RP-HPLC法測定逍遙婦樂顆粒中梔子苷、芍藥苷的含量.doc

RP-HPLC法測定逍遙婦樂顆粒中梔子苷、芍藥苷的含量【關鍵詞】 RP-HPLC 【摘要】 目的 用RP-HPLC法測定逍遙婦樂顆粒中梔子苷、芍藥苷的含量。 方法 用UV確定梔子苷、芍藥苷的檢測波長為236nm，采用Metachem C-18柱（4.6mm250mm、5m），乙腈-0.02%磷酸（W/V）（15:85）為流動相，流速為1.0ml/min，=236nm，柱溫為30。 結(jié)果 梔子苷在0.0971.552g范圍內(nèi)具有良好的線性（r 2 =0.9998），平均回收率為96.80%（RSD=1.9%），芍藥苷在0.132.0g范圍內(nèi)具有良好線性（r 2 =0.9998），其平均回收率為100.28%（RSD=1.4%），n=9。 結(jié)論 此方法簡便、準確，專屬性強，為逍遙婦樂顆粒的質(zhì)量控制提供了科學有效的方法。 【關鍵詞】 RP-HPLC法 梔子苷 芍藥苷 逍遙婦樂顆粒是老中醫(yī)治療胸痹的臨床經(jīng)驗方，具有疏肝解郁、健脾利濕的功效，用于治療肝郁化熱、脾虛濕盛所致的婦女經(jīng)前期緊張綜合征。本方由白芍、牡丹皮、梔子等數(shù)10味中藥經(jīng)提取加工制成，組方較為復雜。為保證藥品的內(nèi)在質(zhì)量，制定了芍藥苷、梔子苷的含量測定方法，并進行相關方法學研究，認為線性、重復性、回收率、精密度等均較理想。 1 儀器與試藥 Agilent1100系列高效液相色譜儀G1312A（Biupump）二元泵、G1313（ALS）自動進樣器G1316A（COLOM）柱溫箱G1314A（VWD）及Agilent工作站;UV-可見紫外分光光度計（SHIMADZU）;乙腈為色譜純，其余均為分析純;對照品芍藥苷（paeoniflorin）、梔子苷（geniposide）購于中國藥品生物制品檢定所;樣品逍遙婦樂顆粒（批號:010208）由本廠提供。 2 方法的研究 2.1 測定波長的確定 經(jīng)紫外測定，梔子苷的最大吸收為238nm;芍藥苷的最大吸收為230nm，二條吸收曲線相交吸收約為236nm，在此波長處，二種對照品的吸收都比較大，滿足含量測定要求，故確定以236nm作為梔子苷和芍藥苷的共同吸收波長。 2.2 流動相的選擇 根椐文獻報導及中國藥典采用的流動相，比較了（1）甲醇異丙醇（67:4）0.05mol/L磷酸二氫鉀醋酯（177:4）（28:72）;（2）乙腈0.1%磷酸（13:87）;（3）乙腈0.02%磷酸（W/V）（15:85），并設定柱溫為30。根據(jù)上述三種流動相的試驗結(jié)果，認為流動相（3）較理想。為此將“色譜條件與系統(tǒng)適應性試驗”調(diào)整為用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑的色譜柱;乙腈0.02%磷酸（W/V）（15:85）為流動相;流速為1.0ml;檢測波長:236nm;柱溫30。理論板數(shù)按梔子苷峰、芍藥苷峰計算應不低于6000。色譜圖見圖1、2。 圖1 芍藥苷、梔子苷對照品色譜 圖2 逍遙婦樂顆粒樣品圖 2.3 提取方法選擇 經(jīng)查閱相關資料，用本品批號為010208的樣品，對提取方法、提取溶劑、溶劑用量、提取時間進行考察，采用正交表L 9 （3 4 ）進行試驗，由試驗結(jié)果知，因素D提取時間影響小，作為誤差項進行方差分析。見表14。 