臺州市科技計(jì)劃項(xiàng)目申請表.doc

臺州市科技計(jì)劃項(xiàng)目申請表項(xiàng)目名稱：姜黃素對子宮肌瘤細(xì)胞增殖和凋亡的影響項(xiàng)目類別：重點(diǎn)科研項(xiàng)目申請單位：浙江省臺州醫(yī)院路橋院區(qū) （蓋章）申請日期：2011年4月 3日臺州市科技局二六年制臺州市科技計(jì)劃項(xiàng)目申請表一、項(xiàng)目情況項(xiàng)目名稱姜黃素對子宮肌瘤細(xì)胞增殖和凋亡的影響項(xiàng)目類別1項(xiàng)目行業(yè)分類3項(xiàng)目技術(shù)來源1開始日期2011年6月完成日期2012年12月項(xiàng)目經(jīng)費(fèi)預(yù)算（萬元）總計(jì)其他3.0自籌銀行貸款向市科技局申請部門配套其他1.01.01.0項(xiàng)目經(jīng)費(fèi)開支預(yù)算（萬元）設(shè)備費(fèi)能 源材料費(fèi)試 驗(yàn)外協(xié)費(fèi)資 料印刷費(fèi)會議及調(diào)研費(fèi)0.0500租賃費(fèi)鑒 定驗(yàn)收費(fèi)人員經(jīng)費(fèi)管理費(fèi)其他費(fèi)用050.30預(yù)計(jì)經(jīng)濟(jì)效益年增產(chǎn)值（萬元）年增利潤（萬元）年增稅金（萬元）年創(chuàng)匯（萬美元）年節(jié)匯（萬美元）預(yù)計(jì)其他成果論文數(shù)專利其中發(fā)明專利4-5篇說明：項(xiàng) 目 類 別：1、科研 2、新產(chǎn)品 3、推廣 4、星火 5、專項(xiàng) 6、軟科學(xué)項(xiàng)目行業(yè)分類：1、工業(yè) 2、農(nóng)業(yè) 3、社會發(fā)展技 術(shù) 來 源：1、自有技術(shù) 2、產(chǎn)學(xué)研聯(lián)合開發(fā)技術(shù) 3、國內(nèi)其他單位技術(shù) 4、引進(jìn)技術(shù)本企業(yè)消化創(chuàng)新 5、國外技術(shù)二、承擔(dān)單位第一申請單位單位名稱浙江省臺州醫(yī)院路橋院區(qū) 詳細(xì)地址臺州市路橋區(qū)下里橋路1號單位類型事業(yè)單位聯(lián)系人羅利飛聯(lián)系電政編碼318050開戶銀行路橋工行銀行帳號6222001207100874928主管部門臺州市衛(wèi)生局其他合作單位序號單位名稱職責(zé)1臺州市第一人民醫(yī)院22345678說明：職責(zé)：1、承擔(dān)，2、參加三、項(xiàng)目負(fù)責(zé)人及項(xiàng)目組成員項(xiàng) 目負(fù)責(zé)人姓 名羅利飛聯(lián)系電-身份證號 歷本科學(xué)位學(xué)士專業(yè)技術(shù)職務(wù)主管技師專業(yè)醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)在本項(xiàng)目中的分工項(xiàng)目負(fù)責(zé)工作單位浙江省臺州醫(yī)院路橋院區(qū)項(xiàng)目組成 員序號姓 名出生年月專業(yè)技術(shù)職務(wù)工作單位在本項(xiàng)目中分工1凌杰1976.5主管技師臺州市第一人民醫(yī)院項(xiàng)目設(shè)計(jì)2汪官富1966.10副主任醫(yī)師臺州醫(yī)院實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)3陸如岳1975.5副主任技師臺州醫(yī)院實(shí)驗(yàn)測定4韓子華1975.3主治醫(yī)師臺州醫(yī)院標(biāo)本收集5童靜玲1976.10主管藥師臺州醫(yī)院分析指導(dǎo)四、主要研究內(nèi)容和要達(dá)到的主要技術(shù)、經(jīng)濟(jì)指標(biāo)主要研究內(nèi)容：l應(yīng)用膠原酶消化法分離獲得子宮肌瘤細(xì)胞并體外培養(yǎng)。通過免疫組化的方法鑒定培養(yǎng)的細(xì)胞為子宮肌瘤細(xì)胞。