分子克隆實驗指南.doc

連接經(jīng)驗分享來源：作者：基因時代時間：08-07-13 點擊： 做了快一年的分子克隆，犯了很多錯誤，經(jīng)歷了很多坎坷，也學到了很多東西。分子克隆過程中出現(xiàn)問題最多的大概就是連接了，大家抱怨的也最多，我也陷入在個步驟上很久。經(jīng)過長時間的摸索我在連接這個問題上有一些體會，在這里跟大家分享一下我的經(jīng)驗，以供和我一樣陷入困境及剛開始做克隆的同學參考。關(guān)于連接的提問多集中在連接的體系、DNA的用量、vector和insert的比例、連接酶等。但是我認為，連接不成功，問題并不一定出在連接這步上。有很多環(huán)節(jié)影響連接的成敗，如酶切的好不好、回收的質(zhì)量好壞、連接時的濃度或比例、感受態(tài)等。以下我詳細說明。1，PCR引物的設(shè)計。通俗的不說，需要指出的是設(shè)計引物時一定要考慮切點的甲基化問題。做普通的克隆會涉及到甲基化形式有兩種：dam甲基化和dcm甲基化。常用的大腸桿菌都有這兩種甲基化酶。dam甲基化酶識別GATC位點并甲基化；dcm甲基化酶識別CCWGG位點（W是A或T）并甲基化。如果有這兩種位點那么多數(shù)情況內(nèi)切酶是切不開了。容易受甲基化影響的內(nèi)切酶有：Dpn1（GA/TC）天生就甲基化；Cla1（ATC/GAT）如果前面加個G或后面加個C那么恭喜你，dam甲基化；Xba1（T/CTAGA）如果前面加個GA或后面加個TC也是dam甲基化，等等有好多。這些容易甲基化的切點設(shè)計引物時一定要注意，避免引入甲基化位點。如果真是避免不了或者后來才發(fā)現(xiàn)問題，那么把甲基化的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到甲基化酶缺陷型大腸桿菌中再提質(zhì)粒就沒有甲基化，可以切了。甲基化缺陷型菌有：DM1（Invitrogen）、INV110（invitrogen）、JM110等。2，PCR產(chǎn)物。兩種方式：一種純化后直接酶切連接；一種連T載體再往下切連接。我個人強烈建議第二種，連T載體。因為PCR產(chǎn)物直接酶切我覺得有兩個缺點：由于兩頭把手太短，雖說有保護堿基，但我覺得還是不如從質(zhì)粒上往下切好切，而且容易切壞、切碎；無法從電泳上看出來切沒切開，因為也就切下了幾個十幾個bp，帶形沒啥變化。連T載體的優(yōu)點：進載體后，大提一次的質(zhì)?？鋸堻c說夠用一輩子的，不用總PCR往出調(diào)了，再說PCR那東西還不太穩(wěn)定，一把多一把少的。酶切會很清晰，切下來了就是有帶，沒切動就是沒有，沒連上也能知道不是沒切開而是別的步驟有問題。連T載體也有些麻煩的地方，如需要的切點有時跟T載體上自帶的切點沖突，這就要小心鑒別；而且連T載體最好測序看一下PCR的產(chǎn)物對不對、切點對不對?？傮w來講連T載體是很有優(yōu)勢的。3，提質(zhì)粒。有時手工小提或粗提的質(zhì)粒酶切效果不好，這可能是提取的不夠純或者內(nèi)切酶品質(zhì)不好。所以若酶切效果不佳建議用柱子精提或大提。4，酶切。用于連接的酶切很關(guān)鍵。需注意如下幾點：如果是雙酶切A和B，預實驗中必須做A和B各自的單酶切和A+B的雙酶切,好確認這幾種酶都好用，質(zhì)粒上的切點都好用。