雷公藤甲素通過(guò)caspase依賴的線粒體途徑誘導(dǎo)白血病細(xì)胞.docx

標(biāo)題：雷公藤甲素誘導(dǎo)的caspase(含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶)依賴的細(xì)胞死亡通過(guò)介導(dǎo)在白血病細(xì)胞線粒體途徑引言：雷公藤甲素誘導(dǎo)的caspase依賴的細(xì)胞凋亡通過(guò)線粒體介導(dǎo)的通路在白血病細(xì)胞雷公藤甲素，從分離出一種二萜中國(guó)herbTripterygium wilfordiiHook.f，表現(xiàn)出抗腫瘤活廣泛一系列實(shí)體瘤。在這里，我們研究它的對(duì)白血病細(xì)胞和效果發(fā)現(xiàn)，在100納米或更小，它有效誘導(dǎo)凋亡的各種白血病細(xì)胞系和原發(fā)性急性髓性白血病（AML）的原始細(xì)胞。然后，我們?cè)噲D找出其作用機(jī)制。伴隨著雷公藤甲素誘導(dǎo)caspasedependent細(xì)胞死亡顯著降低XIAP水平。ForcedXIAP表達(dá)減弱triptolideinduced細(xì)胞死亡。雷公藤甲素也減少M(fèi)cl-1的，但不BCL-2和Bcl-XLlevels。 Bcl-2的過(guò)度抑制triptolideinduced凋亡。線粒體膜此外，雷公藤甲素引起的損耗潛力和細(xì)胞色素C釋放。caspase-9的基因敲除細(xì)胞耐藥，同時(shí)的caspase-8缺失細(xì)胞對(duì)雷公藤甲素敏感，暗示的關(guān)鍵性線粒體但沒(méi)有死亡受體途徑雷公藤甲素誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。 雷公藤甲素也增強(qiáng)了細(xì)胞死亡誘導(dǎo)其他抗癌劑?？偟膩?lái)說(shuō)，我們的 結(jié)果表明，雷公藤減小 XIAP和強(qiáng)效誘導(dǎo)caspasedependent凋亡通過(guò)線粒體途徑介導(dǎo)在白血病細(xì)胞 低納摩爾濃度。強(qiáng)效雷公藤甲素的體外抗白血病活性值得進(jìn)一步研究這種化合物對(duì)白血病的治療和其他惡性腫瘤。介紹：雷公藤Hook.f中，衛(wèi)矛科的一員植物家族，已用于中國(guó)藥世紀(jì)。雷公藤內(nèi)酯醇，二萜類化合物，首次從植物和結(jié)構(gòu)上的特點(diǎn)在1972年并已被用于治療各種自身免疫疾病的并作為患者的器官和組織移植的免疫抑制劑。近日，雷公藤甲素所表現(xiàn)出具有抗腫瘤特性范圍廣泛的抑制生長(zhǎng)和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡人腫瘤細(xì)胞。雷公藤也顯示敏感細(xì)胞死亡誘導(dǎo)的各種試劑，如Apo2/Trail ，TNF- ，和不同的化療藥物。然而，盡管雷公藤甲素的公認(rèn)有效的抗腫瘤活性，我們的知識(shí)就其作用機(jī)制仍是有限的。到目前為止，這是已知的只有雷公藤塊TNF-介導(dǎo)的誘導(dǎo)的c- IAP1的和c - IAP2和NF的激活？ B，并且誘導(dǎo)caspase激活。急性髓性白血病（AML）是一個(gè)積極的血液惡性腫瘤。盡管在過(guò)去的30年大力度，限制已經(jīng)取得了進(jìn)展在治療AML的。當(dāng)前反洗錢的主要治療方法是化療，誘導(dǎo)細(xì)胞死亡主要是通過(guò)凋亡不論是由固有的線粒體或外源性死亡受體途徑，這兩者導(dǎo)致介caspase激活和細(xì)胞解體。的發(fā)展創(chuàng)新療法和鑒定更有效的藥物，因此，仍然是白血病研究的高度優(yōu)先事項(xiàng)。由于其抗腫瘤特性，雷公藤有希望作為一個(gè)治療白血病。然而，較雷公藤誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡中的U937細(xì)胞通過(guò)激活胱天蛋白酶-3和下調(diào)XIAP最近的報(bào)告等，而且它下調(diào)的Bcr- Abl的表達(dá)并誘導(dǎo)K562細(xì)胞凋亡，幾乎沒(méi)有工作一直做了闡明雷公藤內(nèi)酯醇的活性和機(jī)制白血病。