「硅膠柱層析【嚴(yán)選內(nèi)容】」.doc

硅膠柱層析一、硅膠柱層析原理根據(jù)物質(zhì)在硅膠上的吸附力不同而得到分離， 一般情況下極性較大的物質(zhì)易被硅膠吸附，極性較弱的物質(zhì)不易被硅膠吸附，整個層析過程即是吸附、解吸、再吸附、再解吸過程。 二、硅膠柱層析流動相極性小的用乙酸乙酯：石油醚系統(tǒng)；極性較大的用甲醇：氯仿系統(tǒng)；極性大的用甲醇：水：正丁醇：醋酸系統(tǒng)；拖尾可以加入少量氨水或冰醋酸三、硅膠柱層析慣用方法1.稱量200-300目硅膠，稱30-70倍于上樣量；如果極難分，也可以用100倍量的硅膠H。干硅膠的視密度在0.4左右，所以要稱40g硅膠，用燒杯量100ml也可以。2.攪成勻漿加入干硅膠體積一倍的溶劑用玻璃棒充分?jǐn)嚢琛Ｈ绻疵搫┦鞘兔?乙酸乙酯/丙酮體系，就用石油醚拌；如果洗脫劑是氯仿/醇體系，就用氯仿拌。如果不能攪成勻漿，說明溶劑中含水量太大，尤其是乙酸乙酯/丙酮，如果不與水配伍走分配色譜的話，必須預(yù)先用無水硫酸鈉久置干燥。氯仿用無水氯化鈣干燥，以除去1%的醇。如果樣品對酸敏感，不能用氯仿體系過柱。3.裝柱將柱底用棉花塞緊，不必用海沙，加入約1/3體積石油醚（氯仿），裝上蓄液球，打開柱下活塞，將勻漿一次傾入蓄液球內(nèi)。隨著沉降，會有一些硅膠沾在蓄液球內(nèi)，用石油醚（氯仿）將其沖入柱中。4.壓實(shí)沉降完成后，加入更多的石油醚，用雙聯(lián)球或氣泵加壓，直至流速恒定。柱床約被壓縮至9/10體積。無論走常壓柱或加壓柱，都應(yīng)進(jìn)行這一步，可使分離度提高很多，且可以避免過柱時由于柱床萎縮產(chǎn)生開裂。5.上樣干法濕法都可以。海沙是沒必要的。上樣后，加入一些洗脫劑，再將一團(tuán)脫脂棉塞至接近硅膠表面。然后就可以放心地加入大量洗脫劑，而不會沖壞硅膠表面。6.過柱和收集柱層析實(shí)際上是在擴(kuò)散和分離之間的權(quán)衡。太低的洗脫強(qiáng)度并不好，推薦用梯度洗脫。收集的例子：10mg上樣量，1g硅膠H，0.5ml收一餾分；1-2g上樣量，50g硅膠（200-300目），20-50ml收一餾分。7.檢測要更多地使用專用噴顯劑，如果僅用紫外燈，會損失較多產(chǎn)品，紫外的靈敏度一般比噴顯劑底1-2個數(shù)量級。8.送譜收集的產(chǎn)品旋干，在送譜前通常需要重結(jié)晶。如果樣品太少或?yàn)橐后w，可過一小凝膠柱，作為送譜前的最后純化手段?？沙渥V1.5ppm左右所謂的“硅膠”峰。四、操作1 裝柱柱子下面的活塞一定不要涂潤滑劑，會被淋洗劑帶到產(chǎn)品中的，可以采用四氟節(jié)門的。干法和濕法裝柱覺得沒什么區(qū)別，只要能把柱子裝實(shí)就行。裝完的柱子應(yīng)該要適度的緊密（太密了淋洗劑走的太慢），一定要均勻（不然樣品就會從一側(cè)斜著下來）。書中寫的都不能見到氣泡，我覺得在大多數(shù)情況下有些小氣泡沒太大的影響，一加壓氣泡就全下來了。當(dāng)然如果你裝的柱子總是有氣泡就說明需要多練習(xí)了。但是柱子更忌諱的是開裂，甭管豎的還是橫的，都會影響分離效果，甚至作廢！