細(xì)菌的純種分離.doc

細(xì)菌的純種分離、培養(yǎng)和接種技術(shù)及菌落形態(tài)的觀察班級(jí)：09環(huán)科二班姓名：李建文學(xué)號(hào)：200930260213一、 實(shí)驗(yàn)?zāi)康模海?）熟悉玻璃器皿的洗滌和滅菌前的準(zhǔn)備工作。（2）了解配制微生物培養(yǎng)基的基本原理，掌握常規(guī)的配制、分裝培養(yǎng)基的方法。（3）學(xué)會(huì)各類物品的包裝、配制（稀釋水等）和滅菌技術(shù)。（4）從湖水中分離、培養(yǎng)微生物，掌握常用的分離微生物的方法。（5）學(xué)會(huì)接種技術(shù)。（6）觀察分離出來的幾種細(xì)菌的個(gè)體形態(tài)及與其相應(yīng)的菌落形態(tài)特征。（7）通過觀察和比較細(xì)菌、放線菌、酵母菌及霉菌四大類微生物的菌落特征，達(dá)到初步鑒別上述微生物的能力二、 實(shí)驗(yàn)原理：1、培養(yǎng)基原理：培養(yǎng)基是微生物生長的基質(zhì)，是按照微生物營養(yǎng)、生長繁殖的需要，由碳、氫、氧、氮、磷、硫、鉀、鈉、鈣、鎂、鐵及微量元素和水，按一定的體積分?jǐn)?shù)配制而成。調(diào)整合適的pH，經(jīng)高溫滅菌后以備培養(yǎng)微生物之用。本實(shí)驗(yàn)配制固體培養(yǎng)基，固體培養(yǎng)基的成分與液體相同，僅在液體培養(yǎng)基中加入凝固劑使呈固態(tài)。通常加入質(zhì)量濃度15-20gL的瓊脂為固體培養(yǎng)基。2、滅菌原理:本次實(shí)驗(yàn)采取加壓蒸汽滅菌法。加壓蒸汽滅菌器是能耐一定壓力的密閉金屬鍋，加壓滅菌的原理在于提高滅菌器內(nèi)的蒸汽溫度來達(dá)到滅菌的目的。3、分離純化原理：本實(shí)驗(yàn)使用的平板表面涂布法，是把聚集在一起的群體分散成能在培養(yǎng)基上長成單個(gè)菌落的分離方法。此法加樣量不宜太多，只能在0.5mL以下，培養(yǎng)時(shí)起初不能倒置，現(xiàn)正置一段時(shí)間等水分蒸發(fā)后倒置。4、微生物的接種原理：接種就是將一定量的微生物在無菌操作條件下轉(zhuǎn)移到另一無菌的并適合該菌生長繁殖所需的培養(yǎng)基中的過程。本次實(shí)驗(yàn)采取斜面接種法，使用到的接種工具是接種環(huán)，接種環(huán)一般用電爐絲或者鎳絲，環(huán)的柄為金屬材質(zhì)，其后端套上絕熱材料套。5、菌落形態(tài)觀察原理：由于微生物個(gè)體表面結(jié)構(gòu)、分裂方式、運(yùn)動(dòng)能力、生理特性及產(chǎn)生色素的能力等各不相同，因而個(gè)體及它們的群體在固體培養(yǎng)基上生長狀況各不一樣。按照微生物在固體培養(yǎng)基上形成的菌落特征，可從菌落的形狀、大小、表面結(jié)構(gòu)、邊緣結(jié)構(gòu)、菌叢高度、顏色、透明度、氣味、粘滯性、質(zhì)地軟硬、表面光滑粗糙等情況，初步辨別是何種類型的微生物。三、 實(shí)驗(yàn)器皿和材料：1、 樣品：人工湖底泥2、 儀器：高壓蒸汽滅菌器、干燥箱、酒精燈或煤氣燈、稀釋水、試管、刻度移液管、錐形瓶、燒杯、量筒、滴管、吸水紙、鑷子、搪瓷杯、高溫滅菌鍋、移液槍（槍頭）、藥物天平、玻璃棒、玻璃珠、石棉網(wǎng)、藥匙、鐵架、表面皿、濾紙、pH試紙和棉花、接種環(huán)、酒精燈、恒溫培養(yǎng)箱、4大類菌落（培養(yǎng)皿）3、 試劑或材料：牛肉膏、蛋白胨、NaCl、NaOH和瓊脂等四、 實(shí)驗(yàn)步驟：（一）玻璃器皿的準(zhǔn)備1、洗滌玻璃器皿在使用前必須洗滌干凈。培養(yǎng)皿、試管、錐形瓶等可用洗衣粉加去污粉洗刷并用自來水沖凈。移液管先用洗液浸泡，再用水沖洗干凈。洗刷干凈的玻璃器皿自然晾干或放入干燥箱中烘干、備用。