基因工程生產(chǎn)人生長激素.docx

生物制藥作業(yè) 黃德平 學號：0942041016 2012-04-10基因工程生產(chǎn)人生長激素黃德平（生命科學學院,生物技術(shù)專業(yè),學號：0942041016）摘要：人生長激素（HGH）是一種非糖基化多肽激素，可以刺激身體生長，臨床上有重要應(yīng)用。HGH來源十分有限，起初只能從人尸體的腦垂體中提取，遠不能滿足臨床用藥要求?，F(xiàn)代基因工程為該激素的生產(chǎn)帶來了生機，通過體外大量培養(yǎng)微生物來大量產(chǎn)出重組型人生長激素（rHGH）。本文重點闡述基因重組大腸桿菌發(fā)酵生產(chǎn)rHGH的主要技術(shù)路線。關(guān)鍵詞：重組人生長激素（rHGH） 大腸桿菌 發(fā)酵Genetic engineering production of humand growth hormoneHuang Deping（NO.0942041016, Major in Biotechnology,Life Science School）Abstract: HGH is a kind of non-glycosylated polypeptide hormone,which can promote the body growth and is of great importance to clinical practice. The source of HGH is so limited that the drug supply is far from meeting the demand. HGH is separated and extracted from the pituitary gland of corpses before the gene engineering brings new vitality into industrial production of HGH.Now we can use recombinant e.coli to produce abundant HGH through the fermentation engineering method.And this article is mainly about the strategy of rHGH production，the process route，the existing problems and solutions.Key Words: recombinant human growth homone(rHGH) e.coli fermentation4科學家研究發(fā)現(xiàn)人生長激索(HGH)是一種由腦垂體前葉分泌的非糖基化的蛋白質(zhì)激素，天然HGH是單鏈球形酸性蛋白質(zhì)（等電點5.2），共191個氨基酸殘基組成，分子大小約為22KD，含有兩對二硫鍵，無糖基化，可通過鏈間的二硫鍵形成二聚體。深入的科學研究表明，HGH的N端1134位Aa肽段是必需活性序列，C端肽段則起到穩(wěn)定HGH分子，防止HGH被血液中蛋白酶降解；HGH是外分泌性蛋白質(zhì)，新生肽鏈為活性激素的前體，需通過切除信號肽來活化1。人生長激素具有促進骨骼、內(nèi)臟和全身生長，激活蛋白質(zhì)生物合成，影響脂肪和礦物質(zhì)代謝等重要作用，是機體發(fā)育的關(guān)鍵激素之一2,3。目前，HGH在臨床主要應(yīng)用于青少年矮小癥、外科術(shù)后和重癥燒傷、心衰、抗衰老等方面3。隨著人口老齡化的加劇，心血管疾病患者日益增加，rhGH在治療心血管疾病方面的應(yīng)用越來越重要。此外有報道稱長期注射小劑量HGH（0.81U/d），可以延緩各器官系統(tǒng)的衰老，是人的平均壽命增加20歲。目前，人生長激素類藥物遠遠不能滿足臨床用藥需求。由于生物技術(shù)的發(fā)展，應(yīng)用基因重組技術(shù)已成功生產(chǎn)出重組人生長激素（rHGH），可以通過發(fā)酵工程的方法大量生產(chǎn)rHGH。下文將重點闡明通過基因工程方法生產(chǎn)rHGH的技術(shù)路線。1.工藝發(fā)展概況人生長激素的制備經(jīng)歷了天然提取和基因工程菌發(fā)酵生產(chǎn)兩個階段，前者因生長激素的資源限制和提取效率低被淘汰，而后者也經(jīng)歷了兩代發(fā)展。第一代的rHGH直接在大腸桿菌中表達，得到重組蛋白Met-HGH，即N末端比天然HGH多一個甲硫氨酸，產(chǎn)生了免疫原性2；而且在氨基末端附帶的若干氨基酸需要體外降解，切除后才能成為天然HGH2。