2 加樣用少量的溶劑溶樣品加樣，加完后將下面的活塞打開，待溶劑層下降至石英砂面時，再加少量的低極性溶劑，然后再打開活塞，如此兩三次，一般石英砂就基本是白色的了。加入淋洗劑，一開始不要加壓，等溶樣品的溶劑和樣品層有一段距離（24cm就夠了），再加壓，這樣避免了溶劑（如二氯甲烷等）夾帶樣品快速下行。3 淋洗劑的選擇感覺上要使所需點(diǎn)在rf0.20.3左右的比較好。不要認(rèn)為在板上爬高了分的比較開，過柱子就用那種極性，如果rf在0.6，即使相差0.2也不容易在柱子上分開，因?yàn)橹邮且粋€多次爬板的狀態(tài)，可以通過公式的比較：0.6/0.8一次的分離度，肯定不如（0.2/0.3）的三次方或四次方大。4 樣品的收集用硅膠作固定相過柱子的原理是一個吸附與解吸的平衡。所以如果樣品與硅膠的吸附比較強(qiáng)的話，就不容易流出。這樣就會發(fā)生，后面的點(diǎn)先出，而前面的點(diǎn)后出。這時可以采用氧化鋁作固定相。另外，收集的試管大小要以樣品量而定，特別是小量樣品，如果用大試管，可能一根就收到了三個樣品，wuwu。如果都用小試管那工作量又太大。5 最后的處理柱分后的產(chǎn)品，由于使用了大量的溶劑，其中的雜質(zhì)也會累積到產(chǎn)品中，所以如果想送分析，最好用少量的溶劑洗滌一下，因?yàn)榇蟛糠值碾s質(zhì)是溶在溶劑里的，一洗基本就沒了，必要時進(jìn)行重結(jié)晶。實(shí)驗(yàn)室常用的正向柱分離有加壓、常壓和減壓等，我原是做天然產(chǎn)物全合成的，也做過少量天然產(chǎn)物分離工作。還常用到反向柱。五、正向柱分離1.TLC1)加壓、常壓柱，主點(diǎn)Rf 0.5左右，相近的組份要能分開。2)減壓柱，主點(diǎn)Rf 0.1左右，相近的組份要能分開，或次組份在原點(diǎn)。2.硅膠或氧化鋁等1)加壓、常壓柱，60到200目2)減壓柱，300目以上大空樹脂挺好，但自己用得少。硅藻土很多時侯也很好。3.柱徑好分、量大，柱徑可大些；難分、量小，柱徑可小些。4.柱長與柱徑相似，好分、量大，柱長可短些。5.制樣減壓一般是干法拌樣；加壓、常壓可干法拌樣，也可濕法備樣。6.洗脫液科研經(jīng)費(fèi)多，用加壓、常壓耗溶劑太多；省錢，給自己省時間，就用減壓。7.接液主點(diǎn)未出，多接；主點(diǎn)快出來及快出完，少接。8.收率對同一樣品且同量減壓一般收率低；加壓、常壓一般收率高。9.備柱無論減壓、加壓、常壓；無論干法、濕法備柱。填料要想法壓實(shí)，且備柱或過柱時均不可有氣泡、斷層、干柱（減壓除外。），否則一切從頭開始。六、層析技術(shù)層析技術(shù)的應(yīng)用與發(fā)展，對于植物各類化學(xué)成分的分離鑒定工作起到重大的推動作用。如中藥丹參的化學(xué)成分在30年代僅從中分離到3種脂溶性色素，分別稱為丹參酮、。但以后進(jìn)一步的研究，發(fā)現(xiàn)除丹參酮為純品外，、均為混合結(jié)晶。此后通過各種層析方法，迄今已發(fā)現(xiàn)15種單體（其中有4種為我國首次發(fā)現(xiàn)）。