如果切不開就要考慮是不是酶的問題，buffer的問題，質(zhì)粒上有沒有這些切點，序列是否甲基化等。酶切盡量用大體系，如50ul、100ul等。大體系能稀釋內(nèi)切酶包裝中的甘油，對反應有利。相反，連接盡量用小體系，以增加DNA末端的碰撞機會。如果要回收、連接，酶切用的DNA量我的經(jīng)驗是不用太大。大了會切碎，形成一些不規(guī)則的末端，不利于連接。酶切后的電泳，即切膠的那次電泳中，如果切成的條帶很清晰，不拖泥帶水，沒有彌散，沒有拖尾，那做回收、連接效果最好。相反，若有彌散、拖尾、不清楚、一團亮等情況就是切的不好，做后續(xù)實驗成功率會降低。若真是效果很差建議改進體系重新切。5，回收?；厥湛梢杂弥皆噭┖谢蚴止しāＶ交厥赵噭┖校捍祟愒噭┖羞m合各種長度DNA，對黏性末端基本沒有破壞，回收效率也不錯。手工醇沉法步驟如下，把切得的膠弄碎，用Tris-HCl浸泡一段時間，吸出所有的液體，用酚抽提一遍，氯仿抽提一遍，加鹽和醇醇沉，沉淀用70乙醇漂洗，再用Tris溶解。次方法優(yōu)點是對DNA和黏性末端的損傷最小，缺點是容易損失DNA。若本來DNA數(shù)量就不多，用手工法很容易丟失殆盡；如果DNA量很大可以考慮使用?；厥蘸笠娪荆粊砉浪慊厥找簼舛?，二來看回收DNA的質(zhì)量。若條帶有彌散，即自目的條帶以下有拖痕，不是清晰利落的一條帶，則質(zhì)量不好。因為條帶拖痕表示它已碎裂成比它小的各種長度的片段，而主帶雖然還在那個位置但也已遭到一定程度的破壞。質(zhì)量不好的回收產(chǎn)物做連接成功率會降低，假陽性克隆會增加。造成回收質(zhì)量差的原因可能是回收這步，也可能是酶切那步，如果酶切那步出現(xiàn)酶切所描述的情況，就容易造成回收質(zhì)量不好。只有回收到清晰、利索的條帶，才不影響連接。6，感受態(tài)。做連接要求感受態(tài)的效率要高。感受態(tài)的感受效率一般剛制備完時是最高的，以后逐漸減弱，而且每次開80冰箱溫度微升對感受態(tài)效率都有一定影響，久而久之效率就不行了，這就要求大家取感受態(tài)時動作迅速、最大程度減少感受態(tài)盒升溫。都知道感受態(tài)效率高好，但麻煩的是感受態(tài)效率的高低不好通過實驗來檢測，因為若通過轉(zhuǎn)質(zhì)粒來檢測，只要是效率中等的感受態(tài)都能長出很多克隆。所以如果你們的感受態(tài)已經(jīng)儲存了很長時間或者連接長的克隆連續(xù)幾把都太少就要重做感受態(tài)了。制備感受態(tài)不推薦新手直接去做，最好由經(jīng)驗豐富者做或他帶你做。用新做的感受態(tài)轉(zhuǎn)質(zhì)粒，用同樣手法用量，你會發(fā)現(xiàn)比舊感受態(tài)明顯多長很多克隆。7，連接。最后才輪到連接。連接的問題討論的是比較多的。如果前述若干步驟所得產(chǎn)物質(zhì)量好，連接不會很難。DNA的量：DNA總量有幾十ng就能連接成。當然如果你的DNA質(zhì)量好，DNA用量越大連接效率越高。就怕你為了追求DNA數(shù)量而降低了質(zhì)量，那可就得不償失了。vector和insert的比例：如果insert不長（2kb以下）、vector是insert的幾倍長，可以用1：31：9。如果insert較長（3、4kb以上）、vector和insert長度相似或insert比vector還長，可以用1：11：3。