2、包裝（1） 移液槍和槍頭的包裝：移液管的吸端用細(xì)鐵絲（或牙簽）將少許棉花塞入構(gòu)成1-1.5cm長的棉塞，起過濾作用（以防細(xì)菌吸入口中，并避免將口中細(xì)菌吹入管內(nèi)）。棉塞要塞的松緊適宜，吸時(shí)既能通氣，又不致使棉花滑入管內(nèi)。然后將塞好棉花的移液管的尖端，放在4-5cm寬的長紙條的一端，移液管與紙條約成30度夾角，折疊包裝紙包住移液管的尖端，用左手將移液管壓緊，在桌面上向前搓轉(zhuǎn)，紙條螺旋式地包在移液管外面，余下的紙折疊打結(jié)，待滅菌。（2） 培養(yǎng)皿的包裝：培養(yǎng)皿由一底一蓋組成一套，用牛皮紙或報(bào)紙將10套培養(yǎng)皿（皿底朝里，皿蓋朝外，5套、5套相對(duì)而放）包好。（3） 硅膠塞：。硅膠塞四周應(yīng)緊貼管壁和瓶壁，不能有折皺，以防空氣微生物沿硅膠塞折侵入。硅膠塞的直徑和長度視試管和錐形瓶的大小而定，一般約35塞入管內(nèi)。試管、錐形瓶塞好硅膠塞后，用牛皮紙包裹并用細(xì)繩或橡皮筋捆扎好，放在銅絲簍內(nèi)待滅菌。（二）培養(yǎng)基的配制 1. 配制溶液取一定容量的燒杯盛入100mL蒸餾水（有時(shí)也可用自來水），按培養(yǎng)基配方（0.5g牛肉膏、1g蛋白胨、0.5gNaCl、2.0g瓊脂）逐一稱取各種成分，依次加入水中溶解。蛋白胨、肉膏等可加熱促進(jìn)溶解，待全部溶解后，加水補(bǔ)足因加熱蒸發(fā)的水量。在制備固體培養(yǎng)基加熱融化瓊脂時(shí)要注意攪拌，避免瓊脂糊底燒焦。2. 調(diào)節(jié)pH一般剛配好的培養(yǎng)基是偏酸性的，故要用質(zhì)量濃度為100gL NaOH調(diào)pH至7.2-7.4.應(yīng)緩慢加入NaOH，邊加邊攪拌，并不時(shí)用pH試紙測(cè)試。調(diào)整至所需的pH。3.分裝（1） 分裝試管：將培養(yǎng)基趁熱加至漏斗中。分裝時(shí)左手并排地拿數(shù)根試管，右手控制彈簧夾，將培養(yǎng)基依次加入各試管，用于制造斜面培養(yǎng)基時(shí)，一般裝量不超過試管高度（15mm*150mm）的15.分裝時(shí)謹(jǐn)防培養(yǎng)基沾在管口上，否則會(huì)使棉塞沾上培養(yǎng)基而造成染菌。牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基的配方：牛肉膏0.5g，蛋白胨1g，Nacl 0.5g,瓊脂2.0g，水100ml,pH7.2-7.4.滅菌條件：121攝氏度（相對(duì)蒸氣壓力為0.103MPa）,20min. (2)加棉塞、包裝后滅菌。 4.斜面的制作 滅菌后如需制成斜面培養(yǎng)基，應(yīng)在培養(yǎng)基冷卻至50-60攝氏度，將試管擱置成一定的斜度，斜面高度不超過試管總高度的13。（三）稀釋水的制備試管稀釋水的制備另取5支18 mm180mm的試管，分別裝9 mL蒸餾水，塞上棉塞，包扎后滅菌。（四）滅菌 加壓蒸汽滅菌法（1）向滅菌器內(nèi)加入清潔軟水（蒸餾水更好）：水位應(yīng)不超過水位線標(biāo)志，以免水進(jìn)入滅菌桶內(nèi)，浸濕被滅菌物品。（2）堆放物品并注意留有空隙：將需要滅菌的物品包好后，順序放在滅菌桶內(nèi)的篩板上。（3）蓋上蓋子：對(duì)稱地堅(jiān)固螺栓，注意不宜旋得太緊，以免損壞橡膠密封墊圈。（4）打開電源置滅菌溫度：通過壓力-溫度控制器旋鈕預(yù)置，溫度預(yù)置范圍在109126，順時(shí)針方向旋轉(zhuǎn)旋鈕，滅菌溫度預(yù)置值減??；反之，預(yù)置值增大。 可 根據(jù)需要確定預(yù)置滅菌溫度。