通過(guò)分子機(jī)制的理解調(diào)解雷公藤甲素的促凋亡活性，這將是可以更好地了解其抗白血病效應(yīng)，并確定它是否是用于臨床使用的候選者。另外，了解雷公藤甲素的分子靶點(diǎn)及機(jī)制行動(dòng)將使我們能夠設(shè)計(jì)出合理的聯(lián)合藥物治療，更有效地消滅白血病細(xì)胞。中所描述的研究在這里，我們研究各種白血病細(xì)胞雷公藤甲素的影響系和原發(fā)性AML母細(xì)胞，并表明雷公藤內(nèi)酯醇在低納摩爾濃度有效誘導(dǎo)凋亡的各種白血病細(xì)胞系和原發(fā)性AML爆炸。我們還調(diào)查在白血病細(xì)胞雷公藤甲素誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的機(jī)制。值得注意的是，這種藥物的水溶性衍生物是在臨床試驗(yàn)中在歐洲。細(xì)胞處理方法：對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞（0.2106/ml的）或單核細(xì)胞fromAML和正常骨髓樣本（1106/ml的）與治療不同濃度的雷公藤甲素（AlexisBiochemicals，圣迭戈，加利福尼亞州）24和48小時(shí)。 DMSO適量的用作控制。要阻止caspase活化或蛋白酶體降解，細(xì)胞預(yù)處理20 M + IDN-1965，一般的半胱天冬inhibitor22（由IDUN制藥，加利福尼亞州圣迭戈kindlyprovided），或之前0.2 M + MG132，aproteasome抑制劑（Calbiochem公司，圣迭戈，加利福尼亞州），1小時(shí)雷公藤加入。對(duì)于聯(lián)合治療的研究，成倍增長(zhǎng)從AML樣本（1106/ml的細(xì)胞）（0.2106/ml的）或單核細(xì)胞與雷公藤甲素的濃度增加和治療的所選化合物在恒定的比率為48小時(shí)。細(xì)胞死亡分析通過(guò)膜聯(lián)蛋白V染色，如在“細(xì)胞生存力測(cè)定法”中描述細(xì)胞活力測(cè)定法：細(xì)胞活力臺(tái)盼藍(lán)染色法用XR確定細(xì)胞計(jì)數(shù)器（Beckman Coulter公司，富勒頓，加利福尼亞州）。細(xì)胞凋亡估計(jì)通過(guò)caspase-3的激活都Western blot分析和流式細(xì)胞儀磷脂酰serine23測(cè)量用膜聯(lián)蛋白-V-FLUOS染色試劑盒（Roche Diagnostics公司，印第安納波利斯，IN）。膜的完整性同時(shí)被碘化丙啶評(píng)估（PI）排除在膜聯(lián)蛋白V染色的細(xì)胞。為了測(cè)量變化線粒體膜電位（MMP），細(xì)胞加載CMXRos（300 nm）的和MITOTRACKER綠色（100M）（均自Molecular Probes，俄勒岡州尤金）1小時(shí)，在37C?；|(zhì)金屬蛋白酶的虧損然后通過(guò)評(píng)估同時(shí)測(cè)量CMXRos保留（紅色熒光）調(diào)整線粒體質(zhì)量（綠色熒光）。細(xì)胞周期分布固定細(xì)胞，用70冰冷的乙醇和用PI染色溶液（25微克/毫升的PI ， 180 U / ml的RNA酶， 0.1 的Triton X -100，和30毫克/毫升西格瑪化學(xué)），在4 mM檸檬酸鹽緩沖液，pH 7.8聚乙二醇。該DNA含量，使用FACScan流式細(xì)胞儀（Becton確定迪金森，圣何塞，加利福尼亞州） 。使用細(xì)胞周期分布進(jìn)行分析MODFIT LT軟件（ Verity的軟件大廈，托普瑟姆， ME） 。Western blot分析Western印跡分析，以確定各種蛋白質(zhì)的水平做如前面所述。24簡(jiǎn)言之，將經(jīng)處理的細(xì)胞用PBS洗滌并裂解在蛋白質(zhì)裂解緩沖液（0.25M Tris-鹽酸， 2SDS， 4 -巰基乙醇，10甘油和0.02 溴酚藍(lán)） 。細(xì)胞的等量溶胞產(chǎn)物上樣到12 SDS-PAGE凝膠儀（Bio Rad ，赫拉克勒斯，CA）。至測(cè)量從線粒體釋放到胞質(zhì)溶膠中的細(xì)胞色素C，細(xì)胞用冰冷的裂解緩沖液（25mM Tris-HCl和5mM的氯化鎂 pH值7.4 ） 。