標(biāo)準(zhǔn)曲線.docx

1、標(biāo)準(zhǔn)曲線的本質(zhì)分析檢測(cè)中的標(biāo)準(zhǔn)曲線是指一系列已知含量（濃度/量）的物質(zhì)與儀器響應(yīng)/信號(hào)之間的關(guān)系，數(shù)學(xué)處理就是曲線方程，圖形表示就是標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖1）。標(biāo)準(zhǔn)曲線的目的是可以根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線查出待測(cè)物質(zhì)的含量。當(dāng)我們得到一系列已知含量的物質(zhì)的響應(yīng)后，就會(huì)去建立函數(shù)關(guān)系，數(shù)學(xué)上稱曲線擬合，由于直線最為簡單，所以常常用直線方程加以擬合，當(dāng)然會(huì)用到多項(xiàng)式擬合等其他方式。標(biāo)準(zhǔn)曲線的核心問題要解決：1、能找到確切濃度的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)或標(biāo)準(zhǔn)品。2、標(biāo)準(zhǔn)系列和待測(cè)物質(zhì)一定要有相同和一致的基體，因?yàn)闃悠坊w可能會(huì)干擾儀器的響應(yīng)，從這個(gè)意義上講，樣品的前處理實(shí)際就是提供標(biāo)準(zhǔn)和樣品同樣的基體環(huán)境，盡量祛除干擾基體。所以最好的標(biāo)準(zhǔn)系列應(yīng)該是樣品基體匹配的標(biāo)準(zhǔn)系列。而方法建立過程中首先要考慮的當(dāng)然是基體干擾的問題，推薦用標(biāo)準(zhǔn)加入曲線和Youden曲線分別考察樣品基體所帶來的乘積性干擾和加和性干擾。標(biāo)準(zhǔn)加入曲線就是在樣品中加入一系列標(biāo)準(zhǔn)，然后考察該標(biāo)準(zhǔn)加入曲線和標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，若有差異需考慮用標(biāo)準(zhǔn)加入法定量；而Youden曲線就是對(duì)樣品做一系列稀釋，然后用稀釋倍數(shù)如1/10,1/5,1/2,1對(duì)儀器響應(yīng)做曲線，考察該Youden曲線的截距與0的差別，若有差別則提示有加和性干擾，此時(shí)測(cè)定值要減去該截距才是真實(shí)值。只有解決了標(biāo)準(zhǔn)曲線與樣品基體的匹配問題，我們的定量才可靠。內(nèi)標(biāo)法和替代物的使用則是為了解決儀器和前處理的影響問題。2、標(biāo)準(zhǔn)曲線的做法按基于標(biāo)準(zhǔn)樣品的線性校準(zhǔn)推薦：1、標(biāo)準(zhǔn)曲線的濃度范圍應(yīng)覆蓋正常操作條件下的被測(cè)量范圍；2、標(biāo)準(zhǔn)樣品的組分盡量與被測(cè)樣品組分一致；3、標(biāo)準(zhǔn)樣品的濃度值應(yīng)等距離的分布在被測(cè)量范圍；4、標(biāo)準(zhǔn)樣品的個(gè)數(shù)至少應(yīng)有3個(gè)濃度；5、每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)至少重復(fù)2次，這個(gè)重復(fù)是指從稀釋開始；如果國家標(biāo)準(zhǔn)有相應(yīng)的濃度系列推薦，盡量按國家標(biāo)準(zhǔn)，如果你要偷懶，比如我要減少標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)，至少要有理論標(biāo)準(zhǔn)支撐，比如至少要3個(gè)濃度。工作中我們經(jīng)常采用線性校準(zhǔn)，因?yàn)榫€性方程最為簡潔。3、標(biāo)準(zhǔn)曲線的檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)曲線的檢驗(yàn)是實(shí)際操作中最大的難點(diǎn)，也是工作中誤區(qū)和爭議最多的話題，比如GB/T 5750.3-2006就將標(biāo)準(zhǔn)曲線的檢驗(yàn)分為：精密度檢驗(yàn)，截距檢驗(yàn)和斜率檢驗(yàn)，但并未出示具體的檢驗(yàn)方法。