觀察姜黃素對子宮肌瘤細(xì)胞增殖的影響：10、20、40 u molL姜黃素分別處理子宮肌瘤細(xì)胞24h后，應(yīng)用MTT比色法檢測不同濃度姜黃素對子宮肌瘤細(xì)胞增殖能力的影響2. 研究姜黃素對子宮肌瘤細(xì)胞誘導(dǎo)凋亡的作用：光鏡觀察對照組和實(shí)驗(yàn)組子宮肌瘤細(xì)胞的生長情況、形態(tài)學(xué)改變，原位末端TdT酶標(biāo)記技術(shù)(TUNEL)檢測姜黃襲誘導(dǎo)子宮肌瘤細(xì)胞凋亡的作用。3. 探討姜黃索誘導(dǎo)子宮肌瘤細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制：采用逆轉(zhuǎn)錄一聚合酶鏈反應(yīng)(RTPCR)及蛋白質(zhì)印跡法，檢測姜黃素對子宮肌瘤細(xì)胞Transgelin基因mRNA及蛋白的表達(dá)的情況。為子宮肌瘤的臨床診斷和治療提供新的思路和依據(jù)。要達(dá)到的主要技術(shù)和經(jīng)濟(jì)指標(biāo)：1 應(yīng)用膠原酶消化法分離獲得子宮肌瘤細(xì)胞并體外培養(yǎng)。（通過免疫組化的方法鑒定培養(yǎng)的細(xì)胞為子宮肌瘤細(xì)胞。）2 發(fā)現(xiàn)姜黃素對子宮肌瘤細(xì)胞的生長發(fā)展有明顯的抑制作用，且隨藥物濃度的升高該抑制作用明顯增強(qiáng)，呈劑量依賴性；且子宮肌瘤細(xì)胞Transgelin基因mRNA及蛋白的表達(dá)增加，這種作用可能通過調(diào)控Transgelin基因mRNA及蛋白表達(dá)作為機(jī)制之一來發(fā)揮作用的；姜黃素有治療子宮肌瘤的潛能。3 通過本研究為姜黃素等中藥成分的抗腫瘤機(jī)理研究提供一個新的途徑，同時(shí)為姜黃素的臨床應(yīng)用提供科學(xué)的理論依據(jù)。4 通過本研究為子宮肌瘤的臨床診斷和治療提供新的思路和依據(jù)，具有潛在的經(jīng)濟(jì)和社會效益。5 擬SCI收錄或發(fā)表中華級論文35篇。（以上內(nèi)容的簡要說明，字?jǐn)?shù)250字左右，此欄必填。）本研究應(yīng)用膠原酶消化法分離獲得子宮肌瘤細(xì)胞并體外培養(yǎng)。觀察姜黃素對子宮肌瘤細(xì)胞增殖的影響：10、20、40 u molL姜黃素分別處理子宮肌瘤細(xì)胞24h后，應(yīng)用MTT比色法檢測不同濃度姜黃素對子宮肌瘤細(xì)胞增殖能力的影響。檢測姜黃素對子宮肌瘤細(xì)胞Transgelin基因mRNA及蛋白的表達(dá)的情況。了解姜黃素是否有治療子宮肌瘤的潛能。以期為子宮肌瘤的臨床診斷和治療提供新的思路和依據(jù)。五、計(jì)劃進(jìn)度目標(biāo)起始年月進(jìn)度目標(biāo)要求（每欄限80字）2011年6月-2011年9月收集相關(guān)臨床資料和標(biāo)本，分離獲得子宮肌瘤細(xì)胞并體外培養(yǎng)。2011年9月-2012年6月觀察姜黃素對子宮肌瘤細(xì)胞增殖的影響，檢測姜黃素對子宮肌瘤細(xì)胞的影響下Transgelin基因mRNA及蛋白的表達(dá)情況。2012年6月-2012年12月總結(jié)分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果，撰寫課題論文，課題鑒定六、審查意見縣（市、區(qū)）科技局或市級主管部門審查意見：負(fù)責(zé)人簽字：2011年4月18日單位（蓋章）臺州市科技局審查意見：負(fù)責(zé)人簽字：2011年3月18日單位（蓋章）臺州市科技計(jì)劃項(xiàng)目可行性報(bào)告項(xiàng)目名稱：姜黃素對子宮肌瘤細(xì)胞增殖和凋亡的影響項(xiàng)目類別：重點(diǎn)科研項(xiàng)目申請單位：浙江省臺州醫(yī)院路橋院區(qū) （蓋章）申請日期：2011年 4月 17 日臺州市科技局二六年制一、 立項(xiàng)的背景和意義子宮平滑肌瘤(Uterine leiomyoma)又稱纖維肌瘤(Fibromyoma)，是女性生殖器官中最常見的良性腫瘤，由子宮平滑肌組織增生而成，是多個因素聯(lián)合作用的結(jié)果，其確切的病因和發(fā)病機(jī)制目前尚未明確1-2。