目前新的層析技術(shù)不斷發(fā)展，隨著層析理論和電子學(xué)、光學(xué)、計算機(jī)等技術(shù)的應(yīng)用，層析技術(shù)已日趨完善。（一）層析法的基本原理層析過程是基于樣品組分在互不相溶的兩“相”溶劑之間的分配系數(shù)之差（分配層析），組分對吸附劑吸附能力不同（吸附層析），和寓子交換，分子的大?。ㄅ抛鑼游觯┒蛛x。通常又將一般的以流動相為氣體的稱為氣相層析，流動相為液體的稱為液相層析。（二）吸附層析法（AdsorptionChromatography）吸附劑、溶劑與被分離物性質(zhì)的關(guān)系：液一固吸附層析是運(yùn)用較多的一種方法，特別適用于很多中等分子量的樣品（分子量小于1，000的低揮發(fā)性樣品）的分離，尤其是脂溶性成分一一般不適用于高分子量樣品如蛋白質(zhì)、多糖或離子型親水住化合物等的分離。吸附層析的分離效果，決定于吸附劑、溶劑和被分離化合物的性質(zhì)這三個因素。1 吸附劑常用的吸附劑有硅膠、氧化鋁、活性炭、硅酸鎂、聚酰胺、硅藻土等。（1） 硅膠：層析用硅膠為一多孔性物質(zhì)，分子中具有硅氧烷的交鏈結(jié)構(gòu)，同時在顆粒表面又有很多硅醇基。硅膠吸附作用的強(qiáng)弱與硅醇基的含量多少有關(guān)。硅醇基能夠通過氫鍵的形成而吸附水分，因此硅膠的吸附力隨吸著的水分增加而降低。若吸水量超過17，吸附力極弱不能用作為吸附劑，但可作為分配層析中的支持劑。對硅膠的活化，當(dāng)硅膠加熱至100110時，硅膠表面因氫鍵所吸附的水分即能被除去。當(dāng)溫度升高至500時，硅膠表面的硅醇基也能脫水縮臺轉(zhuǎn)變?yōu)楣柩跬殒I，從而喪失了因氫鍵吸附水分的活往，就不再有吸附劑的性質(zhì)，雖用水處理亦不能恢復(fù)其吸附活性。所以硅膠的活化不宜在較高溫度進(jìn)行（一般在170cC以上即有少量結(jié)合水失去）。硅膠是一種酸性吸附劑，適用于中性或酸性成分的層析。同時硅膠又是一種弱酸性陽離子交換劑，其表面上的硅醇基能釋放弱酸性的氫離子，當(dāng)遇到較強(qiáng)的堿注化臺物，則可因離子交換反應(yīng)而吸附堿性化合物。（2）氧化鋁：氧化鋁可能帶有堿性（因其中可混有碳酸鈉等成分），對于分離一些堿性中草藥成分，如生物堿類的分離頗為理想。但是堿性氧化鋁不宜用于醛、酮、醋、內(nèi)酯等類型的化合物分離。因?yàn)橛袝r堿性氧化鋁可與上述成分發(fā)生次級反應(yīng)，如異構(gòu)化、氧化、消除反應(yīng)等。除去氧化鋁中絢堿性雜質(zhì)可用水洗至中性，稱為中性氧化鋁。中性氧化鋁仍屬于堿性吸附劑的范疇，本適用于酸性成分的分離。用稀硝酸或稀鹽酸處理氧化鋁，不僅可中和氧化鋁中含有的堿性雜質(zhì)，并可使氧化鋁顆粒表面帶有NO3一或CI一的陰離子，從而具有離于交換劑的性質(zhì)，適合于酸性成分的層析，這種氧化鋁稱為酸性氧化鋁。供層析用的氧化鋁，用于拄層析的，其粒度要求在100160目之間。粒度大子100目，分離效果差：小于160目，溶濃流速大慢，易使譜帶擴(kuò)散。樣品與氧化鋁的用量比，一般在1：2050之間層析柱的內(nèi)徑與柱長比例在1：10-20之向。