首先講講這三個(gè)檢驗(yàn)，標(biāo)準(zhǔn)曲線的精密度檢驗(yàn)，實(shí)際含義就是做出來的試驗(yàn)點(diǎn)在我擬合的直線方程左右的分布情況，標(biāo)準(zhǔn)曲線是所有點(diǎn)以最小二乘算法（OLS）擬合出來的，這條曲線到所有點(diǎn)的垂直距離的和（殘差）是最小的。因此這條曲線并非通過所有點(diǎn)而是非常接近所有點(diǎn)，精密度檢驗(yàn)就是看這些試驗(yàn)點(diǎn)距離擬合的直線的距離有無異常，所以也稱線性檢驗(yàn)（擬合檢驗(yàn)）。這時(shí)的精密度（線性檢驗(yàn)）需用F檢驗(yàn)，P0.05，也就是說殘差應(yīng)該跟實(shí)驗(yàn)測(cè)定中的隨機(jī)誤差（變異）沒有差別，你要看每次測(cè)定的隨機(jī)誤差（變異）就必須多次測(cè)定同一濃度，因此失擬檢驗(yàn)要求每個(gè)濃度點(diǎn)至少重復(fù)2次。除此之外，最后我們還要看看這些殘差的分布是否是正態(tài)的，因?yàn)檎龖B(tài)才符合隨機(jī)誤差的特性。綜上所述，標(biāo)準(zhǔn)曲線的檢驗(yàn)應(yīng)該是線性檢驗(yàn)結(jié)合失擬檢驗(yàn)，以及殘差的正態(tài)性檢驗(yàn)結(jié)合才是統(tǒng)計(jì)學(xué)上比較完備的。關(guān)于標(biāo)準(zhǔn)曲線統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)細(xì)節(jié)請(qǐng)參看以下帖子標(biāo)準(zhǔn)曲線到底該如何檢驗(yàn)/shtml/20110816/3467111/通常我們采用的相關(guān)系數(shù)0.99以上的說法缺乏統(tǒng)計(jì)完備性。正如大家經(jīng)?？吹降母淖償M合的參數(shù)個(gè)數(shù)，如二次方程明顯能提高相關(guān)系數(shù)，但是我們經(jīng)常沒有勇氣去用二次曲線方程，因?yàn)槟銢]有統(tǒng)計(jì)學(xué)上完備的支撐。如果你發(fā)現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)曲線在低濃度和高濃度點(diǎn)的變異程度不同（非等方差），此時(shí)你應(yīng)該考慮權(quán)重最小二乘(WLS)。4、標(biāo)準(zhǔn)曲線使用中的問題4.1標(biāo)準(zhǔn)曲線需要人為的增加（0,0）點(diǎn)嗎？不能。通常的標(biāo)準(zhǔn)系列多是配制0,1,2,3mg/L系列這樣的說法，沒做實(shí)驗(yàn)人為添加（0,0）很不妥，因?yàn)楹芏鄷r(shí)候0管進(jìn)入儀器可能也有響應(yīng)值，這也是我們考察試劑空白的一個(gè)重要步驟。這個(gè)0管在某些時(shí)候非常重要，比如全血鉛測(cè)定，我們采用牛血清來基體匹配標(biāo)準(zhǔn)系列，如果此時(shí)你用酸做空白或沒做實(shí)驗(yàn)人為添加（0,0），那你就很難做好標(biāo)準(zhǔn)曲線。所以標(biāo)準(zhǔn)曲線的0管也是做好標(biāo)準(zhǔn)曲線的重要考慮點(diǎn)。4.2標(biāo)準(zhǔn)曲線需要減掉試劑空白來做嗎？不需要。儀器測(cè)出來標(biāo)準(zhǔn)系列的響應(yīng)值可以減掉試劑空白或減掉0管的響應(yīng)值來做，工作中我們也常用0管來做儀器調(diào)零。其實(shí)沒有必要那么麻煩，即使空白或0管有響應(yīng)值，在構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)，我們已經(jīng)認(rèn)為該響應(yīng)值就是0濃度，也就是扣除了這個(gè)空白的。4.3什么時(shí)候用Y=bX和二次曲線呢？ 