免疫組化技術(shù)常見問題及處理方法PPT課件.ppt

免疫組化技術(shù)常見問題及處理方法 1 免疫組織化學(xué)的定義 用標(biāo)記的特異性抗體對組織切片或細(xì)胞標(biāo)本中某些化學(xué)成分的分布和含量進(jìn)行組織和細(xì)胞原位定性 定位或定量研究 這種技術(shù)稱為免疫組織化學(xué)技術(shù)或免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù) 2 免疫組織化學(xué)的原理 根據(jù)抗原抗體反應(yīng)和化學(xué)顯色原理組織切片或細(xì)胞標(biāo)本中的抗原和一抗結(jié)合利用一抗與標(biāo)記生物素 HRP AKP 熒光素等的二抗進(jìn)行反應(yīng)通過呈色反應(yīng)或熒光顯示細(xì)胞或組織中化學(xué)成分 在光學(xué)顯微鏡或熒光顯微鏡觀察確定某些化學(xué)成分的分布和含量 3 4 免疫組織化學(xué)的分類 按標(biāo)記物質(zhì)的種類 可分為酶標(biāo)記 膠體金標(biāo)記 熒光標(biāo)記和放射性標(biāo)記等按染色步驟可分為直接法 又稱一步法 和間接法 二步 三步或多步法 與直接法相比 間接法的靈敏度提高了許多 5 按結(jié)合方式可分為抗原 抗體結(jié)合 如過氧化物酶 抗過氧化物酶 PAP 法 親和連接 如卵白素 生物素 過氧化物酶復(fù)合物 ABC 法 鏈霉菌抗生物素蛋白 過氧化物酶連結(jié) SP 法等SP法是比較常用的方法 聚合物鏈接 如即用型二步法 此方法尤其適合于內(nèi)源性生物素含量高的組織抗原檢測 6 可被檢測的物質(zhì) 組織或細(xì)胞中凡是能作為抗原或半抗原 如蛋白質(zhì) 多肽 氨基酸 多糖 磷脂 受體 酶 激素 核酸及病原體等都可用相應(yīng)的特異性抗體進(jìn)行檢測 7 免疫組織化學(xué)的特點(diǎn) 1 特異性強(qiáng)2 敏感性高3 定位準(zhǔn)確 形態(tài)與功能相結(jié)合 8 Westernblotting ELISA與免疫組化的異同 Westernblotting 蛋白質(zhì)免疫印跡 檢查組織或細(xì)胞樣品內(nèi)蛋白含量的檢測方法 與免疫組化技術(shù)相比 定量可能更加準(zhǔn)確 也可定性和定位 但敏感性遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于免疫組化技術(shù)ELISA 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn) 檢查體液或組織勻漿中蛋白含量的檢測 與免疫組化技術(shù)相比 定量最準(zhǔn)確 是分泌性蛋白檢測首選方法之一 9 免疫組織化學(xué)方法的基本步驟 組織和細(xì)胞的處理抗原修復(fù)染色 10 鼠單克隆抗體或多克隆抗體 兔抗血清 鼠單克隆抗體特異性較高背景較干凈有多種潛在用途但敏感性 親和力低 兔多克隆抗體 兔抗血清 高敏感性 親和力可能有較多的交叉反應(yīng)更多的潛在用途 11 SP法 1 石蠟切片脫蠟和水化后 用PBS pH7 4 沖洗3次 每次3分鐘 2 根據(jù)每一種抗體的要求 對組織抗原進(jìn)行相應(yīng)的修復(fù) 3 每張切片加1滴或50 l過氧化酶阻斷溶液 試劑A 室溫下孵育10分鐘 以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶的活性 PBS沖洗3次 