短片段的連接相對容易，做的好可以挑到好多正確的克隆。長片段的連接效率較低，陽性克隆率小于等于10是很正常的。我做過一個長片斷的連接，6k的vector、6k的insert，比例用1：1，挑了20個克隆有一個對。體系體積：通常用20ul都能連上，若連長片段可以壓縮成10ul（前提是DNA數(shù)量不變）。我覺得體系不是很關(guān)鍵，有位很精通克隆的老師說他都用50ul體系，照樣百發(fā)百中。而且如果你的DNA是用EB（即Tris）溶解的，體系中不加水也行。前述我自己連的長片段也是用20ul體系，vector和insert各上8ul。T4連接酶：酶這東西自然是越貴越好，一分錢一分貨，而且連接酶控制著整個分子克隆過程的瓶頸連接，強烈建議買好的。我用過Promega的，還好；BBI的湊合用。如果連長片段就加二倍的連接酶。連接時間：過夜。過夜就應該足夠了，但是你要是不急著轉(zhuǎn)化放到4度放幾天也行，我個人認為時間長只好不壞。連接溫度：最適是16。有人用PCR儀造16，我用泡沫冰盒加涼水再添冰，用手感覺差不多十四五六度，然后蓋蓋過夜，基本上溫度不太變。你若感覺好不溫度，拿個溫度計測也行。有人用4度連接，也行，我有時先16度過夜，再放4度里幾天。轉(zhuǎn)化：連接的轉(zhuǎn)化不能像轉(zhuǎn)質(zhì)粒那么隨便，要小心翼翼，盡量作到不放棄任何一個菌。一般所用的感受態(tài)體積最少是連接體系的5倍。長片段的連接轉(zhuǎn)化時搖菌2小時。對照：對照很關(guān)鍵，可以反應出很多重要的信息，不要懶，你的連接若是問題不少，就要乖乖的做對照。一般有如下幾種對照方式：轉(zhuǎn)化質(zhì)粒對照。和連接產(chǎn)物同樣抗性、一起轉(zhuǎn)化、涂在同一個板上。這個對照目的是檢測轉(zhuǎn)化系統(tǒng)是否有效，即抗生素是否有效、板子是否有效、轉(zhuǎn)化的手法是否正確、以及感受態(tài)的效率如何（這需要你每次轉(zhuǎn)化質(zhì)粒都用相同的手法、用量，看長的菌落數(shù)，若明顯太少就要懷疑感受態(tài)）。還有一個作用，如果質(zhì)粒早就長出來了，都長挺大了你的連接產(chǎn)物還沒動靜呢，那八成是沒戲了，別等了趕快去準備下次連接的材料吧。切完回收的vector直接轉(zhuǎn)化對照。如果你是雙酶切，切完的vector和沒切的vector的長度相差不大，或跑電泳這兩種跑不很開，就要做這個對照。目的是看切的是否徹底，是否還有環(huán)狀質(zhì)粒存在。長不出克隆是對的，若長出克隆，好好改進你的酶切系統(tǒng)吧。切完回收的vector加連接酶自身連接再轉(zhuǎn)化做對照。雙酶切的，最好要做這個對照，而且這個對照長的克隆要挑若干提質(zhì)粒。一、若切完的目的vector和沒切的vector的長度相差較大，電泳條帶離的遠，這個對照能檢測酶切和回收的質(zhì)量。如果DNA末端遭破壞或斷裂，會隨機產(chǎn)生各種末端，這些末端少數(shù)能連接到一起，長度上小于等于回收的vector。二、若切完的vector和沒切的vector的長度相差不大，這個對照除了檢測“一”中所說的還檢測是否有只進行了單酶切的?？傊婚L克隆或只長很少是對的，長多了還是去改進上游的步驟吧。如果上面的各步都注意到了而且做的很好，那成功率會較高，但也不能保證一次成功。在確保各步驟產(chǎn)物質(zhì)量都不錯