子宮肌瘤因生長部位、數(shù)目和大小不同可見不同的癥狀，如腹部包塊、子宮異常出血、下腹痛、不孕、流產(chǎn)、鄰近器官壓迫癥狀等，有23肌瘤患者可沒有明顯癥狀，往往是通過體檢偶爾發(fā)現(xiàn)3，子宮肌瘤也是導(dǎo)致子宮切除的主要原因之一。給患者帶來了嚴(yán)重的身心健康影響。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，從子宮肌層細(xì)胞到肌瘤形成的過程是多因素，多步驟的，涉及正常子宮肌層的體細(xì)胞突變，性激素及生長因子間復(fù)雜的相互作用4-7，如：基因編碼位于細(xì)胞染色體斷裂點(diǎn)的簇集區(qū)的HMGIC的異常表達(dá)8,9；應(yīng)用促性腺激素釋放激素激動劑(gonadotrophin releasing hormone agonist，GnRHa)抑制機(jī)體的雌孕激素水平后，肌瘤的形態(tài)為細(xì)胞收縮和失去膠原纖維結(jié)構(gòu)，也未觀察到明顯的細(xì)胞結(jié)構(gòu)的破壞。停用GnRHa后，下丘腦一垂體一卵巢軸的功能恢復(fù)，肌瘤反彈10，說明肌瘤的形成并非單純由卵巢激素決定，是和多種細(xì)胞因子等綜合因素共同作用的結(jié)果。Transgelin基因作為具有轉(zhuǎn)型變異及形狀改變敏感性的肌動蛋白凝膠蛋白被首次發(fā)現(xiàn)，被認(rèn)為是血管平滑肌細(xì)胞(vascular smooth muscle cells，VSMC)的標(biāo)志基因，廣泛存在于雞和哺乳動物平滑肌組織中，并且其定位于細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)。Transgelin基因被認(rèn)為與子宮肌瘤的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)11。 姜黃素（curcumin,Cur）是從姜黃、郁金和莪術(shù)等植物的根莖中提取的一種酚類色素，現(xiàn)已有純度高達(dá) 99姜黃素作為成品化合物出售。幾個世紀(jì)以來，一直被用作食物調(diào)料的姜、咖喱和芥末里均含有姜黃素，在傳統(tǒng)醫(yī)藥里，姜黃素常常被用來治療炎癥性疾病12。姜黃素毒性小，能有效的治療胃炎和潰瘍，還具有抗腫瘤的潛能，能夠抑制化學(xué)物質(zhì)誘導(dǎo)的皮膚癌、食管癌和十二指腸癌13,14。近年來多應(yīng)用于抗腫瘤研究。其抗腫瘤機(jī)制包括：清除氧自由基、抑制腫瘤細(xì)胞生長、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡和抑制腫瘤血管生成等，有學(xué)者研究證實(shí)姜黃素體外實(shí)驗(yàn)可以干預(yù)IGF-1 相關(guān)信號通路，抑制腫瘤細(xì)胞生長，促使腫瘤細(xì)胞凋亡15。天然藥物成分越來越多地提取純化用于攻克腫瘤，病毒性疾?。ㄒ腋巍滩〉龋┑雀鞣N難治性疾病。新的研究也讓傳統(tǒng)醫(yī)藥再次煥發(fā)魅力，對中草藥的有效成份的提取方興未艾，激起了學(xué)者們極大的興趣。姜黃素便是其中一個例證，不僅能夠抗氧化減少自由基，減輕炎癥病變、促使腫瘤細(xì)胞凋亡和抑制血管生長。但姜黃素對子宮肌瘤的影響及機(jī)制研究未見報(bào)道，姜黃素是否可以用來治療子宮肌瘤，能否抑制子宮肌瘤發(fā)生發(fā)展癌變,機(jī)制如何？值得我們探索研究。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用膠原酶消化法分離獲得子宮肌瘤細(xì)胞并體外培養(yǎng)。通過免疫組化方法鑒定培養(yǎng)的細(xì)胞為子宮肌瘤細(xì)胞。