每次3分鐘 4 除去PBS液 每張切片加1滴或50 l正常非免疫動物血清 試劑B 室溫下孵育10分鐘 5 除去血清 每張切片加1滴或50 l的第一抗體 用戶自選 室溫下孵育60分鐘或4 過夜 建議參見每種抗體的說明書 4度過夜和從冰箱拿出后37度復(fù)溫45min PBS沖洗3次 每次3分鐘 12 6 除去PBS液 每張切片加1滴或50 l生物素標(biāo)記的第二抗體 試劑C 室溫下孵育10分鐘 PBS沖洗3次 每次3分鐘 7 除去PBS液 每張切片加1滴或50 l鏈霉菌抗生物素 過氧化物酶溶液 試劑D 室溫下孵育10分鐘 PBS沖洗3次 每次3分鐘 8 除去PBS液 每張切片加2滴或100 l新鮮配制的DAB或AEC溶液 顯微鏡下觀察3 10分鐘 9 自來水沖洗 蘇木素復(fù)染 PBS或自來水沖洗返藍(lán) 10 如果用DAB顯色 則切片經(jīng)過梯度酒精脫水干燥 二甲苯透明 中性樹膠封固 如果用AEC顯色 則切片不能經(jīng)酒精脫水 而直接用水性封片劑封片 13 二步法 Envision系統(tǒng) 1 脫蠟 水化組織切片 2 根據(jù)所應(yīng)用的一抗的特殊要求 對組織切片進(jìn)行預(yù)處理 3 0 3 或3 H2O2去離子水孵育5分鐘 30分鐘 以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶 PBS或TBS沖洗 4 滴加一抗 室溫或37 孵育30 60分鐘 或4 過夜 PBS或TBS浸洗3分鐘 5次 5 滴加enhangcer增強(qiáng)劑 試劑A 37度30min PBS或TBS浸洗3分鐘 5次 6 滴加通用型IgG抗體 Fab段 HRP多聚體 試劑B 室溫37 孵育30分鐘 1h PBS TBS沖洗3分鐘 5次 7 應(yīng)用DAB溶液顯色 8 蒸餾水沖洗 復(fù)染 脫水 透明 封片 14 Envision系統(tǒng)的優(yōu)點(diǎn) 敏感性高背景干凈 消除內(nèi)源性生物素的干擾 步驟簡單 15 石蠟切片標(biāo)本的固定 1 組織離體后盡快固定 切開固定效果好2 固定液以10 中性福爾馬林緩沖液為佳3 固定時(shí)間在4h 24h之間 長時(shí)間固定會影響抗原決定簇的暴露 產(chǎn)生陰性結(jié)果4 固定液的量要超過組織體積5倍以上如果組織固定不及時(shí)或不完全固定 HE染色細(xì)胞核發(fā)灰模糊 對比不鮮明 免疫組化染色結(jié)果不理想 通常組織離體2h后抗原完全丟失 16 固定不充分 17 18 19 20 21 22 23 24 標(biāo)本的取材 脫水 浸蠟 標(biāo)本的取材厚度以2mm為宜梯度酒精脫水盡量徹底充分二甲苯透明時(shí)間不宜長 1 3h為佳 透明過度會導(dǎo)致組織發(fā)硬發(fā)脆浸蠟應(yīng)選擇低熔點(diǎn)的石蠟 浸蠟應(yīng)充分如果組織脫水 浸蠟不充分 蠟塊會出現(xiàn)組織收縮凹陷 而且在免疫組化熱抗原修復(fù)操作時(shí)會容易脫片 25 標(biāo)本的切片 撈片 烤片 切片通常以3 4um的厚度為宜 太厚易掉片 細(xì)胞重疊 對細(xì)胞膜陽性結(jié)果觀察不理想撈片要求達(dá)到無皺折 無氣泡 水溫宜在 48 50 80 烘烤1 2h玻片用防脫片或多聚賴氨酸處理 以增強(qiáng)粘附性 26 冰凍切片的處理 冰凍切片的組織抗原保存好通常以5um的厚度為佳冷風(fēng)吹干后用純丙酮固定2遍 干燥置入4 冰箱短期保存 20 冰箱長期干燥保存缺點(diǎn)是不易做出好的冰凍切片 