新藥研究與開發(fā)課題設(shè)計(jì)書.doc

廣東醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院新藥研究與開發(fā)課題設(shè) 計(jì) 書項(xiàng) 目 名 稱：維生素B1對SMMC-7721肝癌細(xì)胞作用的研究申 請 者： 鐘啟勝所 在 單 位： 廣東醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院09級郵 政 編 碼： 523808通 訊 地 址： 東莞市松山湖科技產(chǎn)業(yè)園新城大道1號申請者電話傳 真： 電 子 郵 件：990742791 申 請 日 期： 2012年 5 月 5 日廣 東 醫(yī) 學(xué) 院 藥 學(xué) 院 二一二年 制一、簡表研究項(xiàng)目情況名稱維生素B1對SMMC-7721肝癌細(xì)胞作用的研究類別A. 自由申請項(xiàng)目 研究類型A. 基礎(chǔ)研究C. 重點(diǎn)項(xiàng)目AB. 應(yīng)用基礎(chǔ)研究A申報(bào)學(xué)科名稱1代碼1名稱2代碼2申請金額0.43萬元研究期限2013年1 月至2013年7 月所用實(shí)驗(yàn)室實(shí)驗(yàn)室全稱實(shí)驗(yàn)室類別A. 國家重點(diǎn)B. 部門開放實(shí)驗(yàn)室編號C. 省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室C項(xiàng)目組情況項(xiàng)目成員姓名學(xué)院、年級、班別學(xué)號聯(lián)系方式項(xiàng)目中的分工簽章鐘啟勝藥學(xué)院09級06班0920606017515818264389實(shí)驗(yàn)方案及技術(shù)路線顏可立藥學(xué)院08級06班0820606017415017188924研究內(nèi)容及意義李日妹藥學(xué)院09級06班0920606017715818254487立題依據(jù)陳丹娛藥學(xué)院09級06班0920606018115818267154立題依據(jù)鄭周光藥學(xué)院09級06班0920606019715818254222研究目標(biāo)及內(nèi)容黃曉杭藥學(xué)院09級06班0920606019415876976150研究計(jì)劃及進(jìn)展研 究 內(nèi) 容 和 意 義摘 要肝癌是指發(fā)生于肝臟的惡性腫瘤，中國是乙肝大國，我國的肝癌多在乙肝肝硬化的基礎(chǔ)上發(fā)展而來，丙肝病人也在逐漸增加，乙肝后也會發(fā)展為肝癌。目前我國發(fā)病人數(shù)約占全球的半數(shù)以上，占全球肝癌病人的55%，已經(jīng)成為嚴(yán)重威脅我國人民健康和生命的一大殺手，其危險(xiǎn)性不容小視。維生素B1又稱硫胺素。它的主要作用是以輔酶的方式參加糖代謝。還能抑制膽堿酯酶的活性，減少乙酰膽堿的水解。維生素B1主要用于防治維生素B1缺乏癥(腳氣病)，多發(fā)性神經(jīng)炎，小兒麻痹后遺癥以及小兒遺尿癥和心肌炎等的輔助治療。有文獻(xiàn)表明維生素B1在抗腫瘤方面有作用，所以我們想研究其對肝癌有無治療作用，肝癌現(xiàn)在已成為嚴(yán)重威脅我國人民健康和生命的一大殺手，所以研發(fā)出這方面的新藥已迫不及待，而維生素B1有很好的前景。主題詞 維生素B1 肝癌 SMMC-7721（顏可立）11二、立論依據(jù)1、研究意義原發(fā)性肝癌（primary liver cancer，PLC，以下簡稱肝癌）是臨床上常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一，其中90為肝細(xì)胞肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）。在世界范圍內(nèi)，其發(fā)病率呈現(xiàn)上升的趨勢。全世界每年新發(fā)現(xiàn)惡性腫瘤病人約635萬例，其中肝癌占26萬例（占惡性腫瘤的4），26萬例中42.5發(fā)生在中國。