HIV感染的實驗診斷.ppt

HIV感染的實驗診斷 白立石北京市疾病預(yù)防控制中心艾滋病確認(rèn)中心2008年5月 一 HIV感染后的免疫和病毒學(xué) HIV的基因組結(jié)構(gòu)和蛋白 基質(zhì)衣殼核衣殼表面糖蛋白跨膜糖蛋白 蛋白酶反轉(zhuǎn)錄酶整合酶 HIV結(jié)構(gòu)基因 有3個env 核苷酸5781 8360 編碼包膜蛋白p160 120 41等 gag 核苷酸310 1860 編碼病毒核心 衣殼蛋白p55 24 15 17 pol 核苷酸1629 4673 編碼逆轉(zhuǎn)錄酶 RT p66 51 32 11等 HIV調(diào)節(jié)基因 有6個tat 上調(diào)mRNA 促病毒復(fù)制 啟動rev 調(diào)節(jié)病毒mRNA 開關(guān)vif 增強(qiáng)出芽 釋放新病毒顆粒 感染因子nef 下調(diào)mRNA 抑病毒復(fù)制 制動vpu 僅見于HIV 1 功能不詳 vpx 僅見于HIV 2 功能不詳 5days Imagefrom KahnandWalker M D NEJM1998 Volume339 33 39July2 感染HIV后的血清學(xué)變化 HIVRNA 濃度 p24Ag P24Ag Anti gp41 120 160 Anti p24 55 感染 1周2周6周12周8 10年 急性期 潛伏期 艾滋病期 檢出線 HIV 1早期感染病毒標(biāo)志物的動態(tài)觀察 窗口期 血漿RNA P24 前病毒DNA HIV抗體 ELISA HIV抗體 WB HIV感染者的三種臨床轉(zhuǎn)歸 Virus CD4 CD8aHIV CD4 CD4 CD8 CD8aHIV Virus Virus 典型8 10y 快速 4 5y 2 緩慢 長期不進(jìn)展 10y 2 二 HIV酶聯(lián)篩查檢測方法和試劑 感染急性期 窗口期 檢測試劑以ELISA為主 還有PA 斑點(diǎn)免疫膠體金和免疫層析 ELISA試劑為HIV1 2型 包括M和O組 N組不包括但很少 三四五代酶聯(lián)試劑的差異和使用策略 三代成熟質(zhì)量穩(wěn)定 窗口期20d 四代提前4 9d 質(zhì)量不穩(wěn)定 用于血站急性感染的檢測 篩查試驗和確認(rèn)試驗的差異 酶聯(lián)試驗敏感性高于確認(rèn)試驗 四代試劑敏感性更高 確認(rèn)陰性的不一定是真陰性 一 HIV抗體ELISA檢測試劑 血液 第三代 雙抗原夾心法 可檢測所有類型抗體 由于能檢出IgM抗體 縮短了窗口期 有報道說較第二代產(chǎn)品平均可提前5天作出診斷 第四代 雙抗原 抗體 夾心法 將HIVP24抗體和HIV抗原同時包被 再加入待檢血清 最后加入酶標(biāo)記的HIV抗原和HIVP24單克隆抗體 同時檢測血清中的HIVP24抗原和HIV抗體 第五代 HIV抗體和P24抗原實現(xiàn)分別檢測 真正實現(xiàn)早期診斷 FourthGeneration ThirdGeneration SecondGeneration IgM IgG 各種HIV檢測方法平均窗口期 方法平均天數(shù)第2代EIA45第3代EIA22P24抗原16HIVRNA11 二 檢測試劑的質(zhì)量指標(biāo)靈敏度診斷試驗的靈敏度有兩個不同意義 1 代表一個試驗?zāi)軝z測最少量被分析物 如抗體 的能力 通?？