易出現(xiàn)冰晶 細(xì)胞腫脹等現(xiàn)象 27 細(xì)胞涂片的處理 培養(yǎng)細(xì)胞或細(xì)胞涂片 應(yīng)自然晾干后用純丙酮固定2遍 4 或 20 冰箱保存 28 抗原修復(fù) 概念 應(yīng)用物理或化學(xué)的方法將組織固定過程中封閉的抗原決定簇修復(fù)暴露的過程稱為抗原修復(fù)原因 甲醛固定過程中形成醛鍵和羧甲基而封閉部分抗原決定簇 固定時(shí) 蛋白與蛋白之間發(fā)生交聯(lián) 可能會封閉抗原決定簇 29 抗原修復(fù)的方法 酶消化 如胰蛋白酶 蛋白水解酶熱抗原修復(fù) HIER 水浴 微波爐 高壓鍋 高壓消毒鍋 蒸汽室超聲波以上綜合運(yùn)用修復(fù)方法從強(qiáng)到弱為 高壓修復(fù) 微波修復(fù) 胰酶修復(fù) 30 2020 2 5 31 熱抗原修復(fù) 更有效 染色結(jié)果更一致 操作更單一事先確定的熱修復(fù)時(shí)間可適用于幾乎所有的組織一抗可以進(jìn)一步稀釋 節(jié)省費(fèi)用 有些抗體只有采用熱抗原修復(fù)才有效 32 高壓鍋熱抗原修復(fù) 比微波更有效能處理大批量的切片達(dá)到更高的溫度加熱均勻 不像微波爐有熱點(diǎn)和冷點(diǎn) 和節(jié)省時(shí)間 33 高壓鍋熱抗原修復(fù) 將高壓鍋中的緩沖液煮開 不加蓋 將切片放入沸騰的緩沖液蓋緊蓋子和高壓閥 加熱至全壓力達(dá)到全壓力后才能計(jì)時(shí) 最佳時(shí)間由各個(gè)實(shí)驗(yàn)室自行確定 通常在2 4分鐘 34 熱抗原修復(fù) 注意事項(xiàng) 無論哪一步都不要讓切片干涸 抗原可完全丟失 加熱后需要冷卻15 30分鐘 個(gè)別未折疊的蛋白鏈恢復(fù)到原來的構(gòu)型 35 熱抗原修復(fù)存在的問題 過度的熱修復(fù)會導(dǎo)致組織形態(tài)的破壞或組織完全消化 免疫染色變?nèi)趸蚨ㄎ徊粶?zhǔn)確有一個(gè)時(shí)間點(diǎn) 超過這個(gè)時(shí)間點(diǎn)進(jìn)一步熱修復(fù)也不會獲得更強(qiáng)的染色效果解決方法 采用較短時(shí)間熱修復(fù)或酶消化重復(fù)實(shí)驗(yàn) 36 修復(fù)過度的實(shí)驗(yàn)組 37 修復(fù)過度的實(shí)驗(yàn)組 38 修復(fù)過度的對照組 39 修復(fù)過度的對照組 40 酶消化修復(fù) 41 縮短修復(fù)時(shí)間 42 熱修復(fù)抗原會導(dǎo)致內(nèi)源性生物素反應(yīng)增強(qiáng) 應(yīng)用卵白素抗生物素系統(tǒng)會產(chǎn)生假陽性富含內(nèi)源性生物素的組織 肝細(xì)胞 線抗體豐富的組織如腎臟 甲狀腺 嗜酸細(xì)胞等 胞漿豐富的腫瘤細(xì)胞 熱抗原修復(fù)的問題 內(nèi)源性生物素 43 組織在熱修復(fù)之后 用3 的新鮮H2O2進(jìn)行封閉 以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶的活性 室溫下孵育10min 再用10 雞 鴨 蛋清阻斷10 15分鐘 清洗后滴加一抗應(yīng)用非生物素系統(tǒng)的檢測試劑盒 如EnVision系統(tǒng) 阻斷內(nèi)源性生物素的方法 44 熱抗原修復(fù)的緩沖液 pH6 0檸檬酸緩沖液 最常用 尿素 Tris HCl 商品化修復(fù)液等堿性pH修復(fù)液常對絕大多數(shù)抗體的效果更好推薦使用 