（5）設(shè)置滅菌時(shí)間：按照不同的需要，將計(jì)時(shí)器旋鈕按順時(shí)針方向旋至所需的時(shí)間刻度上，當(dāng)達(dá)到預(yù)置的滅菌溫度時(shí)，計(jì)時(shí)指示燈亮，計(jì)時(shí)器自動(dòng)計(jì)時(shí)。（6）加熱，排放冷空氣。（7）滅菌。（8）結(jié)束（關(guān)電源）：此時(shí)切忌立即放氣，一定要待指針接近“零”位時(shí)，再打開放所閥，取出物品，排掉鍋內(nèi)剩余水。來過菌的培訓(xùn)基冷卻后置于37恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)24h，若無菌生長則放入冰箱或者陰涼處保存?zhèn)溆?。（五）?xì)菌的純種分離及培養(yǎng)（平板表面涂布法） （1）取樣：用無菌瓶從湖底中取一定量的活性污泥泥，迅速帶回實(shí)驗(yàn)室。（2）融化培養(yǎng)基：加熱融化培養(yǎng)基，待用。（3）將1瓶90ml和5管（根據(jù)預(yù)備實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)變化）9mL的無菌水排列好，按10(-1)、10（-2）、10（-3）、10（-4）、10（-5）、10（-6）依次編號(hào)。在無菌操作條件下，用10mL的無菌移液管吸取10mL稀釋的樣品置于90mL無菌水（內(nèi)含玻璃珠）中，將移液管吹洗3次，用手搖10min（或用混合器）將顆粒狀樣品打散，即為10(-1)濃度的混合液。用1mL無菌移液管吸取1mL10(-1)濃度菌液于9mL無菌水中，將移液管吹洗3次，搖勻，即為10（-2）濃度菌液。同法依次稀釋到10（-6）。（4）倒平板：將融化并冷卻至50攝氏度左右的培養(yǎng)基倒入無菌培養(yǎng)皿中，冷凝后即成平板。（5）涂布：用無菌移液槍吸取一定量的經(jīng)適當(dāng)稀釋的樣品液于平板上，用三角刮刀在平板上旋轉(zhuǎn)涂布均勻。（6）培養(yǎng)：送恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)（正置），如果培養(yǎng)時(shí)間較長，次日把培養(yǎng)皿倒置繼續(xù)培養(yǎng)。（六）細(xì)菌的接種（1）準(zhǔn)備：接種前將操作臺(tái)擦凈，將所需的物品整齊有序地放在桌上，用 75%酒精擦手。（2）編號(hào)：在試管上貼標(biāo)簽，注明菌號(hào)、接種日期、接種人姓名、組別等。貼在距試管口約23cm的位置。也可用記號(hào)筆注明上述內(nèi)容。（3）點(diǎn)燃：酒精燈。（4）手持試管：將一支斜面菌種（或培養(yǎng)皿菌落）和一支待接的斜面培養(yǎng)基用大拇指和其它四指握在左手中，使中指位于兩試管之間部位。斜面面向操作者，并使它們位于水平位置，而且管口齊平。（5）灼燒接種環(huán)：右手先將硅膠塞擰松，以便接種時(shí)容易拔出。右手拿接種環(huán)，在火焰上將環(huán)燒紅以達(dá)到滅菌的目的。（6）接種：在火焰旁，用右手小指、無名指和手掌夾住硅膠塞將其拔出。試管口在火焰上微燒一周，將管口上可能沾染的少量菌或帶菌塵埃燒掉。將燒過的接種環(huán)伸入菌種管內(nèi)，使環(huán)端輕觸內(nèi)管壁，冷卻后取種，立即轉(zhuǎn)移至待接種試管斜面上，自斜面底部開始向上做“Z”形致密劃線直至斜面頂端。抽出接種環(huán)，試管過后塞上硅膠塞，將試管放回試管架。灼燒接種環(huán)，殺滅環(huán)上細(xì)菌。送培養(yǎng)箱（37）培養(yǎng)，待看結(jié)果。（七）菌落形態(tài)的觀察 （1）將自己培養(yǎng)的細(xì)菌菌落逐個(gè)辨認(rèn)并編號(hào)，按號(hào)碼順序?qū)⒏骷?xì)菌的菌落特征描述、記錄。（2）繪制菌落形態(tài)圖。（3）與細(xì)菌、放線菌、酵母菌以及霉菌菌落特征進(jìn)行比