「氨基酸的紙層析」.doc

氨基酸的紙層析一、 實(shí)驗?zāi)康?、 了解紙層析法的使用原理。2、掌握用紙層析法分離蛋白質(zhì)的操作步驟。 二、 實(shí)驗原理1、 紙層析法是以濾紙作為惰性支持物的分配層析方法，濾紙上的纖維具有羥基，是親水基團(tuán)，濾紙吸附水作為固定相，其上流經(jīng)的有機(jī)溶劑即展層劑作為流動相。當(dāng)展層劑流經(jīng)固定相時，固定相上的樣品由于親水、疏水能力不同，在兩相之間不斷分配，疏水能力強(qiáng)的多溶于流動相，隨流動相移動距離較遠(yuǎn)，親水能力強(qiáng)的移動距離則較近。2、 所有的氨基酸的碳上均連接一個氫原子和兩個親水基團(tuán)羧基（COOH）與氨基（NH2），唯一的不同則在于R基團(tuán)。因此R基團(tuán)在氨基酸的親水疏水能力對比中起到了決定性的作用。本實(shí)驗采用脯氨酸、甘氨酸，苯丙氨酸，組氨酸，其親水疏水能力迥異，能在濾紙上明顯分開。 分配系數(shù)K=溶質(zhì)在固定相中的濃度/溶質(zhì)在流動相中的濃度3、 Rf值表示原點(diǎn)中心至顯色斑點(diǎn)中心的距離與原點(diǎn)中心至流動相前沿的距離比。在一定條件下，Rf值為定值，其影響的因素有物質(zhì)本身的性質(zhì)，溶劑的性質(zhì)，PH值，溫度，濾紙的性質(zhì)等等，本實(shí)驗不予探究。在測量原點(diǎn)中心至顯色斑點(diǎn)中心的距離時，由于斑點(diǎn)的形狀不規(guī)范（近似圓形），所以，一般取斑點(diǎn)的重心，測量出重心與起點(diǎn)的距離即可。4、 顯色原理：茚三酮在弱堿性溶液中與氨基酸共熱，引起氨基酸氧化脫氧，脫羧反應(yīng)，最后茚三酮與反應(yīng)產(chǎn)物氨和還原茚三酮發(fā)生作用生成紫色物質(zhì)。三、 試劑1. 酸性層析液：正丁醇：88% 甲酸：水=15：3：22. 顯色儲備液：0.4mol/L茚三酮異丙醇：甲酸：水=20：1：53. 標(biāo)準(zhǔn)氨基酸溶液（6mg/ml，苯丙氨酸Phe、甘氨酸Gly、脯氨酸Pro、組氨酸His）4. 未知樣品液：上述四種氨基酸中的一種或幾種混合液（每組任選一樣品）四、 實(shí)驗儀器樣品管 毛細(xì)吸管層析缸 100ml量筒50ml燒杯 膠頭滴管 移液管 濾紙：15cm*15cm *1 鉛筆 直尺 保鮮膜 細(xì)玻璃棒 電吹風(fēng) 薄膜手套五、 操作步驟 （一）展層劑和平衡溶劑的配制 1在100ml燒杯中按照體積比 正丁醇：88%甲酸：蒸餾水=15：3：2的比例配制展層劑，建議為45ml：9ml：6ml。 2取1ml顯色貯備液混于展層劑中 3將混合好的液體放于層析缸中，混勻密閉，靜置（展層缸洗凈后應(yīng)除去多余的水，否則會影響展層溶劑的比例而影響展層。 （二）點(diǎn)樣（點(diǎn)樣操作應(yīng)戴上手套，防止樣品和濾紙受污染）1實(shí)驗臺上鋪好保鮮膜，保鮮膜下面可以蘸少量水，使得保鮮膜能與實(shí)驗臺面緊密貼合，此后所有操作都在保鮮膜上進(jìn)行，不再贅述。2在距平行于15cm長的邊2cm處用鉛筆輕輕描出一條直線，此為展層起點(diǎn)線，在直線中間每隔2.53cm用鉛筆輕輕點(diǎn)一個點(diǎn)，共點(diǎn)6個點(diǎn)。 