表1 逍遙婦樂顆粒含量測定法正交試驗的因素（略） 表2 逍遙婦樂顆粒含量測定法正交試驗的計算（略） 表3 逍遙顆粒中梔子苷正交試驗的方差分析（略） 表4 逍遙顆粒中芍藥苷正交試驗的方差分析（略） 從對梔子苷、芍藥苷進行正交試驗的方差分析得知，提取溶劑與提取方法對梔子苷和芍藥苷的提取率都有顯著的影響，提取時間的長短對二者均無影響，溶劑的用量對梔子苷、芍藥苷幾乎沒有什么影響，即采用樣品的10倍量溶劑與20倍量溶劑提取，差別不大，為此最佳的提取方案為:采用50%的甲醇，加入樣品10倍量的溶劑，回流20min。按此條件，又對同一批樣品進行復核試驗，根據(jù)復核試驗的結(jié)果，梔子苷的平均含量為0.441%，比正交試驗中的最大值0.407%提高8.3%，芍藥苷的平均含量為0.533%，比正交試驗中的最大值0.529%提高0.8%。由此證明所選最佳 方案是正確的。 2.4 標準曲線、定量限及檢測限測定 將對照品梔子苷、芍藥苷配制成不同濃度的溶液，以峰面積對濃度作圖，梔子苷回歸曲線為y=14307x+8.622，R 2 =0.9998，在0.0971.552g范圍內(nèi)具有良好的線性;芍藥苷回歸曲線為y=12483x+8.7132，R 2 =0.9998，在0.132.0g范圍內(nèi)具有良好的線性。芍藥苷定量限為0.2g/ml、檢測限為0.06g/ml;梔子苷定量限為0.17g/ml、檢測限為0.05g/ml。 2.5 對照品溶液及供試品溶液的制備 2.5.1 對照品溶液的配制 取經(jīng)真空干燥24h的對照品梔子苷10mg、芍藥苷12.5mg，精密稱定，分別置50ml量瓶中，加50%甲醇使溶解，并稀釋至刻度，搖勻備用。分別精密吸取上述對照品溶液2ml，置10ml量瓶中，加50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，制成每1ml分別含梔子苷0.04mg、芍藥苷0.05mg的溶液作為對照品溶液。 2.5.2 供試品溶液的制備 取本品裝量差異項下的內(nèi)容物，研細，取0.25g，精密稱定，于100ml蒸餾瓶中，精密加入50%甲醇25ml，稱定重量，水浴回流20min，冷至室溫，稱定重量，補足減失的重量，放置后，取上清液，以微孔濾膜（0.45m）濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液。 2.5.3 測定法 分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各10l，注入液相色譜儀，測定，待芍藥苷的峰顯示后約3min，梯度洗脫，調(diào)整為乙腈-0.02%磷酸（W/V）（80:20）洗脫5min，以洗去制劑中的雜質(zhì)，再恢復原流動相，共約25min，即得。 2.6 重復性試驗 取批號為020508的樣品，按上述方法，制備6份樣品，按法測定，梔子苷平均含量為0.377%，RSD為2.4%，芍藥苷平均含量為0.529%，RSD為0.6%。 2.7 回收率試驗 取批號為020508的樣品，精密稱定9份，加入高、中、低三種不同濃度對照品（即取梔子苷濃度為0.1552mg/ml、芍藥苷濃度為0.2084mg/ml的對照品溶液，分別加入3ml、2.5ml、2ml），按上述方法制成3種不同濃度的供試品溶液，按法測定。見表5。 表5 回收率實驗結(jié)果試驗 （略） 2.8 精密度和穩(wěn)定性試驗 取批號為010208的樣品0.25g，精密稱定，按法制成供試品溶液，同法測定6次，梔子苷RSD為0.99%;芍藥苷的RSD為1.06%。取同一樣品分別在0、0.5、1、2、4、24h測定，梔子苷的RSD為2.3%，芍藥苷的RSD為1.1%，說明該二種成分在制劑中提取后較為穩(wěn)定。 2.9 樣品測定 取批號為010208、010218、010225的3批逍遙婦樂顆粒樣品，分別進行測定，結(jié)果見表6。由上述結(jié)果可知，此含量測定方法可運用于逍遙婦樂顆粒中梔子苷和芍藥苷的含量測定。 表6 樣品測定表（略