觀察姜黃素對子宮肌瘤細(xì)胞增殖的影響：10、20、40umolL姜黃素分別處理子宮肌瘤細(xì)胞24h后，應(yīng)用MTT比色法檢測不同濃度姜黃素對子宮肌瘤細(xì)胞增殖能力的影響光鏡觀察對照組和實(shí)驗(yàn)組子宮肌瘤細(xì)胞的生長情況、形態(tài)學(xué)改變，原位末端TdT酶標(biāo)記技術(shù)(TUNEL)檢測姜黃襲誘導(dǎo)子宮肌瘤細(xì)胞凋亡的作用。采用逆轉(zhuǎn)錄一聚合酶鏈反應(yīng)(RTPCR)及蛋白質(zhì)印跡法，檢測姜黃素對子宮肌瘤細(xì)胞Transgelin基因mRNA及蛋白的表達(dá)的情。以期為子宮肌瘤的臨床診斷和治療提供新的思路和依據(jù)。二、 國內(nèi)外研究現(xiàn)狀和發(fā)展趨勢（包括國內(nèi)外研究現(xiàn)狀分析、當(dāng)前需要解決的主要問題等） 子宮平滑肌瘤是女性生殖器官中最常見的良性腫瘤，發(fā)病率高，有的嚴(yán)重影響婦女的身心健康。子宮肌瘤的發(fā)病機(jī)理以及發(fā)生發(fā)展的分子生物學(xué)機(jī)制現(xiàn)在尚不清楚。目前認(rèn)為從子宮肌層細(xì)胞到肌瘤形成的轉(zhuǎn)化過程可能涉及正常子宮肌層的體細(xì)胞突變，性激素及生長因子間復(fù)雜的相互作用。長期以來，在子宮肌瘤的發(fā)生機(jī)制的研究中，雌激素一直被認(rèn)為是子宮肌瘤發(fā)生和發(fā)展的促進(jìn)劑16,17。且目前對子宮肌瘤的治療中西藥治療均未取得滿意療效，手術(shù)切除子宮是最終采用的主要手段，但由此給女性身心健康帶來諸多不良影響。姜黃素(curcumin)是從我國傳統(tǒng)中藥姜黃根莖中提取的一種植物多酚?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，姜黃素具有抗氧化、抗突變、抗腫瘤等多方面的藥理作用，體外實(shí)驗(yàn)及動物實(shí)驗(yàn)證實(shí)，姜黃素可以在多個靶點(diǎn)抑制腫瘤細(xì)胞的生長和繁殖，抑制大鼠皮膚癌、胃癌、十二指腸癌、結(jié)腸癌及乳腺癌等的發(fā)生。目前研究認(rèn)為其抗腫瘤可能涉及誘發(fā)腫瘤細(xì)胞凋亡、阻斷腫瘤細(xì)胞信號傳導(dǎo)通路、抗氧化和抑制腫瘤血管生成等方面。但由于腫瘤的發(fā)生是一個多因素、多基因相關(guān)的復(fù)雜過程，姜黃素的抗腫瘤機(jī)制研究有待進(jìn)一步深入。姜黃素在日常食用的調(diào)料姜、咖喱和芥末中就含有大量姜黃素，姜黃素能夠抗氧化減少自由基，減輕炎癥病變、促使腫瘤細(xì)胞凋亡和抑制血管生長等作用。其更大的好處在于毒副作用小，一般劑量的姜黃素的攝入，對生物體沒有任何毒病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，經(jīng)常食用咖喱的人的乳腺癌淋巴轉(zhuǎn)移率要明顯低于不食用咖喱者，常食用咖喱的人患腫瘤的機(jī)率也較不食用咖喱的人要低。在當(dāng)前天然藥物成分越來越多地提取純化用于攻克腫瘤，病毒性疾病（乙肝、艾滋病等）等各種難治性疾病。新的研究也讓傳統(tǒng)醫(yī)藥再次煥發(fā)魅力，對中草藥的有效成份的提取方興未艾，激起了學(xué)者們極大的興趣。姜黃素不僅能夠抗氧化減少自由基，減輕炎癥病變、促使腫瘤細(xì)胞凋亡和抑制子宮肌瘤的預(yù)后。同時(shí)也給了我們一些新的啟發(fā)，適當(dāng)調(diào)整我們的飲食習(xí)慣，如食用姜、咖喱和芥末等，能很好在日常生活中起到預(yù)防腫瘤作用，甚至是用食物療法來替代或是減輕給病人帶來巨大負(fù)擔(dān)和創(chuàng)傷的手術(shù)、放療和化療等，是值得探索的。本研究應(yīng)用膠原酶消化法分離獲得子宮肌瘤細(xì)胞并體外培養(yǎng)，通過免疫組化的方法鑒定培養(yǎng)的細(xì)胞為子宮肌瘤細(xì)胞。