3將毛細(xì)管的一端在酒精燈外焰上灼燒36s，毛細(xì)管管口變細(xì)即可。 4用毛細(xì)管分別蘸取四個氨基酸標(biāo)準(zhǔn)液和待測液，點(diǎn)樣于展層起點(diǎn)線的六個點(diǎn)上。點(diǎn)完一次后，用電吹風(fēng)冷風(fēng)吹干，再點(diǎn)第二次樣。每次點(diǎn)樣均要求斑點(diǎn)半徑（一般直徑不超過5mm）。 5在標(biāo)準(zhǔn)樣下面用鉛筆做好標(biāo)記，記錄該點(diǎn)的氨基酸名稱。（三）平衡及展層 1將點(diǎn)好樣的濾紙兩側(cè)邊緣對齊但不接觸，卷成筒形，并用訂書機(jī)訂34次，將圓筒固定。 2將圓筒豎直放入層析缸中，濾紙勿與缸壁接觸，蓋上蓋子（點(diǎn)樣點(diǎn)的一端在下，展層劑液面需低于點(diǎn)樣線1cm左右） 3待溶劑前沿線距濾紙末端12cm（展層長度10cm，約2小時）時取出濾紙（需戴上手套）用鉛筆將前沿線作一標(biāo)記。剪去縫合線，電吹風(fēng)熱風(fēng)吹干（通風(fēng)櫥進(jìn)行），即可見層析斑點(diǎn)。 （四）顯色及Rf值計算 1取出烘完的濾紙，估計出斑點(diǎn)的重心，并用鉛筆輕輕點(diǎn)出。 2用直尺測量出斑點(diǎn)中心到展層起點(diǎn)線的距離以及展層液跑出的距離，計算Rfx=（x=1，26）3將混合樣分離出的斑點(diǎn)的Rf值與標(biāo)準(zhǔn)樣的進(jìn)行對比，從而認(rèn)清各斑點(diǎn)的氨基酸種類，并在濾紙上標(biāo)明。 六、 注意事項1. 實(shí)驗全程戴一次性薄膜手套，全套實(shí)驗在鋪在實(shí)驗臺上的薄膜上進(jìn)行。原因：人的皮膚上含有含氮化合物，而實(shí)驗臺上可能未洗干凈殘留其他氨基酸，會沾染到濾紙上，對實(shí)驗產(chǎn)生影響；保鮮膜可以與鐘罩邊緣進(jìn)行更緊密的結(jié)合，是平衡效果更好。2. 用毛細(xì)吸管進(jìn)行點(diǎn)樣時，為保證點(diǎn)樣半徑足夠小，應(yīng)使毛細(xì)管內(nèi)的液體高度低于1cm，迅速的點(diǎn)在濾紙上。若管內(nèi)液體過高，可以先將毛細(xì)管的液體點(diǎn)一部分于干凈的衛(wèi)生紙上，降低管內(nèi)液體高度。3. 在通過移液管添加展層劑時，液體應(yīng)緩慢放出，避免濺射到濾紙上，移液管拿出時也應(yīng)該注意不要碰觸濾紙。4. 展層開始時不要使樣品浸入展層劑中。5. 吹風(fēng)機(jī)吹干時切記用冷風(fēng)吹干，以免溫度過高使氨基酸變性。七實(shí)驗結(jié)果 樣品號：A06Rf（Pro）=4.1/9.90.414Rf（Phe）=6.45/10=0.645Rf（Gly）=2.40/10.10.237Rf（His）=1.60/10.40.154Rf（6上）=7.20/10.60.679Rf（6中）=4.70/10.60.443Rf（6下）=2.60/10.60.245Rf（7上）=7.30/10.50.695Rf（7中）=4.70/10.50.447Rf（7下）=2.80/10.50.267樣品中含有的成分是脯氨酸、苯丙氨酸和甘氨酸誤差分析：