流式細胞技術(shù)課件

第15章流式細胞技術(shù)的原理和應(yīng)用 陳鯉翔副教授Email lxchen 流式細胞技術(shù) Flowcytometry FCM 是以流式細胞儀為檢測手段的一項能快速對單個細胞或其他生物微粒 如細菌 的理化特性進行多參數(shù)定量分析和分選的技術(shù) 流式細胞儀是測量染色細胞標記物熒光強度的細胞分析儀 是在單個細胞分析和分選基礎(chǔ)上發(fā)展起來的對細胞的物理或化學(xué)性質(zhì) 如大小 內(nèi)部結(jié)構(gòu) DNA RNA 蛋白質(zhì) 抗原等 進行快速測量并可分類收集的高技術(shù) 30年代 設(shè)想使細胞檢測自動化50 60年代 分層鞘流原理 分光光度計定量細胞成分及結(jié)合測量值對細胞分類 提出細胞分選70年代 單克隆抗體技術(shù)和熒光標記技術(shù)1973年 第一臺商用流式細胞儀FACSI發(fā)展方向 熒光染料的開發(fā) 細胞的制備方法 提高電子信號的處理能力等 流式細胞儀的發(fā)展史 BD公司流式細胞儀 FACSCalibur LSRII FACSCanto FACSCount FACSVantage FACSAria MoFloAstriosEQ超高速流式分選系統(tǒng) Gallios流式細胞儀 Beckman公司流式細胞儀 Navios流式細胞分析系統(tǒng) 應(yīng)用 細胞生物學(xué) 腫瘤學(xué) 血液學(xué) 免疫學(xué) 藥理學(xué) 遺傳學(xué)及臨床檢驗學(xué)等 流式細胞儀常檢測的細胞特性 液流系統(tǒng)光學(xué)系統(tǒng)數(shù)據(jù)處理系統(tǒng) 一 流式細胞技術(shù)原理 1 流式細胞儀的基本結(jié)構(gòu) 由樣本和鞘液組成待測細胞單個細胞的懸液熒光染料標記的單抗對其染色受清潔氣體壓力從樣品管進入流動室形成樣本流鞘液 輔助樣本流被正常檢測的基質(zhì)液 主要作用是包裹樣本流的周圍 保持樣本流中細胞處于噴嘴中心位置 防止其靠近孔壁而阻塞噴孔 1 液流系統(tǒng) FluorescenceSignal FocusedLaserBeam ShealthFluid 液流系統(tǒng)示意圖 InjectorTip 樣本管 鞘液管 激光光源 氣冷式氬離子激光器分色反光鏡 反射長 短波長 通過短 長波長光束成形器 兩十字交叉放置的透鏡透鏡組 形成平行光 除去室內(nèi)光濾片 長通 短通 帶通光電倍增管 FS SS 散射光 FL1 FL2 FL3 FL4 熒光 2 光學(xué)系統(tǒng) 光學(xué)系統(tǒng)示意圖 散射光的測定細胞在液柱中與激光束相交時向周圍360 立體角方向散射的光線信號 它的強弱與細胞的大小 形狀 胞內(nèi)顆粒折射等有關(guān) 主要分為前向散射光和側(cè)向散射光 光信號的測定 前向散射光 forwardscatter FS 激光束照射細胞時 光以相對軸較小角度 0 5 10 向前方散射的訊號用于檢測細胞等粒子的表面屬性 信號強弱與細胞體積大小成正比 側(cè)向散射光 sidescatter SS 激光束照射細胞時 光以90 角散射的訊號 用于檢測細胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)屬性 測得的FS與SS信號通過計算機處理 可得到FS SS圖 由此可僅用散射光信號對未染色的活細胞進行分析或分選 此為血細胞分類的基本原理 但不能分析表面分子 淋巴細胞 單核細胞 中性粒細胞 光散射測量最有效用途 從非均一群體中鑒別出某些亞群 熒光信號由被檢細胞上標記的特異性熒光染料受激發(fā)后產(chǎn)生 發(fā)射的熒光波長與激發(fā)光波長不同 每種熒光染料會產(chǎn)生特定波長的熒光和顏色 通過波長選擇通透性濾片 可將不同波長的散射光和熒光信號區(qū)分開 送入不同的光電倍增管 選擇不同的單抗及染料就可同時測定一個細胞上的多個不同特征 