Western實驗步驟.doc

一、樣品制備對于Western Blotting實驗而言，樣品處理是關(guān)鍵步驟之一，獲得的蛋白樣品必須均質(zhì)、可溶，并解離成單個多肽亞基，且盡量減少相互間的聚集，使其最終僅依賴本身的分子量大小進(jìn)行分離。當(dāng)目標(biāo)蛋白的含量很低時，需要選取目標(biāo)蛋白含量較高的組織或細(xì)胞器（如核抽提物），或者通過免疫沉淀等方式進(jìn)行富集。通常樣品有重組蛋白、細(xì)胞和組織等。1. 樣品收集1）培養(yǎng)的細(xì)胞貼壁和懸浮細(xì)胞收集方式不同，細(xì)胞裂解液種類各異，推薦含SDS的凝膠加樣緩沖液裂解，煮沸即可。2）動物組織與細(xì)胞不同，組織塊由于體積較大，須預(yù)先經(jīng)破碎勻漿處理。2. 樣品定量樣品電泳前需測定蛋白濃度，以便保證上樣量一致，有利于后續(xù)定量或半定量分析。常用的蛋白質(zhì)濃度測定方法有好多種，其靈敏度和所需時間不同，且不同的方法會受不同干擾物質(zhì)的影響，實驗者可根據(jù)樣品制備方法（裂解液成分、去垢劑和還原劑種類等）自行選擇。幾種蛋白質(zhì)濃度測定方法比較優(yōu)點(diǎn)缺點(diǎn)Bradford法迅速、靈敏對各種純化蛋白質(zhì)反應(yīng)不同BCA法簡單、干擾少耗時Lowry法不同蛋白差別小干擾多，較慢注意事項：a. 應(yīng)盡量避免引入影響后續(xù)定量的雜蛋白（如細(xì)胞培養(yǎng)液、蛋白酶抑制劑等）及其他干擾物質(zhì)；b. 樣品濃度應(yīng)適中，1SDS凝膠加樣緩沖液建議用量：貼壁細(xì)胞按10cm2培養(yǎng)皿/0.1ml,懸浮細(xì)胞按5106細(xì)胞/0.1ml比例加入；c. SDS對蛋白質(zhì)變性和電泳分離至關(guān)重要，濃度應(yīng)控制在2-10%之間，并根據(jù)具體需要調(diào)整；d. 制備好的樣品可以在-20保存，但時間不宜過長，并避免反復(fù)凍融，否則蛋白會發(fā)生降解；e. 內(nèi)參對實驗結(jié)果至關(guān)重要，應(yīng)選擇合適的內(nèi)參。二、電泳電泳分為非變性凝膠電泳和變性凝膠電泳，Western Blotting中常用的是不連續(xù)緩沖系統(tǒng)下的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE），該法中由于變性的多肽與SDS結(jié)合而帶負(fù)電荷，在凝膠電泳中遷移率僅與多肽的分子量相關(guān)。凝膠的篩分特性取決于它的孔徑，而孔徑又是灌膠時所用丙烯酰胺和雙丙烯酰胺絕對濃度的函數(shù)。SDS聚丙烯酰胺凝膠的有效分離范圍丙烯酰胺濃度（%）線性分離范圍（KD）1512-431016-687.536-945.057-212注意事項：a. 根據(jù)目標(biāo)蛋白的分子量選擇合適濃度的凝膠，以達(dá)到最優(yōu)的分離效果和分辨率；b. 分離膠不宜灌注過滿，需要有一定的濃縮膠空間，否則起不到濃縮效果；c. 各泳道上樣體積最好大體一致且適中，體積偏差過大會相互擠壓導(dǎo)致條帶走形，為避免邊緣效應(yīng)，可在未加樣的泳道加入等量的樣品緩沖液；d. 電泳時應(yīng)保持電壓和電流穩(wěn)定，且不宜過高，否則會造成不規(guī)則的蛋白質(zhì)遷移帶；e. 如有特殊需要，可以使用梯度膠，高濃度丙烯酰胺可以使低分子量蛋白質(zhì)形成清晰的條帶，還能在一塊膠內(nèi)同時分離分子量范圍更大的蛋白質(zhì)。三、轉(zhuǎn)膜蛋白質(zhì)經(jīng)SDS-PAGE分離后，必須及時從凝膠中轉(zhuǎn)移到固相支持物上，固相支持物能牢固結(jié)合蛋白又不影響其抗原活性，而且支持物本身還有免疫反應(yīng)惰性，這使其比直接在凝膠上檢測更易操作，試劑用量更少，更省時，效果更好。蛋白質(zhì)從凝膠向膜轉(zhuǎn)移的過程普遍采用電轉(zhuǎn)印法，分為半干式和濕式轉(zhuǎn)印兩種模式，與SDS結(jié)合的蛋白由于帶有負(fù)電，在電場中向正極遷移，并最終結(jié)合在固相支持物上。兩種方法均卓有成效，且各有所長，實驗者可根據(jù)實驗情況不同進(jìn)行選擇。