高中生物：1.3 基因工程的應(yīng)用 課件3新人教版選修3.ppt

多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增dna片斷 分子生物學(xué)研究中最強(qiáng)大的實(shí)驗(yàn)技術(shù)之一 其本質(zhì)是在體外模擬胞內(nèi)dna分子復(fù)制的過(guò)程 美國(guó)科學(xué)家穆利斯 k b mullis 發(fā)明了pcr技術(shù)1993年諾貝爾獎(jiǎng) 一 多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) 是一種體外迅速擴(kuò)增dna片段的技術(shù) 能以極少量的dna為模板 在幾小時(shí)內(nèi)復(fù)制出上百萬(wàn)份的 拷貝 廣泛應(yīng)用于遺傳病的診斷 刑偵破案 古生物學(xué) 基因克隆和dna序列測(cè)定等 二 dna分子的結(jié)構(gòu) 1 基本組成單位 脫氧核苷酸 脫氧核苷酸結(jié)構(gòu)式 3 5 一個(gè)核苷酸上的磷酸基團(tuán)上的 oh 和另一個(gè)核苷酸分子的第三位碳原子上的羥基之間失去一分子水 形成磷酸二脂鍵 即在相鄰的兩個(gè)脫氧核苷酸的3 和5 碳原子之間形成磷酸二脂鍵 數(shù)量龐大的四種脫氧核苷酸通過(guò)3 5 磷酸二脂鍵彼此連接起來(lái)形成脫氧核苷酸鏈 通常將dna的羥基 oh 末端稱為3 端 而磷酸基團(tuán)的末端稱為5 端 2 多脫氧核苷酸鏈的形成 多脫氧核苷酸鏈結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)圖 3 dna分子的雙螺旋結(jié)構(gòu)特點(diǎn) dna分子是由兩條反向平行的 即一條鏈為3 5 另一條鏈為5 3 脫氧核苷酸長(zhǎng)鏈盤旋而成的規(guī)則雙螺旋結(jié)構(gòu) 脫氧核糖與磷酸交替連結(jié) 排列在外側(cè) 構(gòu)成基本骨架 堿基排列在鏈的內(nèi)側(cè) 兩條鏈上的堿基通過(guò)氫鍵連結(jié)起來(lái) 形成堿基對(duì) 堿基對(duì)的組成有特定的規(guī)律 即腺嘌呤一定與胸腺嘧啶配對(duì) 鳥(niǎo)嘌呤一定同胞嘧啶配對(duì) 三 dna的復(fù)制 2 時(shí)期 有絲分裂間期或減數(shù)第一次分裂前的間期 3 場(chǎng)所 細(xì)胞核 主 線粒體 葉綠體 4 模板 dna母鏈 1 概念 由一個(gè)dna形成兩個(gè)完全相同的dna的過(guò)程 5 原材料 脫氧核苷酸 6 基本條件 酶 atp 原料 模板 7 復(fù)制過(guò)程 dna的解旋 親代dna分子利用細(xì)胞提供的能量在解旋酶的作用下氫鍵斷裂 部分雙螺旋鏈解旋為兩條平行的雙鏈 rna引物的合成 以單股dna為模板 在引物酶的作用下合成小段的rna引物 dna的生成 以單股的dna為模板 在dna聚合酶的作用下 在rna引物的末端由5 端 3 端合成dna 邊解旋邊復(fù)制 過(guò)程 8 復(fù)制特點(diǎn) 半保留復(fù)制 結(jié)果 9 遵循原則 堿基互補(bǔ)配對(duì)原則 10 精確復(fù)制的原因 11 復(fù)制的意義 dna分子通過(guò)復(fù)制使遺傳信息從親代傳給了后代 從而保持了遺傳信息的連續(xù)性 規(guī)則的雙螺旋結(jié)構(gòu)為復(fù)制提供了精確的模板 堿基互補(bǔ)配對(duì)能力保證了復(fù)制準(zhǔn)確無(wú)誤的進(jìn)行 總結(jié) 胞內(nèi)dna復(fù)制的基本體系 打開(kāi)dna雙鏈提供dna復(fù)制的模板合成子鏈的原料催化合成dna子鏈?zhǔn)筪na聚合酶能夠從引物的3 端開(kāi)始連接脫氧核苷酸 四 pcr 多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) 1 pcr原理 在80 100 的溫度范圍內(nèi) dna的雙螺旋結(jié)構(gòu)將解體 雙鏈分開(kāi) 這個(gè)過(guò)程稱為變性 當(dāng)溫度緩慢降低后 兩條彼此分離的dna鏈又會(huì)重新結(jié)合成雙鏈 pcr利用了dna的熱變性原理 通過(guò)控制溫度來(lái)控制雙鏈的解聚與結(jié)合 現(xiàn)在使用的pcr儀實(shí)質(zhì)上也是一臺(tái)能夠自動(dòng)調(diào)控溫度的儀器 