線性放大器和對數(shù)放大器 熒光測定 熒光補償 FITC APC PE PerCP Cy5 5 每一種熒光分子都發(fā)射某一特定波長范圍內(nèi)的光 然而這些熒光的發(fā)射光譜會發(fā)生重疊 有時這種重疊現(xiàn)象非常顯著 熒光補償是指修正熒光滲漏的過程 如從探測器除去除匹配熒光以外的任何熒光信號 熒光補償 壓電晶體 產(chǎn)生機械振動 不充電 充電 細胞分選 分選速度 單位時間內(nèi)分選的細胞數(shù)量 與懸液中細胞的含量成正比 分選純度 分選出的目的細胞占所有收獲細胞的百分率 分選收獲率 實際收獲的分選細胞與設(shè)定通過測量點的分選細胞之間的比率 與純度成反比 分選得率 從一群體細胞懸液中分辨出目的細胞的總量 再經(jīng)分選后得到目的細胞的實際得率 與分選速度成反比 分選的技術(shù)要求 3 數(shù)據(jù)處理系統(tǒng) FS 反映顆粒的大小SS 反映顆粒的內(nèi)部結(jié)構(gòu)復(fù)雜程度FL 反映顆粒被染上的熒光數(shù)量多少 參數(shù) 單參數(shù)直方圖雙參數(shù)點圖 二維等高圖三參數(shù)直方圖多參數(shù)分析 數(shù)據(jù)顯示方式 由一維參數(shù) 散射光或熒光 與顆粒計數(shù) COUNT 構(gòu)成 反映同樣散射光或熒光強度的顆粒數(shù)量的多少 單參數(shù)直方圖 雙參數(shù)點圖 雙參數(shù)直方圖 縱軸和橫軸分別代表被測量細胞的兩個測量參數(shù) 根據(jù)這兩個參數(shù)就可以確定細胞在圖上的表達位置 雙參數(shù)信號通常采用對數(shù)信號 最常用的是點密圖 在圖中 每個點代表一個細胞 點圖利用顆粒密度反映同樣散射光或熒光強度的顆粒數(shù)量的多少 用等高線來表示細胞數(shù) 在一條等高線上細胞數(shù)相同 不同的等高線上細胞數(shù)不同 二維等高圖 三參數(shù)直方圖 三維坐標勻為參數(shù) 散射光或熒光 而非細胞數(shù) 多參數(shù)分析 當(dāng)細胞標記了多色熒光 被激發(fā)光激發(fā)后 得到的熒光信號和散射光信號可根據(jù)需要進行組合分析 一般利用所得參數(shù)的兩兩組合并利用設(shè)門 Gate 技術(shù) 來分析參數(shù)之間的相互關(guān)系 多參數(shù)分析 Gate設(shè)置 指在某一張選定參數(shù)的直方圖上 根據(jù)該圖的細胞群分布選定其中想要分析的特定細胞群 并要求該樣本所有其他參數(shù)組合的直方圖只體現(xiàn)這群細胞的分布情況 根據(jù)門的形狀又分為了線性門 矩形門 圓形門 多邊形門 任意形狀門和十字門 門 Gate 設(shè)置 A淋巴細胞B單核細胞C中性粒細胞 A B C均為任意門 區(qū)閾 region R 與門 gate G 是兩個相關(guān)的概念 區(qū)閾可與門對應(yīng) 但是也可以包含于門 Region設(shè)置 D1CD4 CD3 D2CD4 CD3 D3CD4 CD3 D4CD4 CD3 如十字門分析時 就可以由四個區(qū)域構(gòu)成 即G D1 D2 D3 D4 樣本制備 單細胞懸液標記染色 光譜不重疊陰性對照的設(shè)置 檢測標本的重復(fù)性質(zhì)量控制 二 流式細胞儀免疫分析的技術(shù)要求 外周血淋巴細胞樣品的制備 淋巴細胞分離液分離外周血中單個核細胞 Ficoll 40kd 高密度 低滲透壓 無毒性 比重為1 0177 0 001的分層液 樣本制備 利用紅細胞裂解液去除紅細胞后 得到外周血中所有白細胞的流式細胞分析的二維散色光點圖 培養(yǎng)細胞的樣品制備 單層培養(yǎng)細胞加蛋白酶消化后吸管吹打的方法使細胞從培養(yǎng)皿上消化下來 然后離心漂洗 懸浮培養(yǎng)細胞 可不用酶消化 直接吹打制備成單細胞懸液 新鮮實體組織單細胞懸液的制備機械法 剪碎法 網(wǎng)搓法 