收集上清液，通過(guò)離心，通過(guò)分析Western blot檢測(cè)，并探討與抗細(xì)胞色素C（ PharMingen公司，圣迭戈，加利福尼亞州）的抗體。與第二抗體溫育后，將膜反應(yīng)與ECL溶液（ Pharmacia公司，白金漢郡，英國(guó)） 。由一個(gè)被檢測(cè)到的信號(hào)磷屏（風(fēng)暴860 4.0版，分子動(dòng)力學(xué)，桑尼維爾，CA）。 ？ -肌動(dòng)蛋白被列為負(fù)荷控制。熒光定量逆轉(zhuǎn)錄 - 聚合酶鏈反應(yīng)（ RT-PCR）RNA從雷公藤治療OCI- AML3細(xì)胞的Trizol分離解決方案（生命科技，大島， NY ） 。 RNA的reversetranscribed禽流成髓細(xì)胞瘤病毒（ AMV ）逆轉(zhuǎn)錄酶（ Roche Diagnostics公司），在42下進(jìn)行1小時(shí)。 PCR擴(kuò)增反應(yīng)混合物（ 25 L ）中含有的cDNA ， XIAP蛋白的正向引物（ 5- CCCAAATTGCAGATTTATCAACG - 3）， XIAP的反向引物（ 5- TGCATGTGTCTCAGATGGCC - 3）， XIAP的探針（ 5- ATCTGGGAAGCAGAGATCATTTTGCCTTAGAC - 3），和TaqMan通用PCR擴(kuò)增預(yù)混試劑（ PE應(yīng)用生物系統(tǒng)公司，福斯特城，加利福尼亞州） 。 2-微球蛋白（2 -m）的共擴(kuò)增與XIAP被列入作為變量的標(biāo)準(zhǔn)化的內(nèi)部控制cDNA的每一個(gè)樣品中含量（正向引物，5 - AGCTGTGCTCGCGCTACTCT -3; ？反向引物，5 - TTGACTTTCCATTCTCTGCTGG -3; ？和探針，5 - TCTTTCTGGCCTGGAGGGCATCC -3 ？ ） 。熱循環(huán)條件包括保持反應(yīng)在50進(jìn)行2分鐘并在95 下進(jìn)行10分鐘，并循環(huán)為在95 下進(jìn)行40個(gè)循環(huán)為15秒和60 1分鐘。結(jié)果被收集，并用分析ABI PRISM 7700序列檢測(cè)系統(tǒng)（PE Applied Biosystems）進(jìn)行如如下：生成第1熒光信號(hào)的PCR循環(huán)數(shù)高于閾值（閾值循環(huán)，CT，上面的10個(gè)標(biāo)準(zhǔn)偏差意味著在基準(zhǔn)周期產(chǎn)生的熒光）確定，和一個(gè)比較CT法，然后用于測(cè)量相對(duì)基因表達(dá)。下面的公式用于計(jì)算相對(duì)量的處理的樣品（倍）權(quán)益的成績(jī)單和控制樣本（Y），這兩個(gè)歸一化的內(nèi)源參照（2 - 米）： 2- 用CT，其中CTIS的興趣和？ 2米的基因CTbetween的差異，和CTfor樣本XCT （x ） ？ CT （ Y） 。25集落形成實(shí)驗(yàn)的集落形成測(cè)定如先前所述進(jìn)行。26簡(jiǎn)言之，將1105從AML患者的骨髓單核細(xì)胞鍍?cè)贗scoves 0.8 甲基纖維素改性Dulbecco培養(yǎng)基補(bǔ)充有10FCS和15 ng / mL的重組人粒細(xì)胞集落刺激因子（抗hGM -CSF） 。雷公藤內(nèi)酯醇加入在培養(yǎng)物在10 100nM的濃度開始。反洗錢爆炸文化在重復(fù)7天，在顯微鏡下菌落評(píng)價(jià)菜肴。從正常骨髓細(xì)胞接種在Iscoves 0.8 甲基纖維素改性Dulbecco培養(yǎng)基， 1個(gè)單位/ mL人促紅細(xì)胞生成素（安進(jìn)公司，千橡，加利福尼亞州）和50 ng / mL的重組HGM- CSF 。雷公藤混合物在10 100nM的濃度添加。所有的文化都14天后，以確定菌落形成單位數(shù)分析：集落形成單位粒細(xì)胞 - 巨噬細(xì)胞（ CFU-GM ）和菌落爆裂形成單位 - 紅細(xì)胞（ BFU-E ）集落統(tǒng)計(jì) 所有的實(shí)驗(yàn)都進(jìn)行3次以上，結(jié)果是表示為平均值加上或減去標(biāo)準(zhǔn)誤差（SE），除非另有說(shuō)明。雷公藤甲素誘導(dǎo)膜聯(lián)蛋白V陽(yáng)性的濃度細(xì)胞的50，使用Calcusyn軟件（BIOSOFT，弗