觀察姜黃素對子宮肌瘤細(xì)胞增殖的影響：10、20、40umolL姜黃素分別處理子宮肌瘤細(xì)胞24h后，應(yīng)用MTT比色法檢測不同濃度姜黃素對子宮肌瘤細(xì)胞增殖能力的影響；研究姜黃素對子宮肌瘤細(xì)胞誘導(dǎo)凋亡的作用：光鏡觀察對照組和實(shí)驗(yàn)組子宮肌瘤細(xì)胞的生長情況、形態(tài)學(xué)改變，原位末端TdT酶標(biāo)記技術(shù)(TUNEL)檢測姜黃襲誘導(dǎo)子宮肌瘤細(xì)胞凋亡的作用； 探討姜黃索誘導(dǎo)子宮肌瘤細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制：采用逆轉(zhuǎn)錄一聚合酶鏈反應(yīng)(RTPCR)及蛋白質(zhì)印跡法，檢測姜黃素對子宮肌瘤細(xì)胞Transgelin基因mRNA及蛋白的表達(dá)的情況。為子宮肌瘤的臨床診斷和治療提供新的思路和依據(jù)。參考文獻(xiàn)：1. 王瑋，許偉，丁淑玉以人群為基礎(chǔ)子宮肌瘤危險(xiǎn)因素病例對照研究J中華腫瘤防治雜志，2007，14(11)：821-8232. 王卡榮，王敏孫風(fēng)娟子宮肌瘤組織中胰島素樣生長因子-I和IImRNA表達(dá)及意義J中國實(shí)用婦科與產(chǎn)科雜志，2005，21(12)：7537543 Strawn EY Jr，Novy MJ，Burry KA，et a1Insulin-like growth factor I promotes leiomyoma cell growth in vitroAm J Obstet Gynecol，1995，172(6)：1837434 Cohen DT，Oliva E，Hahn PF，et a1Uterine smoothmuscle tumors with unusual growth patterns：imaging with pathologic correlationAJR Am J Roentgenol，2007，188(1)：246555 AI-Hendy A，Salama SGene therapy and uterine leiomyoma：a reviewHum Reprod Update，2006，12(4)：3854006 Ohara NSelective estrogen receptor modulator and selective progesterone receptor modulator：therapeutic efficacy in thetreatment of uterine leiomyomaC1in Exp Obstet Gynecol，2005，32(1)：9-117Cook JD，Walker CLThe Eker rat：establishing a genetic paradigm linking renal cell carcinoma and uterine leiomyomaCurr Mol Med，2004，4(8)：813-248 Wisniewski JR，Schwanbeck RHigh mobility group IY：multifunctional chromosomal proteins causally involved in tumor progression and malignant transformation(review)Int J Wol Med2000，6(4)：409199 Borrmann L，Wilkening S，Bullerdiek JThe expression of HMGA genes is regulated by their 3UTROncogene，2001；20(33)：45374110 Englund K，Blanck A，Gustavsson I，et a1Sex steroid receptors in human myometrium and fibroids：change during the menstrual cycle and gonadotropin-releasing hormone treatmentC1in Endocrinol Metab，1998，83：4092-611 劉群，岳陽，王敏子宮肌瘤組織Transgelin基因表達(dá)及其臨床意義的研究J中華腫瘤防治雜志，2008，15(21)：1655-165812. Surh Y. Molecular mechanisms of