變性 復(fù)性 延伸 加熱到90 dna雙鏈解旋為單鏈 降到50 引物通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)與單鏈dna結(jié)合 升溫到72 四種脫氧核苷酸在dna聚合酶的作用下 根據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則合成新的dna鏈 2 細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外dna復(fù)制環(huán)境的區(qū)別 細(xì)胞內(nèi)源引物合成酶細(xì)胞內(nèi)源細(xì)胞內(nèi)源細(xì)胞內(nèi)環(huán)境 外源加入外源加入外源加入外源加入緩沖液 pcr過(guò)程需要的引物不是rna 而是人工合成的dna單鏈 其長(zhǎng)度通常為20 30個(gè)脫氧核苷酸 3 細(xì)胞內(nèi)復(fù)制和pcr的主要不同點(diǎn) pcr過(guò)程中dna的解旋不依靠解旋酶 而是通過(guò)對(duì)反應(yīng)溫度的控制來(lái)實(shí)現(xiàn)的 4 dna聚合酶特性 不能從頭合成dna 只能從dna的3 端開(kāi)始延伸dna鏈 因此 dna復(fù)制需要引物 5 dna聚合酶作用過(guò)程 當(dāng)引物與dna母鏈通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)結(jié)合后 dna聚合酶就能從引物的3 端開(kāi)始延伸dna鏈 dna的合成方向總是從子鏈的5 端向3 端延伸 高溫解決了打開(kāi)雙鏈的問(wèn)題 但又導(dǎo)致dna聚合酶失活的問(wèn)題 耐高溫的taqdna聚合酶解決了高溫導(dǎo)致dna聚合酶失活 促成了pcr技術(shù)的自動(dòng)化 6 taqdna聚合酶的應(yīng)用 7 緩沖液需要為pcr反應(yīng)提供的物質(zhì) dna模板 分別與兩條模板鏈相結(jié)合的兩種引物 四種脫氧核苷酸 耐熱的dna聚合酶存在于緩沖液中 同時(shí)通過(guò)控制溫度使dna復(fù)制在體外反復(fù)進(jìn)行 pcr技術(shù)是80年代中期發(fā)展起來(lái)的體外核酸擴(kuò)增技術(shù) 它具有特異 敏感 產(chǎn)率高 快速 簡(jiǎn)便 重復(fù)性好 易自動(dòng)化等特性 8 pcr技術(shù)的特點(diǎn) 五 pcr的反應(yīng)過(guò)程 1 pcr的反應(yīng)步驟 pcr一般經(jīng)歷三十多次循環(huán) 每次循環(huán)可以分為三個(gè)基本步驟 變性 復(fù)性和延伸 變性 模板dna解旋 模板dna經(jīng)加熱至900c以上 一定時(shí)間后 使模板dna雙鏈或經(jīng)pcr擴(kuò)增形成的雙鏈dna解離 使成為單鏈 以便于它與引物結(jié)合 為下輪反應(yīng)作準(zhǔn)備 2 循環(huán)過(guò)程 pcr循環(huán)第一步 高溫變性 復(fù)性 退火 低溫復(fù)性 模板dna經(jīng)加熱變性成單鏈后 溫度降到500c左右 引物與模板dna單鏈的互補(bǔ)序列配對(duì)結(jié)合 pcr循環(huán)第二步 引物與靶序列退火 延伸 中溫延伸 dna模板 引物結(jié)合物在taqdna聚合酶的作用下以脫氧核苷酸為原料 以母鏈為模板 按堿基互補(bǔ)配對(duì)的原則與半保留復(fù)制的原理 合成一條新的dna鏈 3 30次循環(huán)后靶序列擴(kuò)增的數(shù)量 六 pcr的實(shí)驗(yàn)操作 1 pcr儀 一 設(shè)備及用具 實(shí)質(zhì)上一臺(tái)能夠自動(dòng)調(diào)控溫度的儀器 2 微量離心管 一種薄壁塑料管 總?cè)莘e為0 5ml 3 微量移液器 用于定量轉(zhuǎn)移pcr配方中的液體 其上的一次性吸液槍頭用一次更換一次 pcr儀 微量離心管 一次性吸液槍頭 調(diào)節(jié)輪 卸槍頭按鈕 推動(dòng)按鈕 卸槍頭器 微量移液器 二 實(shí)驗(yàn)操作步驟 一 理論上dna擴(kuò)增數(shù)目的計(jì)算 七 課題成果評(píng)價(jià) 1 一條dna 復(fù)制n次 dna為2n 2 a條d