標(biāo)準(zhǔn)曲線我們通常采用的是Y=a+bX，曲線擬合完必須要做統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)，且要做統(tǒng)計(jì)完備的線性檢驗(yàn)和失擬檢驗(yàn)，然后再做a與0的差別檢驗(yàn)，如果a與0的統(tǒng)計(jì)學(xué)上無差異，你就可以考慮用Y=bX的擬合曲線，擬合出來后同樣做線性檢驗(yàn)和失擬檢驗(yàn)，如果線性檢驗(yàn)合格（P0.05）此時(shí)你就可以采用Y=bX。二次曲線的采用同樣是這樣的道理，如果你Y=a+bX時(shí)擬合不合格，你就考慮用Y=a+bX+cX2，同樣做失擬檢驗(yàn)，考察擬合的符合情況。如果Y=a+bX和Y=a+bX+cX2都滿足擬合檢驗(yàn)和失擬檢驗(yàn)合格，則采用Y=a+bX形式，這樣符合統(tǒng)計(jì)學(xué)上參數(shù)最少的統(tǒng)計(jì)簡潔性原則。4.4標(biāo)準(zhǔn)曲線去查含量時(shí)是先減空白信號(hào)算樣品含量還是先算出空白含量相減呢？工作中我們常要減掉空白得到樣品含量，現(xiàn)有國家標(biāo)準(zhǔn)方法有的推薦先算出空白含量，用樣品含量相減，也有推薦先用樣品信號(hào)減空白信號(hào)然后去標(biāo)準(zhǔn)曲線推算含量。而且這兩種算法常常差距很大。其實(shí)這種差距往往是低含量水平時(shí)才出現(xiàn)，在低含量水平通過標(biāo)準(zhǔn)曲線推算含量時(shí)，本身不確定度就很大。這兩種方法都可以。個(gè)人推薦先用樣品信號(hào)減空白信號(hào)然后去標(biāo)準(zhǔn)曲線推算含量，因?yàn)檫@樣出來的含量不確定度要小一些，而先算出空白含量再相減就增加了1次標(biāo)準(zhǔn)曲線推算含量時(shí)的不確定度，因?yàn)楹玫臏y(cè)量永遠(yuǎn)是不確定度小的測(cè)量。4.5如何做兩條標(biāo)準(zhǔn)曲線的檢驗(yàn)?zāi)兀?、先從原理上講：判斷兩條或多條標(biāo)準(zhǔn)曲線的差異，須檢驗(yàn)殘差，截距和斜率三項(xiàng)，分別有不同的統(tǒng)計(jì)學(xué)參數(shù)，殘差用F檢驗(yàn)，截距和斜率采用較為復(fù)雜的統(tǒng)計(jì)量。2、從實(shí)際操作講：多用協(xié)方差分析檢驗(yàn)截距和斜率的差異，以SPSS為例：1.先重新整理數(shù)據(jù),將y2數(shù)據(jù)列加到y(tǒng)1下面,變成一個(gè)變量y;將x2數(shù)據(jù)列加到x1下面,變成一個(gè)變量x;然后再設(shè)定一個(gè)新的分組變量group,原來第1組值為1,第2組值為2.2.進(jìn)行協(xié)方差分析(第一步分析斜率是否無差異).Analyze-General Linear Model-Univariate Dependent List:填入y-將y做為因變量Fixed Factor:填入group Covaraites:填入x-將x做為協(xié)變量Model:選Custom Model:填入x group x*group-注意如果變量填入順序不一樣,結(jié)果也會(huì)不一樣. Sum of squares下拉列表框:選TypeI然后點(diǎn)擊ok,看結(jié)果里x*group這一行的Sig.P值,若大于0.05,則接受原假設(shè),即兩條回歸直線的斜率無差異,否則拒絕.3.再來進(jìn)行截距的無差異分析其實(shí)過程跟上面一樣,只是Model里去掉了x*group交叉項(xiàng). Analyze-General Linear Model-Univariate Dependent List:填入y-將y做為因變量Fixed Factor:填入group Covaraites:填入x-將x做為協(xié)變量Model:選Custom Model:填入x group -注意如果變量填入順序不一樣,結(jié)果也會(huì)不一樣. Sum of squares下拉列表框:選TypeI點(diǎn)擊ok后,看group一行的Sig.P值,若P值大于0.05說明兩條回歸直線截距也無差異,若小于0.05說明截距是有差異的。4.6標(biāo)準(zhǔn)系列的標(biāo)準(zhǔn)溶液體積取用中有效數(shù)字該如何寫呢？ 