常用固相支持物硝酸纖維素（NC）膜尼龍膜聚偏二氟乙烯（PVDF）膜靈敏度和分辨率高高高背景低較高低能力80-110 ug/cm2400 ug/cm2125-200 ug/cm2（適合于SDS存在下與蛋白質(zhì)的結(jié)合）材料質(zhì)地干的NC膜易脆軟而結(jié)實機(jī)械強(qiáng)度高溶劑耐受性無無有操作程序緩沖液潤濕，避免氣泡緩沖液潤濕使用前100%甲醇潤濕檢測方式常規(guī)染色，可用于放射性和非放射性檢測不能用陰離子染料常規(guī)染色，可用考馬斯亮藍(lán)染色，可用于ECL檢測，快速免疫檢測適用范圍0.45um： 一般蛋白0.2um： 20kD蛋白0.1um：7kD蛋白低濃度小分子蛋白、酸性蛋白、糖蛋白和蛋白多糖（主要用在核酸檢測中）糖蛋白檢測和蛋白質(zhì)測序價格較便宜便宜較貴注意事項a. 樣品屬性、膜類型、膠濃度以及轉(zhuǎn)移緩沖液均會影響蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)移效率，比如小分子量蛋白與大分子量蛋白相比，遷移迅速，但結(jié)合不牢固；b. 蛋白與固相支持物結(jié)合的程度受多種因素影響，如膜屬性（孔徑和類型），緩沖液屬性（pH值、鹽離子種類、鹽濃度、去垢劑等），如實驗結(jié)果不佳，可分別進(jìn)行優(yōu)化；c. 如果轉(zhuǎn)膜與電泳的緩沖液系統(tǒng)不同，轉(zhuǎn)膜前應(yīng)將凝膠在轉(zhuǎn)膜緩沖液中平衡，防止凝膠膨脹或收縮，以保證條帶清晰完整；d. 提高蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移效率的方法：轉(zhuǎn)移緩沖液中加入甲醇或低濃度的SDS （0.02-0.1%），使用小孔徑膜，轉(zhuǎn)移后立即用戊二醛交聯(lián)；e. 轉(zhuǎn)膜時間和電流大小可根據(jù)蛋白分子量大小靈活調(diào)整；f. 轉(zhuǎn)移效果可通過染膠（考馬斯亮藍(lán)染色或銀染）或染膜（麗春紅S染色、印度墨汁染色）來鑒定。四、封閉在進(jìn)行抗體雜交之前，需要采用異源性蛋白質(zhì)先對轉(zhuǎn)印膜進(jìn)行封閉，防止免疫試劑的非特異性吸附，從而降低背景，增加靈敏度，提高信噪比。常用封閉物有脫脂奶粉和BSA（稀釋于不同的緩沖液中），但不同的抗原-抗體反應(yīng)，封閉條件均不相同，沒有適合所有系統(tǒng)的封閉液，具體封閉條件（包括封閉液濃度、緩沖液種類、封閉時間、溫度等）需自行優(yōu)化。注意事項a. 影響非特異性結(jié)合的因素很多，針對不同的免疫原，其封閉條件均可進(jìn)行優(yōu)化，沒有通用的封閉液，因為每個抗原-抗體反應(yīng)都具有獨(dú)特的性質(zhì)；b. 在選擇封閉物時，最重要的標(biāo)準(zhǔn)是信噪比，封閉條件不足，會導(dǎo)致過多的背景噪音，封閉條件過度，會造成信號變?nèi)?；c. 可根據(jù)不同的檢測系統(tǒng)（堿性磷酸酶或辣根過氧化物酶）、蛋白質(zhì)屬性（分子量大?。┻x擇適當(dāng)?shù)姆忾]物及緩沖液（PBS或TBS）。五、雜交封閉后，目標(biāo)蛋白便與特異性的一抗進(jìn)行免疫反應(yīng)，一抗可以是標(biāo)記的，也可以是非標(biāo)記的。標(biāo)記的一抗與免疫原結(jié)合后，可直接進(jìn)行檢測（直接法），降低了背景和非特異性結(jié)合，但信號較弱。非標(biāo)記的一抗配合標(biāo)記的二抗使用（間接法），對信號有級聯(lián)放大作用，可以增加靈敏性和信噪比。二抗既可標(biāo)記放射性同位素，也可標(biāo)記染料或其他分子，或與酶偶聯(lián)。常用的酶包括堿性磷酸酶（AP）和辣根過氧化物酶（HRP），通過與底物反應(yīng)產(chǎn)生光信號。注意事項a. 標(biāo)記方法的選擇視靈敏度和易操作性而定，通常有四種標(biāo)記系統(tǒng)：化學(xué)發(fā)光、放射性同位素、熒光、化學(xué)熒光；b. 一般而言，一抗常用非標(biāo)記的，但遇到特殊實驗需要，可以對一抗進(jìn)行相應(yīng)標(biāo)記；c. 單抗和多抗各有利弊，多抗便宜、制作省時、親和力高，但特異性不佳；單抗特異性好、純度高、重復(fù)性好，但制作工期長，價格較高；d. 一抗稀釋比例及反應(yīng)條件（溫度、時間）視抗體效價而定，并需根據(jù)實驗結(jié)果進(jìn)行優(yōu)化，二抗一般可固定一個反應(yīng)條件（建議1:4000、室溫1小時）；e. 清洗步驟對移除未結(jié)合試劑、降低背景、增加信噪比至關(guān)重要，清洗不夠會造成較高背景，清洗過度會導(dǎo)致靈敏度降低，清洗液的成分可適當(dāng)調(diào)整。六、顯色發(fā)光根據(jù)二抗的標(biāo)記物不同，其顯色方法也不同，并通過膠片或影像系統(tǒng)（CCD）