chemopreventive effects of selected dietary and medicinal phenolic substances. Mutat Res 1999; 428(1-2):305-27.13. DAcquisto F, Iuvone T, Rombola L, Sautebin L, Di Rosa M, Carnuccio R.Involvement of NF-kappaB in the regulation of cyclooxygenase-2 protein expression in LPS-stimulated J774 macrophages. FEBS Lett 1997; 418(1-2):175-8.14. Amir AS, Shoshana Y, Derek L, et a1The Role of the IGF System in Cancer Growth and Metastasis: Overview and Recent Insights. Endocrine Reviews, 2007, 28(1):20-4715. 夏艷秋，徐永平，金禮吉，張斌，薛宏宇.姜黃素對IGF-1促腫瘤細(xì)胞增殖活性的抑制及其對細(xì)胞膜上IGF-1R表達(dá)的調(diào)控研究. 第七屆中國生命科學(xué)大會，2006，11，昆明16. Fukuhara K，Kariya M，Kita M，et a1Secreted frizzled related protein I is overexpressed in uterine leiomyomas， associated with a high estrogenic environment and unrelated to proliferative activityJ Clin Endocrinol Metab，2002，87(4)：1 7293617. Gao Z，Matsuo H，Nakago S，et a1p53 Tumor suppressor protein content in human uterine leiomyomas and it s down-regulation by 17 beta-est TadiolJ Clin Endocrinol Me-tab,2002,87(8)：391520三、 研究開發(fā)內(nèi)容和技術(shù)關(guān)鍵研究內(nèi)容:l應(yīng)用膠原酶消化法分離獲得子宮肌瘤細(xì)胞并體外培養(yǎng)。通過免疫組化的方法鑒定培養(yǎng)的細(xì)胞為子宮肌瘤細(xì)胞。觀察姜黃素對子宮肌瘤細(xì)胞增殖的影響：10、20、40 u molL姜黃素分別處理子宮肌瘤細(xì)胞24h后，應(yīng)用MTT比色法檢測不同濃度姜黃素對子宮肌瘤細(xì)胞增殖能力的影響2. 研究姜黃素對子宮肌瘤細(xì)胞誘導(dǎo)凋亡的作用：光鏡觀察對照組和實(shí)驗(yàn)組子宮肌瘤細(xì)胞的生長情況、形態(tài)學(xué)改變，原位末端TdT酶標(biāo)記技術(shù)(TUNEL)檢測姜黃襲誘導(dǎo)子宮肌瘤細(xì)胞凋亡的作用。3. 探討姜黃索誘導(dǎo)子宮肌瘤細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制：采用逆轉(zhuǎn)錄一聚合酶鏈反應(yīng)(RTPCR)及蛋白質(zhì)印跡法，檢測姜黃素對子宮肌瘤細(xì)胞Transgelin基因mRNA及蛋白的表達(dá)的情況影。為子宮肌瘤的臨床診斷和治療提供新的思路和依據(jù)。擬解決的關(guān)鍵問題：1 性狀穩(wěn)定的子宮肌瘤細(xì)胞體外培養(yǎng)：取子宮肌瘤組織1cm3 , 迅速低溫運(yùn)輸至細(xì)胞培養(yǎng)室, 剪碎成1 mm3的小塊, 膠原酶熱消化后, 細(xì)胞懸液離心沉淀接種, 細(xì)胞附壁單層生長至80%融合狀態(tài)后進(jìn)行傳代。 每例細(xì)胞傳23代,光鏡下觀察肌瘤細(xì)胞。2 姜黃素對肌瘤細(xì)胞抑制：MTT法、原位末端TdT酶標(biāo)記技術(shù)。