標(biāo)準(zhǔn)溶液體積取用的有效數(shù)字跟你采用的體積量具有直接關(guān)系。比如說量取或準(zhǔn)確量取等字眼，10mL和10.0mL提示你要采用不同的量具。當(dāng)我們使用某個(gè)量具完成某次體積取用后，讀數(shù)是按照量具的最小允差決定的，而最小允差是針對(duì)最小分度線而言的。當(dāng)取用10mL體積時(shí)，如果用A級(jí)10mL的分度吸管，那么10.0mL應(yīng)該是確定的，因?yàn)樗姆侄染€為0.1mL。當(dāng)取用1mL體積時(shí)，如果用A級(jí)1mL的分度吸管，那么1.00mL應(yīng)該是確定的，因?yàn)樗姆侄染€為0.01mL。所以我個(gè)人意見，到底寫10.00還是10.0以最小分度線來確定，最小分度線以下的都為估讀。如果你認(rèn)為估讀也是有效數(shù)字的話，10.00mL也可以，因?yàn)榇藭r(shí)的容量允差為0.05mL，但1.000mL就沒有太大意義了，因?yàn)锳級(jí)1mL的分度吸管的容量允差已經(jīng)是0.008mL了。4.7標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)的有效數(shù)字該如何保留呢？GB5750.3-2006 8.2.7項(xiàng)有如下規(guī)定：校準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)只舍不入，保留到小數(shù)點(diǎn)后出現(xiàn)非9的一位，如0.999890.9998。如果小數(shù)點(diǎn)后都是9時(shí)，最多保留小數(shù)點(diǎn)后4位。4.8標(biāo)準(zhǔn)曲線可以用同一濃度不同體積的進(jìn)樣來做嗎？標(biāo)準(zhǔn)系列一般都是配制不同濃度，進(jìn)樣相同體積來做的（濃度法）。但實(shí)際工作中我們還用到同一濃度來進(jìn)樣不同體積的方式來做（體積法），濃度法與體積法的區(qū)別在于濃度法中與待測(cè)物質(zhì)存在的溶劑/待測(cè)物質(zhì)的比例與體積法不同。濃度法中溶劑的環(huán)境（體積）基本是一致的，這樣的好處就是濃度法在判斷溶劑（或溶劑中干擾物質(zhì)）和待測(cè)物質(zhì)的指認(rèn)上更加容易。體積法中干擾物質(zhì)也會(huì)隨標(biāo)準(zhǔn)系列增加，不容易實(shí)現(xiàn)待測(cè)物質(zhì)的指認(rèn)。從進(jìn)樣針，進(jìn)小體積時(shí)不確定度比較大，帶來的直接結(jié)果時(shí)標(biāo)準(zhǔn)曲線不如濃度法容易做直。而且物理體積的限制，體積法不太容易實(shí)現(xiàn)較大跨度的濃度系列設(shè)置?？傊?，體積法和濃度法本質(zhì)上是一致的，但濃度法有：容易做好標(biāo)準(zhǔn)曲線，容易實(shí)現(xiàn)較大濃度跨度和容易實(shí)現(xiàn)待測(cè)物質(zhì)的指認(rèn)等優(yōu)點(diǎn)。4.9標(biāo)準(zhǔn)曲線查出樣品是負(fù)值，如何報(bào)告結(jié)果呢？這種情況下我們一般選擇四種方式報(bào)告結(jié)果：未檢出，檢出限，定量限，標(biāo)準(zhǔn)曲線第一點(diǎn)所推算的樣品濃度。四種都有道理，實(shí)際區(qū)別是埋在四種選擇下面的結(jié)果報(bào)告人的風(fēng)險(xiǎn)。未檢出的全部含義應(yīng)該是本實(shí)驗(yàn)室本儀器本方法未檢出，如果沒有這些界定，未檢出的歧義很多，而且沒有提供其它任何可用的信息。所以我建議學(xué)生一般不采用這種報(bào)告方法；檢出限是定性檢出的標(biāo)志，它是跟空白的統(tǒng)計(jì)比較計(jì)算出來的。每臺(tái)儀器，每次測(cè)定都有其檢出限，檢出限計(jì)算目前有兩大類計(jì)算方法：單濃度方法和校正設(shè)計(jì)法（Anal.Chem.1997,69:3069)，常規(guī)采用的單濃度方法需要額外的工作，所以現(xiàn)在趨向用校正設(shè)計(jì)法，既利用標(biāo)準(zhǔn)曲線直接計(jì)