不含有對受體細胞有害的基因 分子量小 拷貝數(shù)多 易分離等 質(zhì)粒載體 plasmid 噬菌體載體柯斯質(zhì)粒 cosmid 單鏈dna噬菌體m13動 植物病毒克隆載體染色體克隆載體 載體種類 質(zhì)粒載體 質(zhì)粒載體的一般特征 它是一種裸露的比病毒更簡單 有自主復制能力的dna分子 處于生命與非生命的的界線上 廣泛存在于細菌細胞中 在藍藻 霉菌 酵母甚至真菌細胞中都發(fā)現(xiàn)有質(zhì)粒分子的存在 特點 能在宿主細胞內(nèi)獨立自主復制 帶有某些遺傳信息 會賦予宿主細胞一些遺傳性狀 質(zhì)粒的類型 1接合型質(zhì)粒 能自我轉(zhuǎn)移除自我復制外還帶有一套控制細菌配對和質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移的基因 如 f質(zhì)粒 f因子 2非接合型質(zhì)粒 不能自我轉(zhuǎn)移符合基因工程的安全要求 比如 r質(zhì)粒 抗性質(zhì)粒 col質(zhì)粒 質(zhì)粒的復制類型 1 嚴緊型質(zhì)粒 stringentplasmid 2 松弛型質(zhì)粒 relaxedplasmid 質(zhì)粒載體的構建 天然質(zhì)粒的局限性 1 分子量大 拷貝數(shù)低 2 篩選標志不理想 3 減少限制性內(nèi)切核酸酶的酶切位點 4 質(zhì)粒安全性能的改造 5 改造或增加基因表達的調(diào)控序列 人工質(zhì)粒的一般特征 a分子量盡量小b載體分子上的基因位置 限制性內(nèi)切酶的作用位點甚至核苷酸序列為已知c載體易繁殖 松弛型拷貝d具選擇標記基因e應最大限度的具有各種常用限制性內(nèi)切酶的單一切割位點 閱讀框架的選擇 防止移碼突變 思考題 e colibeta d galactosidaselacz 5 atgaccatgattacggat 3 5 tggtctggtgtcaaaaataa 3 噬菌體載體 噬菌體的一般特性噬菌體是一類細菌病毒 bacteriophage 的總稱 簡稱phage 由遺傳物質(zhì)核酸和其外殼組成 結(jié)構 蛋白質(zhì)外殼內(nèi)包裹著dna 雙鏈 單鏈 線性 環(huán)狀等 噬菌體的生活周期 噬菌體載體的分類 1 雙鏈噬菌體載體 載體2 單鏈噬菌體載體m13 噬菌體的特點 1 長度為48502bp2 雙鏈線性dna 3 在兩端有cos位點 可以環(huán)化 噬菌體載體的構建策略 1 刪除 噬菌體的非必需區(qū) 留識別位點作克隆位點2 在非必須區(qū)引進選擇標記3 突變某些基因 使它成為安全載體4 刪除或甲基化必須區(qū)段上常用的限制酶切點 防止外源基因插入必須區(qū) 5 不小于36 4kb 柯斯質(zhì)粒 1978年collins和hohn構建一種新型的大腸桿菌克隆載體 命名為cosmid 柯斯質(zhì)粒 它是用正常的質(zhì)粒同噬菌體 的cos位點構成 例如 柯斯質(zhì)粒phc79系由質(zhì)粒pbr322和噬菌體 的cos位點的一段dna構成 柯斯質(zhì)粒特點 1 具 噬菌體特點2 具有質(zhì)粒dna的特性3 高容量的克隆能力 用于構建基因組文庫4 具有與同源序列的質(zhì)粒重組的能力 柯斯質(zhì)粒一般長4 6kb 是可以插入片段的1 10 易出現(xiàn)載體同載體自身連接 容易錯配 柯斯質(zhì)粒制成的基因文庫常常不太穩(wěn)定 插入的大片段外源dna有可能通過同宿主基因組交換而致丟失等 所以最常使用的還是噬菌體載體 柯斯質(zhì)粒作載體的缺點 病毒克隆載體 構建的基本策略 消除致病性 保留轉(zhuǎn)導或轉(zhuǎn)染特性 常用于植物轉(zhuǎn)化的病毒載體 ti質(zhì)粒35s啟動子表達載體 雙元表達載體系統(tǒng) 雙元載體系統(tǒng)的構建的原理是ti質(zhì)粒上的vir基因可以反式激活t dna的轉(zhuǎn)移 雙元表達載體系統(tǒng)主要包括兩個部分 一部分為輔助ti質(zhì)粒 這類ti質(zhì)粒由于缺失了t dna區(qū)域 完全喪失了致瘤作用 主要是提供vir基因功能 激活處于反式位置上的t dna的轉(zhuǎn)移 另一部份是微型ti質(zhì)粒 mini tiplasmid 它在t dna左右邊界序列之間提供植株選擇標記如nptii基因以及l(fā)acz基因等 含外源基因的質(zhì)粒可在農(nóng)桿菌內(nèi)自主復制并保留下來 農(nóng)桿菌侵染植物細胞后 植物的創(chuàng)傷信號啟動ti質(zhì)粒上的vir基因 隨后將穿梭質(zhì)粒的t dna切割下來 轉(zhuǎn)移到植物細胞中 一般植物表達載體是成套使用的 一個是帶有可以供插入外源表達基因的mcs和篩選標簽的融合蛋白 通常是gfp或gus 的普通載體 另一個載體就是雙元載體 binary vector 先將外源基因插入帶有篩選標記的載體 然后將此載體上的35spromoter expressiongene gfp這段全部切下 然后構件亞克隆 其過程就是將上述的片斷插入雙元載體的lb和rb之間 其插入方向是可以任意的 然后將帶有35spromoter expressiongene gfp的雙元載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌 在通過農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)染植物 最后可以通過農(nóng)桿菌特有的ti dna轉(zhuǎn)染機制 將雙元載體的lb和rb之間的片段融合進宿主的基因組上 幾乎所有雙子葉植物都容易受到土壤農(nóng)桿菌感染 而產(chǎn)生根瘤 它是一種革蘭氏陰性土壤桿菌 a tumefaciens 其致瘤特性是由ti tumor inducing 質(zhì)粒介導的 農(nóng)桿根瘤菌之所以會感染植物根部是因為植物根部損傷部位分泌出酚類物質(zhì)乙酰丁香酮和羥基乙酰丁香酮 這些酚類物質(zhì)可以誘導vir virulenceregion 基因的啟動表達 vir基因的產(chǎn)物將ti質(zhì)粒上的一段t dna單鏈切下 而位于根瘤染色體上的操縱子基因產(chǎn)物則與單鏈t dna結(jié)合 形成復合物 轉(zhuǎn)化植物根部細胞 t dna上有三套基因 其中兩套基因分別控制合成植物生長素與分裂素 促使植物