在用溶劑沖洗柱時，流速不宜過快，洗脫液的流速一般以每半1小時內(nèi)流出液體的毫升數(shù)與所用吸附劑的重量（克）相等為合適。（3）活性炭：是使用較多的一種非極性吸附劑。一般需要先用稀鹽酸洗滌，其次用乙醇洗，再以水洗凈，于80干燥后即可供層析用。層析用的活性炭，最好選用顆?；钭⑻?，若為活性炭細(xì)粉，則需加入適量硅藻土作為助濾劑一并裝柱，以免流速太慢?；钚蕴恐饕矣诜蛛x水溶性成分，如氨基酸、糖類及某些甙?；钚蕴康挠袨槲阶饔?，在水溶液中最強(qiáng)，在有機(jī)溶劑中則較低弱。故水的洗脫能力最弱，而有機(jī)溶劑則較強(qiáng)。例如以醇-水進(jìn)行洗脫時，則隨乙醇濃度的遞增而洗脫力增加?；钚蕴繉Ψ枷阕寤衔锏奈搅Υ笥谥咀寤衔铮瑢Υ蠓肿踊衔锏奈搅Υ笥谛》肿踊衔?。利用這些吸附性的差別，可將水溶性芳香族物質(zhì)與脂肪族物質(zhì)分開，單糖與多糖分開，氨基酸與多肽分開。2溶劑層析過程中溶劑的選擇，對組分分離關(guān)系極大。在柱層析時所用的溶劑（單一劑或混合溶劑）習(xí)慣上稱洗脫劑，用于薄層或紙層析時常稱展開劑。洗脫劑的選擇，須根據(jù)被分離物質(zhì)與所選用的吸附劑性質(zhì)這兩者結(jié)合起來加以考慮在用極性吸附劑進(jìn)行層析時，當(dāng)被分離物質(zhì)為弱極性物質(zhì)，一般選用弱極性溶劑為洗脫劑；被分離物質(zhì)為強(qiáng)極性成分，則須選用極性溶劑為洗脫劑。如果對某一極性物質(zhì)用吸附性較弱的吸附劑（如以硅藻土或滑石粉代替硅膠），則洗脫劑的極性亦須相應(yīng)降低。在柱層操作時，被分離樣品在加樣時可采用于法，亦可選一適宜的溶劑將樣品溶解后加入。溶解樣品的溶劑應(yīng)選擇極性較小的，以便被分離的成分可以被吸附。然后漸增大溶劑的極性。這種極性的增大是一個十分緩慢的過程，稱為“梯度洗脫”，使吸附在層析柱上的各個成分逐個被洗脫。如果極性增大過訣（梯度太大），就不能獲得滿意的分離。溶劑的洗脫能力，有時可以用溶劑的介電常數(shù)（）來表示。介電常數(shù)高，洗脫能力就大。以上的洗脫順序僅適用于極性吸附劑，如硅膠、氧化鋁。對非極性吸附劑，如活性炭，則正好與上述順序相反，在水或親水住溶劑中所形成的吸附作用，較在脂溶性溶劑中為強(qiáng)。3被分離物質(zhì)的性質(zhì)被分離的物質(zhì)與吸附劑，洗脫劑共同構(gòu)成吸附層析中的三個要素，彼此緊密相連。在指定的吸附劑與洗脫劑的條件下，各個成分的分離情況，直接與被分離物質(zhì)的結(jié)構(gòu)與性質(zhì)有關(guān)。對極性吸附劑而言，成分的極性大，吸附住強(qiáng)。 當(dāng)然，中草藥成分的整體分子觀是重要的，例如極性基團(tuán)的數(shù)目愈多，被吸附的住能就會更大些，在同系物中碳原子數(shù)目少些，被吸附也會強(qiáng)些?？傊?，只要兩個成分在結(jié)構(gòu)上存在差別，就有可能分離，關(guān)鍵在于條件的選擇。要根據(jù)被分離物質(zhì)的性質(zhì)，吸附劑的吸附強(qiáng)度，與溶劑的性質(zhì)這三者的相互關(guān)系來考慮。