研磨法 酶處理法 胃蛋白酶 胰蛋白酶 膠原酶等 化學(xué)試劑處理法 EDTA EGTA等 表面活性劑處理法 Triton x100 皂素等 防止細胞自溶 保持細胞膜原有的特性保存的方法 1 深低溫保存法 深低溫冰箱 保存一年 2 乙醇與甲醇保存法 70 冷乙醇 75 的甲醇 3 甲醛或多聚甲醛固定法 細胞不具有生物活性 但細胞表面熒光染色分析不受影響 單細胞懸液的保存 適用條件 有較高的量子產(chǎn)額和消光系數(shù)對488nm的激發(fā)光波長有較強的吸收發(fā)射光波長與激發(fā)光波長間有較大的波長差易與標記單抗結(jié)合而不影響抗體的特異性 常用的熒光染料與標記染色 激光 細胞懸液 異硫氰酸熒光素 得州紅 能量傳遞復(fù)合染料 藻膽蛋白類 幾種常見的熒光染料 常用的幾類熒光染料 用化學(xué)法將兩種不同激發(fā)波長的染料結(jié)合在一起 在488nm激發(fā)光照射下 通過一個熒光染料被激發(fā)后產(chǎn)生的發(fā)射波長再激發(fā)另一熒光染料產(chǎn)生熒光信號 從而檢測到該特定熒光信號 能量傳遞復(fù)合染料 Laser 488nm 488nm 575nm 670nm紅色熒光 花青苷5 藻紅蛋白 能量傳遞復(fù)合染料機制 熒光染料與細胞成分的四種結(jié)合方式結(jié)構(gòu)親和式嵌入結(jié)合共價鍵結(jié)合熒光標記抗體特異性結(jié)合免疫熒光標記方法直標 干擾少 但需購買多種單抗間標 步驟多 干擾多 不需標記多種抗體組合標記 免疫熒光標記 FITC PE488525 575綠色 橙色FITC Tred488525綠色568615紅色FITC PeCy5488525 675綠色 紅色FITC ECD488525 625綠色 橙紅色F P PeCy5488525 575 675綠 橙 紅色F ECD PeCy5488525 575 675綠 橙紅色 紅色F P APC488525 575綠色 橙色633670紅色 熒光染料激發(fā)波長 nm 發(fā)射波長 nm 顏色 雙或多參數(shù)熒光抗體的組合標記 適當(dāng)?shù)闹苽浞绞教幚砑t細胞實體組織來源標本用機械法溫度25 37 PH7 0 7 2 質(zhì)量控制 單細胞懸液制備的質(zhì)控 免疫熒光染色的質(zhì)控 溫度PH染料濃度固定劑 光路與流路校正 確保激光光路與樣品流處于正交狀態(tài) 減少變異 CV PMT 光電倍增管 校準 保證樣品檢測時儀器處于最佳靈敏度工作狀態(tài) 絕對計數(shù)校準 保證計數(shù)的準確性 Flow check Flow set Flow count 儀器操作的質(zhì)控 同型對照 即免疫熒光標記中的陰性對照 選用相同源性的未標記單抗作為對照調(diào)整和設(shè)置電壓 以保證特異性 全程質(zhì)量控制 在流式檢測中 樣品標記 溶血 洗滌 儀器質(zhì)量控制和上機檢測的過程都會直接影響檢測結(jié)果 采用標準質(zhì)控樣品來進行全程質(zhì)控 使得同類實驗室建立質(zhì)控比對 數(shù)據(jù)可以互用 免疫檢測的質(zhì)控 三 流式細胞技術(shù)應(yīng)用 以細胞免疫功能測定為例 淋巴細胞亞群活化的T淋巴細胞抗原特異性免疫細胞調(diào)控性T細胞樹突狀細胞先天免疫細胞 淋巴細胞亞群 淋巴細胞亞群 Th1Th2細胞因子分泌細胞測定 根據(jù)產(chǎn)生的細胞因子的類型和生物學(xué)功能 人的 4 細胞可以分為 1 2 1細胞產(chǎn)生 2 12 等細胞因子 主要參與細胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng) 遲發(fā)性過敏反應(yīng) 并在清除病毒等細胞內(nèi)致病因子方面起著重要作用 2細胞分泌 4 5 6 10 13等細胞因子 主要促進體液免疫反應(yīng) 中和胞外病原體相應(yīng)地 CD8 T細