第二代rHGH為分泌表達型，分泌過程中利用大腸桿菌受體內(nèi)膜上的特異性信號肽剪切酶自動切除HGH前體的信號肽，產(chǎn)生與天然蛋白質(zhì)序列一致的的重組Phe-HGH，同時消除了Met帶來的免疫原性2,4。此外利用大腸桿菌和利用真核微生物（包括動物細胞）生產(chǎn)rHGH相比，生產(chǎn)周期較短，產(chǎn)量明顯較高。正因為這些優(yōu)勢，使得大腸桿菌生產(chǎn)重組Phe-HGH成為當前生產(chǎn)HGH的主流工藝。2.基因工程生產(chǎn)rHGH工藝流程2.1. rHGH工程菌的構(gòu)建、篩選及鑒定首先克隆HGH全長基因。根據(jù)人生長激素的氨基酸序列，選擇大腸桿菌偏好的密碼子，人工合成含有20個寡核苷酸的小片段，通過重疊區(qū)PCR擴增法合成HGH基因全長序列。在結(jié)構(gòu)基因前加上OmpA信號肽序列，5端設(shè)計NdeI酶切位點，3段加上兩個終止密碼子TAGTGA，并設(shè)計BamHI酶切位點5。然后分別酶切處理HGH和PIN-III-OmpA質(zhì)粒，在緩沖環(huán)境及DNA連接酶的作用下合成重組Phe-HGH表達載體（如圖-1），并PCR擴增重組分子2。取對數(shù)期大腸桿菌，經(jīng)冰浴的氯化鈣低滲溶液處理成為感受態(tài)細胞，加入重組質(zhì)粒，使之與氯化鈣形成復(fù)合物并黏附在細菌細胞膜表面，再經(jīng)42熱休克處理，重組質(zhì)粒因細胞膜通透性增加而進入感受態(tài)大腸桿菌6。圖-1 重組Phe-HGH表達載體2。通過單細胞克隆和檢測重組子表達產(chǎn)物的方法篩選重組子，對從組織進行生產(chǎn)鑒定，同時通過二面響應(yīng)法探索和優(yōu)化發(fā)酵生產(chǎn)條件。最后斜面培養(yǎng)法低溫保存工程菌種。2.2.發(fā)酵生產(chǎn)rHGH首先進行菌種活化，通過種子罐擴大培養(yǎng)，然后進行發(fā)酵罐培養(yǎng)。培養(yǎng)過程中嚴密監(jiān)控培養(yǎng)條件并適時調(diào)整。其中發(fā)酵培養(yǎng)主要參數(shù)控制如下7：(1)、種子培養(yǎng)過夜，0D值為2-3范圍之內(nèi)上罐發(fā)酵為佳。(2)、發(fā)酵培養(yǎng)時間一般為16-18h，培養(yǎng)溫度為37。(3)、發(fā)酵過程中保持PH值為7O05，溶解氧不低于20。(4)、培養(yǎng)過程中要根據(jù)生長狀況調(diào)節(jié)流加葡萄糖、微量元康的流加速度以保持溶解氧不低于20。(5)、發(fā)酵培養(yǎng)的茵體OD600值應(yīng)在70左右，表達的rHGH應(yīng)是茵體總蛋白的15以上。發(fā)酵生產(chǎn)流程如圖-2所示：圖-2 rHGH原料藥生產(chǎn)工藝流程72.3. rHGH的分離純化2.3.1 rHGH粗提首先分離工程細胞，收集培養(yǎng)液，PH5.5等電點沉淀，硫酸銨鹽析，離心分離收集沉淀8。2.3.2 rhGH的層析純化分別經(jīng)過G-25層析、PhenylSepharose FF層析、Sephacryl S100層析和DEAESepharose FF離子交換層析純化rHGH蛋白，使殘余DNA、殘余工程菌蛋白、相關(guān)蛋白、熱原均達到相關(guān)藥典質(zhì)量標準7,8。2.3.3 rHGH純度鑒定和活性鑒定純化后的樣品經(jīng)非還原SDSP AGE、鉻銀法染色后薄層掃描鑒定純度，再取純化rHGH樣品，經(jīng)HPLC法測定蛋白活力（要求比活性大于25 IUml）8。3.總結(jié)利用基因工程和發(fā)酵工程生產(chǎn)人生長激素（rHGH）是提高生產(chǎn)速度和生產(chǎn)效率的有效途徑，能擴大生產(chǎn)量，基本緩解臨床用藥緊張。但用藥需求還在不斷增長，生產(chǎn)廠本及藥物價格仍然很高，因此必須加強科學研究力度，通過提高工藝水平來價低成本，通過擴大生產(chǎn)量來參考文獻：1、朱振洪 葛立軍 劉文洪利用重組大腸桿菌生產(chǎn)人生長激素發(fā)酵工藝的研究,生物技術(shù)通報Biotechnology Bulletin,P217, 2010年第6期2、周珮生物技術(shù)制藥,P109,人民衛(wèi)生出版社,2007年7月第一版3、趙東峰 李漢超 王悅?cè)换蚬こ倘松L激素及其應(yīng)用研究進展,廣州化工,2010年38卷第2期4、劉社際,楊立明重組人生長激素在大腸桿菌BL21(DE3)中高效表達研究，生物技術(shù)通報Biotechnology Bulletin,P217, 2000年11月4日5、盧希彬 盧步峰 郭禮 簍翁人生長素基因的合成及克隆，生物技術(shù)通報Biotechnology Bulletin