中國、蒙古以及東南亞地區(qū)的發(fā)病率最高，達(dá)到98910萬人。我國是肝癌大國，也是全球肝癌發(fā)病率最高的國家，在常見腫瘤中僅次于肺癌，居第二位。由于乙型肝炎病毒（HBV）感染、黃曲霉素、環(huán)境污染等問題還沒有得到有效控制，我國肝癌發(fā)病率仍呈上升勢頭。本實(shí)驗(yàn)通過對維生素B對肝癌細(xì)胞的研究，希望能從中尋找到一條治療肝癌的新路線，為廣大肝癌患者帶來福音。2、國內(nèi)外研究現(xiàn)狀根據(jù)國內(nèi)外大量研究資料分析，認(rèn)為肝癌發(fā)生的原因主要有以下幾種： （1）病毒性肝炎：主要是乙型與丙型肝炎病毒感染，尤其是乙肝與乙肝病毒攜帶者，其原發(fā)性肝癌的發(fā)生率要比正常人高出2100倍；在肝癌的高發(fā)地區(qū)，約20的人可能是乙型肝炎或乙肝病毒攜帶者。 （2）黃曲霉毒素（AFT）：以黃曲霉素B為最重要的致癌物質(zhì)。適宜于高溫、高濕的氣候環(huán)境中生長繁殖，尤其是夏季的霉變食物及谷物、飼料等，最易被黃曲霉菌污染而產(chǎn)生黃曲霉毒素，長期食用含此毒素的食物可誘發(fā)肝癌。（3）水源污染：飲用水質(zhì)的嚴(yán)重污染，是肝癌發(fā)生的重要誘因之一，尤其是污染的溝水，其次為河水，井水最低。故在沒有自來水設(shè)施的鄉(xiāng)村，應(yīng)提倡飲用井水。 （4)化學(xué)致癌物質(zhì)：能引起肝癌的化學(xué)物質(zhì)以N亞硝基化合物為主，如亞硝胺和亞硝酰胺等。此外，農(nóng)藥、酒精、黃樟素等亦均能誘發(fā)肝癌。 （5）其他因素：營養(yǎng)過剩（大量營養(yǎng)素）或營養(yǎng)缺乏（如維生素A、B1缺乏）、血色病、寄生蟲感染及遺傳等，也是誘發(fā)肝癌的危險(xiǎn)因素。 （6）免疫狀態(tài)：有人認(rèn)為肝癌患者血漿中含有一種封閉因子，能抑制細(xì)胞免疫并保護(hù)肝癌細(xì)胞不受免疫細(xì)胞殺傷?，F(xiàn)已證明，甲胎蛋白（AFP）就能抑制淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的吞噬作用。（7）基因突變：近年來，還有人認(rèn)為，環(huán)境中的突變原和病毒作用激發(fā)肝細(xì)胞分裂反應(yīng)途徑的活化，引起細(xì)胞的點(diǎn)突變和基因易位，是加速癌細(xì)胞增殖的可能因素。 此外，肝癌的發(fā)生還與非血蛋白的核蛋白對細(xì)胞周期的調(diào)控失常，以及細(xì)胞內(nèi)外因素如環(huán)核苷酸、激素、多肽、生長因子及多胺等有關(guān)。 目前肝癌的治療方法有手術(shù)治療，動脈化療栓塞，經(jīng)皮消融療法，肝移植和全身化療。全身化療采用單藥或聯(lián)合化療，常用藥物主要有5氟脲嘧啶、阿霉素、表阿霉素、絲裂霉索、順鉑、卡鉑等。但其有效率均在 1020，效果不令人滿意。 化療進(jìn)展的重要標(biāo)志是有新的、對腫瘤細(xì)胞殺傷力強(qiáng)的藥物上市，從而提高治療效果改變患者的預(yù)后，延長生命。 肝癌容易轉(zhuǎn)移，因此，不少肝癌在診斷時(shí)就發(fā)生了轉(zhuǎn)移 ，無法完全切除腫瘤，或者 ，即便是手術(shù)切除了腫瘤 ，但手術(shù)后很快就復(fù)發(fā)或發(fā)生了轉(zhuǎn)移。這就說明肝癌其實(shí)是一種全身性的疾病，也說明全身藥物治療的重要性。 迄今為止，幾乎所有問世的化療藥物都應(yīng)用于肝癌，但有效率很低，幾乎沒有超過2O。而且，從延長病人的生存期而言，尚沒有一種傳統(tǒng)的化療藥物有確鑿的證據(jù)表明能延長肝癌病人的生存期。原 因之一在于肝癌本身對化療藥物比較不敏感，不像血液系統(tǒng)腫瘤那樣對化療藥物敏感。原因之二是傳統(tǒng)的化療藥物選擇性差，只要是增生快的組織都容易受到化療藥物的損害。因此尋找一種安全有效的治療藥物是當(dāng)今研究的熱點(diǎn)。