3 Transgelin基因mRNA及蛋白的測定：可參考相關(guān)RTPCR書集。四、 預(yù)期目標(biāo)（主要技術(shù)經(jīng)濟(jì)指標(biāo)、應(yīng)用或產(chǎn)業(yè)化前景）本研究應(yīng)用膠原酶消化法分離獲得子宮肌瘤細(xì)胞并體外培養(yǎng)。（通過免疫組化的方法鑒定培養(yǎng)的細(xì)胞為子宮肌瘤細(xì)胞。）發(fā)現(xiàn)姜黃素對子宮肌瘤細(xì)胞的生長發(fā)展有明顯的抑制作用，且隨藥物濃度的升高該抑制作用明顯增強(qiáng)，呈劑量依賴性；且能使子宮肌瘤細(xì)胞Transgelin基因mRNA及蛋白的表達(dá)增加，這種作用可能通過調(diào)控Transgelin基因mRNA及蛋白表達(dá)作為機(jī)制之一來發(fā)揮作用的；姜黃素有治療子宮肌瘤的潛能。1）子宮肌瘤是女性生殖器官中最常見的良性腫瘤，目前中西藥治療均未取得滿意療效，手術(shù)切除子宮是最終采用的主要手段，但由此給女性身心健康帶來諸多不良影響。通過本研究為子宮肌瘤的臨床診斷和治療提供新的思路和依據(jù)，具有潛在的經(jīng)濟(jì)和社會效益。2）通過本研究為姜黃素等中藥成分的抗腫瘤機(jī)理研究提供一個新的途徑，同時(shí)為姜黃素的臨床應(yīng)用提供科學(xué)的理論依據(jù)。3）通過一系列研究有利于闡明子宮肌瘤的病因及發(fā)展機(jī)制，進(jìn)一步高子宮肌瘤的早期診斷和預(yù)防，可節(jié)省醫(yī)療費(fèi)用支出開支。具有重大的社會、經(jīng)濟(jì)效益和科學(xué)價(jià)值。五、項(xiàng)目實(shí)施方案、技術(shù)路線、組織方式與課題分解研究方法和技術(shù)路線：1病例收集：1).應(yīng)用膠原酶消化法分離獲得子宮肌瘤細(xì)胞并體外培養(yǎng)。通過免疫組化的方法鑒定培養(yǎng)的細(xì)胞為子宮肌瘤細(xì)胞。2)觀察姜黃素對子宮肌瘤細(xì)胞增殖的影響：10、20、40 u molL姜黃素分別處理子宮肌瘤細(xì)胞24h后，應(yīng)用MTT比色法檢測不同濃度姜黃素對子宮肌瘤細(xì)胞增殖能力的影響。3）研究姜黃素對子宮肌瘤細(xì)胞誘導(dǎo)凋亡的作用：光鏡觀察對照組和實(shí)驗(yàn)組子宮肌瘤細(xì)胞的生長情況、形態(tài)學(xué)改變，原位末端TdT酶標(biāo)記技術(shù)(TUNEL)檢測姜黃襲誘導(dǎo)子宮肌瘤細(xì)胞凋亡的作用。4）.Transgelin基因mRNA檢測 采用RT-PCR法參照Trizol說明書采取一步法提取總RNA，參照RTPCR試劑盒說明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，取25UL產(chǎn)物進(jìn)行PCR反應(yīng)，最后進(jìn)行PCR產(chǎn)物電泳及檢測。5) Transgelin基因蛋白檢測 采用蛋白質(zhì)印跡法，取20UL蛋白上樣進(jìn)行蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)，以堿性磷酸酶染色液染色，用自動電泳凝膠成像系統(tǒng)分析儀，對免疫印跡條帶進(jìn)行半定量分析。2方法學(xué)的建立1).子宮肌瘤細(xì)胞株的選擇：應(yīng)用膠原酶消化法分離獲得子宮肌瘤細(xì)胞并體外培養(yǎng)。通過免疫組化的方法鑒定培養(yǎng)的細(xì)胞為子宮肌瘤細(xì)胞：RPMI 1640培養(yǎng)液、新生胎牛血清、01胰蛋白酶、002EDTA、二甲基亞砜、臺盼蘭蘇木精、伊紅染液選購。2). 姜黃素對子宮肌瘤細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)凋亡：姜黃素、MTT液選購3). Transgelin基因mRNA檢測：逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，進(jìn)行PCR產(chǎn)