首先要考慮被分離物質(zhì)的極性。如被分離物質(zhì)極性很小為不含氧的萜烯，或雖含氧但非極性基團(tuán)，則需選用吸附性較強(qiáng)的吸附劑，并用弱極性溶劑如石油醚或苯進(jìn)行洗脫。但多數(shù)中藥成分的極性較大，則需要選擇吸附性能較弱的吸附劑（一般級）。采用的洗脫劑極性應(yīng)由小到大按某一梯度遞增，或可應(yīng)用薄層層析以判斷被分離物在某種溶劑系統(tǒng)中的分離情況。此外，能否獲得滿意的分離，還與選擇的溶劑梯度有很大關(guān)系?，F(xiàn)以實(shí)例說明吸附層析中吸附劑、洗脫劑與樣品極性之間的關(guān)系。如有多組分的混合物，象植物油脂系由烷烴、烯烴、舀醇酯類、甘油三酸醋和脂肪酸等組份。當(dāng)以硅膠為吸附劑時，使油脂被吸附后選用一系列混合溶劑進(jìn)行洗脫，油脂中各單一成分即可按其極性大小的不同依次被洗脫。 又如對于C-27甾體皂甙元類成分，能因其分字中羥基數(shù)目的多少而獲得分離：將混合皂甙元溶于含有5氯仿的苯中，加于氧化鋁的吸附柱上，采用以下的溶劑進(jìn)行梯度洗脫。如改用吸附性較弱的硅酸鎂以替代氧化鋁，由于硅酸鎂的吸附性較弱，洗脫劑的極牲需相應(yīng)降低，亦即采用苯或含5氯仿的苯，即可將一元羥基皂甙元從吸附劑上洗脫下來。這一例子說明，同樣的中草藥成分在不同的吸附劑中層析時，需用不同的溶劑才能達(dá)到相同的分離效果，從而說明吸附劑、溶劑和欲分離成分三者的相互關(guān)系。硅膠 基本信息 名稱：硅膠 英文名稱：Silicon dioxide , Slicone rubber 英文別名：Silica gel; Silica 分子式：mSiO2 nH2O 分子量：60.08 CAS 登錄號：CAS# 112926-00-8 EINECS 登錄號：231-545-4 密度：2.6 詞語解釋: 透明或乳白色粒狀固體。具有開放的多孔結(jié)構(gòu),吸附性強(qiáng),能吸附多種物質(zhì)。如吸收水分,吸濕量約達(dá)40%。如加入氯化鈷,干燥時呈藍(lán)色,吸水后呈紅色?？稍偕磸?fù)使用。 一般來說，硅膠按其性質(zhì)及組分可分為有機(jī)硅膠和無機(jī)硅膠兩大類。 無機(jī)硅膠是一種高活性吸附材料，通常是用硅酸鈉和硫酸反應(yīng)，并經(jīng)老化、酸泡等一系列后處理過程而制得。硅膠屬非晶態(tài)物質(zhì)，其化學(xué)分子式為mSiO2 nH2O。不溶于水和任何溶劑，無毒無味，化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，除強(qiáng)堿、氫氟酸外不與任何物質(zhì)發(fā)生反應(yīng)。各種型號的硅膠因其制造方法不同而形成不同的微孔結(jié)構(gòu)。硅膠的化學(xué)組份和物理結(jié)構(gòu)，決定了它具有許多其它同類材料難以取代的特點(diǎn)：吸附性能高、熱穩(wěn)定性好、化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定、有較高的機(jī)械強(qiáng)度等。硅膠比表面積研究是非常重要