最近，權(quán)威學(xué)術(shù)期刊英國癌癥雜志刊登了一項(xiàng)在加拿大開展的大規(guī)模女性癌癥篩查及長期追蹤項(xiàng)目，顯示B族維生素可調(diào)控腫瘤風(fēng)險(xiǎn)。B族維生素是一個(gè)“大家庭”，雖都?xì)w為B族，但奇怪的是，它們很多成員的通俗名稱并不含“維生素B”。原來科學(xué)家們最初在米糠中發(fā)現(xiàn)了抗腳氣病因子，并稱之為維生素B，后來隨著研究的進(jìn)展，發(fā)現(xiàn)以前命名的維生素B其實(shí)是一族物質(zhì)，因此將它們稱為“B族維生素”，并沿用至今。 “加拿大女性癌癥大型篩查研究人員發(fā)現(xiàn)，隨著維生素B1(硫胺素)攝入量的提高，直腸癌和結(jié)腸癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)有下降的趨勢。分析結(jié)果顯示：相比每天攝入硫胺素低于1.06毫克的受訪者，每天攝入1.43毫克硫胺素的受訪者患上直腸癌、結(jié)腸癌的風(fēng)險(xiǎn)約降低22。早前一項(xiàng)波蘭的研究也顯示：隨著硫胺素的攝入量由低于0.81毫克日增加到1.17毫克日以上(注：但要求不超過加拿大的推薦安全攝入量)，直腸癌、結(jié)腸癌的患病風(fēng)險(xiǎn)下降了86。這項(xiàng)波蘭研究的數(shù)據(jù)同時(shí)還顯示，充足的維生素A、維生素C、維生素E及類胡蘿卜素均有助于降低直腸癌、結(jié)腸癌的風(fēng)險(xiǎn)。隨著研究的不斷深入，科學(xué)家在對B族維生素健康益處的基本認(rèn)知上，進(jìn)一步揭示出B族維生素還參與DNA合成，保持基因組穩(wěn)定性，輔助DNA修復(fù)，調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖和死亡等，對人類健康十分有益。據(jù)報(bào)道，硫胺素對囊腫物有一定的治療效果。有對一例病理確診為溶骨性骨肉瘤的患者進(jìn)行同樣治療,2天內(nèi)瘤塊縮小一半以上,故提出硫胺素可能是骨肉瘤的病因之一,值得今后進(jìn)行探討。 根據(jù)以上這些原理我們組對硫胺素治療肝癌進(jìn)行探究。硫胺素主要是以輔酶或輔基的形式參與機(jī)體能量代謝。近年來有關(guān)兩者抗氧化性能的報(bào)道日益增多，研究發(fā)現(xiàn)硫胺素和核黃素的缺乏可削弱機(jī)體的抗氧化能力，對心血管疾病、腫瘤、神經(jīng)發(fā)生和DNA損傷等產(chǎn)生影響。近年來研究發(fā)現(xiàn)硫胺素在防止糖尿病微血管病變、高脂血癥內(nèi)皮損傷、腫瘤和促進(jìn)神經(jīng)發(fā)生等方面發(fā)揮重要作用。硫胺素作為磷酸戊糖途徑限速酶轉(zhuǎn)酮醇酶 (transketolase)的輔酶，可以通過激活轉(zhuǎn)酮醇酶使過量的葡萄糖經(jīng)磷酸戊糖途徑代謝，減少具有細(xì)胞毒性作用產(chǎn)物的生成和細(xì)胞的凋亡。硫胺素還能以磷酸酯形式參與體內(nèi)眾多的氧化還原反應(yīng)，改善細(xì)胞的能量代謝，清除氧自由基等脂質(zhì)過氧化反應(yīng)產(chǎn)物，保護(hù)血管內(nèi)皮防止微血管病變，避免輻射誘導(dǎo)的基因損傷，發(fā)揮抗腫瘤和抗突變的作用。 硫胺素除以磷酸化形式作為丙酮酸脫氫酶、a酮戊二酸脫氫酶和轉(zhuǎn)酮醇酶的輔酶，參與機(jī)體碳水化合物和支鏈氨基酸的代謝外，還可以作用于翻譯過程來影響基因表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)TPP能夠直接與編碼其合成的mRNA反應(yīng)，誘導(dǎo)mRNA結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，減少mRNA與核糖體的結(jié)合從而阻斷翻譯過程，減少自身的合成來影響硫胺素功能的發(fā)揮 “。硫胺素缺乏能夠損害機(jī)體的正常功能，影響細(xì)胞的增殖導(dǎo)致癌癥和其他退行性疾病的發(fā)生。