EDTA緩沖液pH8 0或Tris EDTA緩沖液pH9 0是較好的常規(guī)修復(fù)液 可用于大多數(shù)熱修復(fù)有效的抗體 45 抗體孵育條件 主要抗體濃度 溫度 時(shí)間 三者一般是相互成反比的 相對 濃度是最重要的先決條件 溫度決定反應(yīng)的速度 時(shí)間決定反應(yīng)的量溫度有4度 室溫 37度 其中4度最佳 反應(yīng)最溫和 背景較淺 而37度反應(yīng)速度較快 時(shí)間較短 室溫不太提倡4度過夜和從冰箱拿出后需37度復(fù)溫45min 46 復(fù)溫的必要性 防止切片從4度直接放入PBS易脫片使抗原抗體結(jié)合更穩(wěn)定4度和37度時(shí)分子運(yùn)動方式不同 前者分子碰撞機(jī)率和運(yùn)動速度小于后者 后者結(jié)合更快 但敏感性也提高了并易造成非特異染色 47 脫片產(chǎn)生的原因和如何防止脫片 多聚賴氨酸玻片的質(zhì)量問題切片問題 切片較厚或者不均勻組織本身的問題 癌癥組織中壞死組織越多越容易脫片烤片的時(shí)間短 溫度不夠操作的時(shí)候甩的過猛 有脫片嫌疑的片子最好不甩或輕輕甩 用吸水紙從邊緣上慢慢吸水修復(fù)的問題 抗原修復(fù)的時(shí)候高壓時(shí)間過長 玻片架放進(jìn)沸騰的修復(fù)液時(shí)需輕柔 48 背景染色較深的原因 1 抗體濃度過高 一抗?jié)舛冗^高是常見的原因之一 解決辦法是 每次使用新抗體前應(yīng)當(dāng)對其工作濃度進(jìn)行測試 使每一抗體個(gè)體化 找到適合自己實(shí)驗(yàn)室的理想工作濃度 2 抗體孵育時(shí)間過長或溫度較高 解決辦法是 嚴(yán)格執(zhí)行操作規(guī)程 避免因遺忘而造成時(shí)間延長 時(shí)間和溫度要根據(jù)染色結(jié)果進(jìn)行調(diào)整 49 3 DAB變質(zhì)和顯色時(shí)間太長 DAB最好現(xiàn)用現(xiàn)配 如有沉渣應(yīng)進(jìn)行過濾后再用 配制好的DAB不應(yīng)存放時(shí)間太長 DAB的顯色最好在顯微鏡下監(jiān)控 達(dá)到理想的染色程度時(shí)立即終止反應(yīng) 4 組織變干 5 切片在緩沖液或修復(fù)液中浸泡時(shí)間太長 大于24小時(shí) 6 一抗變質(zhì) 質(zhì)量差的多克隆抗體 50 DAB染色后切片著色呈陰性結(jié)果 抗體濃度和質(zhì)量問題以及抗體來源選擇錯(cuò)誤抗原修復(fù)不全或者不充分組織切片本身這種抗原含量低血清封閉時(shí)間過長DAB孵育時(shí)間過短細(xì)胞通透不全 抗體未能充分進(jìn)入胞內(nèi)參與反應(yīng) 51 DAB顯色時(shí)間的把握 1 DAB顯色時(shí)間不是固定的 主要由顯微鏡下控制顯色時(shí)間 到出現(xiàn)淺棕色本底時(shí)即可沖洗 2 顯色時(shí)間很短 如幾秒或幾十秒 就出現(xiàn)很深的棕褐色 說明抗體濃度過高或抗體孵育時(shí)間過長 需要下調(diào)抗體濃度或縮短抗體孵育時(shí)間 或前面的封閉非特異性蛋白不全 需要延長封閉時(shí)間 3 顯色時(shí)間很長 如超過十幾分鐘 才出現(xiàn)陽性染色 說明抗體濃度過低或孵育時(shí)間過短 最好一抗4度過夜 或封閉時(shí)間過長 52 免疫組化對照和質(zhì)量控制 陽性對照陰性對照免疫組化的標(biāo)準(zhǔn)化外部質(zhì)量控制體系 53 54 55 56