硫胺素在體外還能抑制硝基喹啉、血管緊張素誘導(dǎo)的DNA氧化損傷，也可能是硫胺素防治腫瘤和其它慢性退行性疾病的機(jī)制之一 。研究發(fā)現(xiàn)硫胺素在厭氧環(huán)境中能夠抑制細(xì)胞生長，而腫瘤細(xì)胞屬于厭氧細(xì)胞，因此利用這一特性放療時(shí)加人硫胺素可能達(dá)到抑制癌細(xì)胞的效果。硫胺素可能通過保護(hù)DNA免于損傷、抑制細(xì)胞基因突變和抑制腫瘤細(xì)胞生長而發(fā)揮抗突變和抗腫瘤的作用。3、本項(xiàng)目的創(chuàng)新之處顯然，我們研究的課題是針對硫胺素地老藥新用，而且該實(shí)驗(yàn)是首次用維生素B1對肝癌進(jìn)行研究，國內(nèi)外未見相同或相關(guān)的報(bào)道。4、主要參考文獻(xiàn)及出處 1龔新雷,秦叔逵.原發(fā)性肝癌的分子靶向治療研究新進(jìn)展J.臨床腫瘤學(xué)雜志.2008年01期2劉秀玲,蔡美琴.硫胺素、核黃素抗氧化作用與相關(guān)疾病研究進(jìn)展.國外醫(yī)學(xué)衛(wèi)生學(xué)分冊.2008年 第35卷 05期 第282頁3楊柳明,文小敏,張福君.原發(fā)性肝癌的中西醫(yī)結(jié)合診斷與治療.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)出版社.2001年6月第一版4大洋新聞.B族維生素可調(diào)控腫瘤風(fēng)險(xiǎn).廣州日報(bào).2009年B11版 5沙士義.肝癌藥物治療的研究進(jìn)展.中國基層醫(yī)藥.2005年06期，第760頁6金偉馬力 染料木黃酮對順鉑誘導(dǎo)肝癌SMMC-7721細(xì)胞凋亡的增敏作用J第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)2005，26（8），761-763：7孫元玨，趙暉，郭躍武，等.羥基喜樹堿聯(lián)合草酸鉑治療晚期消化道腫瘤的近期臨床療效J中華腫瘤雜志2004，26（6） ，749-752： 8夏景光，李文建，魏 巍，等3Gyy射線對不同腫瘤細(xì)胞細(xì)胞周期進(jìn)程的影響J核技術(shù)，2005，28(8)：6219陳瑞銘等:人體肝癌休外細(xì)胞株(BE L一7 402) 的建立及其特征,科學(xué)通報(bào)(9):4 34-4 36,19 75。10陳瑞銘等:體外培養(yǎng)三個(gè)人體肝癌細(xì)胞系的建立及其特征,中國科學(xué)9(12):12 2 51 233,1 979（陳丹娛，李日妹）三、研究方案. 研究目標(biāo)、研究內(nèi)容和擬解決的關(guān)鍵問題1.1研究目標(biāo)研究維生素B1對肝癌有無治療作用。1.2研究內(nèi)容（1）應(yīng)用新生小牛血清培養(yǎng)SMMC-7721肝癌細(xì)胞株，獲得對數(shù)期的細(xì)胞。（2）探討不同濃度的維生素B1溶液對SMMC-7721肝癌細(xì)胞的影響，從而確定合適的藥用濃度。（3）應(yīng)用Hoechest33258染色觀察細(xì)胞核凋亡及細(xì)胞周期各期的判斷。1.3關(guān)鍵問題是SMMC-7721肝癌細(xì)胞株的培養(yǎng)，用顯微鏡觀察細(xì)胞的變化及細(xì)胞周期各期的判斷。 （鄭周光）. 擬采取的研究方法、技術(shù)路線、實(shí)驗(yàn)方案及可行性分析2.1實(shí)驗(yàn)材料 維生素B1(鄭州藍(lán)宇化工有限公司)；人SMMC-7721肝癌細(xì)胞株購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞存儲中心； RPMI 1640培養(yǎng)基（中美合資博慧斯生物醫(yī)藥科技有限公司）；新生小牛血清（杭州四季青生物工程材料研究所） ；MIT（北京中生瑞泰科技有限公司）； AnnexinV-FITC試劑盒（北京瑞邦興業(yè)科技有限公司）；細(xì)胞凋亡 Hoechst染色試劑盒（碧云天生物技術(shù)研究所）2.2實(shí)驗(yàn)方案2.2.1細(xì)胞增殖試驗(yàn)與光鏡觀察 將SMMC-7721細(xì)胞接種于含100ml/L 新生小牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基中，置50ml/L CO2 培養(yǎng)箱中，37 培養(yǎng)，每毫升培養(yǎng)液內(nèi)加青霉素100單位,鏈霉素10 微克,培養(yǎng)液的pH 為7.27.4，SMMC-7721細(xì)胞為貼壁細(xì)胞，一般48 h換液1次，待細(xì)胞長滿瓶底約80時(shí)，用025胰酶消化傳代，一般按照1：3的比例，每710天傳代一次，用胰蛋白酶消化對數(shù)生長期的SMMC-7721細(xì)胞，制備 成單細(xì)胞懸液。接種于加入到 96孔培養(yǎng)板，每孔 104個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)24h后換液。取對數(shù)生長期的細(xì)胞接種于培養(yǎng)瓶，貼壁后用含維生素B1 20,40,60,80，100，120mol/L液培養(yǎng)作用48 h。另設(shè)空白孔和對照孔，藥物作用期間，用倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞的生長情況，每種濃度平行3個(gè)復(fù)孔，分別于加藥后24、48、72 h無菌條件下吸去上清，加入無血清的培養(yǎng)液100 uL/孔，并加入MTT 50 uL孔，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，吸去每孔的液體，加入維生素B1 150 UL孔，振蕩器上振蕩溶解510 min，以空白對照調(diào)零，應(yīng)用自動酶標(biāo)儀，在490 nm波長處測出各實(shí)驗(yàn)組的吸光度A值。以上實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。存活率=(藥物實(shí)驗(yàn)組A平均值細(xì)胞對照組A平均值)100；抑制率()=1一存活率。2.2.2.Hoechest33258染色觀察細(xì)胞核凋亡形態(tài)收集正常培養(yǎng)和維生素B1處理 48h后的細(xì)胞置于載玻上， 40g/L多聚甲醛在室溫固定30min ，用0.01mol/L PBS（PH7.4 ）洗3 次，滴加Hoechest33258染色液，染色5min ，滴加抗熒光淬滅液于載玻片上，用蓋玻片封片，用熒光顯微鏡觀察核凋亡形態(tài)觀察細(xì)胞形態(tài)的改變。2.2.3.細(xì)胞凋亡的流式定量檢測 用Annexin V-FITC試劑盒進(jìn)行定量檢測收集正常培養(yǎng)和藥物處理后細(xì)胞，用4 預(yù)冷的 PBS洗 2次，用100ul 結(jié)合緩沖液重新懸浮細(xì)胞，加入5ulFITC 標(biāo)記的Annexin-v和10ul PI ，混勻后室溫避光孵育15min ，再加400ul PBS，立即進(jìn)行流式細(xì)胞定量檢測，同時(shí)以不加 AnnexinV-FITC及PI 的一管作陰性對照。電鏡樣本制備 收集細(xì)胞，25g/L 戊二醛同定，2500r/min 離心，去上清，細(xì)胞團(tuán)經(jīng)10g/L 鋨酸后固定、脫水、浸透、包埋、超薄切片、鈾一鉛復(fù)染、透射電鏡下觀察。2.2.4 結(jié)果記錄1細(xì)胞形態(tài)觀察 維生素B1作用于SMMC-7721細(xì)胞24 h后，在Olympus倒置相差顯微鏡觀察。 2細(xì)胞凋亡影響 維生素B1作用于sMMc-7721細(xì)胞48 h后，流式細(xì)胞儀測得的典型體凋亡峰。 維生素B1系列濃度的配制sMMc 721細(xì)胞的培養(yǎng)2.2.5技術(shù)線路：將維生素B1加入細(xì)胞培養(yǎng)皿中進(jìn)行藥物作用顯微鏡觀察染色觀察細(xì)胞凋亡流式定量檢測電鏡觀察 （鐘啟勝）3. 年度研究計(jì)劃及預(yù)期進(jìn)展3.1加