蓪﹃栃匝暹M(jìn)行稀釋以確認(rèn)哪個試驗更敏感 2 指某試驗檢出陽性的能力 無假陰性 一個試驗有可能檢出很少量的某抗體 但也可因試驗中缺少適當(dāng)?shù)目乖┑粢恍╆栃詷悠?2 特異性指某試驗正確鑒定所有陰性的能力 無假陽性 大部分HIV篩查試驗不是100 特異 可用公式計算真陰性特異度 100 真陰性 假陽性注 公式中真陰性指試驗中所能檢測的真陰性數(shù) 如100份血清 5份真陽性 95份真陰性 與參考試驗比較 某試驗檢出6份陽性 一份假陽性 則特異性 94 94 1 100 98 9 3 試驗效率指某試驗正確鑒定所有陽性和陰性的總體能力 無假陽性或假陰性 是靈敏度和特異性的綜合指標(biāo) 反映了該試驗的總的效率 真陽性 真陰性試驗效率 100 真陽性 假陽性 真陰性 假陰性注 公式中真陽性和真陰性指試驗數(shù)目 在以上例子中 檢測100份血清 5份真陽性 95份真陰性 1份假陽性 1份假陰性 因此4 94試驗效率 100 98 4 1 94 1 4 預(yù)測值預(yù)測值與以上的參數(shù)不同 它描述的是考慮了被檢人群中感染的流行因素后的試驗評價 陽性預(yù)測值 PPV 定義為在所有陽性結(jié)果人群中感染個體所占比例 陰性預(yù)測值 NPV 定義為在所有陰性結(jié)果人群中未感染個體所占比例 真陽性陽性預(yù)測值 100 真陽性 假陽性真陰性陰性預(yù)測值 100 真陰性 假陰性注 公式中真陽性和真陰性指試驗數(shù)目 在感染流行率較高 5 的人群中1000人受檢 50份真陽性 已感染 950份真陰性 未感染 5份假陽性 試驗結(jié)果 5份假陰性 試驗結(jié)果 計算PPV 45 45 5 100 90 NPV 945 945 5 100 99 5 在另一人群有相同的結(jié)果 即相同數(shù)量的假陽性和假陰性 在感染流行率較低的人群 0 7 中1000人受檢 7份真陽性 已感染 993份真陰性 未感染 5份假陽性 試驗結(jié)果 5份假陰性 試驗結(jié)果 計算PPV 2 2 5 28 6 NPV 988 988 5 99 5 5 艾滋病病原診斷中的幾個問題 明確不同實驗方法的意義和適應(yīng)范圍 HIV血清學(xué)檢測方法可分初篩和確證兩類 HIV初篩試驗特異性不夠強(qiáng) 有時會造成一些假陽性結(jié)果 故在初篩試驗出現(xiàn)陽性結(jié)果時 應(yīng)再重復(fù)試驗 若仍為陽性再用確證試驗 WestBlot 去證實 但一些非感染者的血液也會對某些抗原顯示反應(yīng) 出現(xiàn)的條帶不夠判為陽性的標(biāo)準(zhǔn) 在正常的非感染者人群中發(fā)生比例 15 所以如果用WB來測ELISA陰性者的血清 有些標(biāo)本被視為不確定 出現(xiàn)不確定結(jié)果時 可能是HIV早期感染或是非特異反應(yīng) 應(yīng)在1 6個月后復(fù)查 并結(jié)合個體的臨床表現(xiàn) 感染因素 WB帶型等綜合分析后做出結(jié)論 針對HIV感染不同時期選用不同的檢測手段 HIV感染后兩周內(nèi) 無法查到抗體 兩周后出現(xiàn)病毒血癥 可用P24抗原檢測方法或測逆轉(zhuǎn)錄酶活性 6 8周后抗體產(chǎn)生時 進(jìn)行抗體檢測 診斷HIV感染在早期可檢測抗原 而在感染后的大多數(shù)時間 可用血清學(xué)方法診斷 HIV抗體測定的預(yù)測值 試劑的敏感性和特異性可衡量優(yōu)劣 但不能完全決定一個測定結(jié)果正確與否的可能性大小 與預(yù)測值關(guān)系更大 預(yù)測值除與試劑好壞有關(guān)外 還取決于測定對象本身患病率的高低 由表1可以看出 在用ELISA法對高危人群檢測時 其陽性預(yù)測值為99 98 而在非高危人群中 陽性預(yù)測值僅為18 94 即查出陽性結(jié)果是真陽性的機(jī)率只有18 94 反之陰性結(jié)果的機(jī)率為99 997 表1ELISA法HIV1抗體測定的預(yù)示值 HIV抗體檢測反應(yīng)強(qiáng)度與HIV感染的概率 ELISA法可根據(jù)光密度 OD 值的強(qiáng)度直接確定 反應(yīng)越強(qiáng)的血清 含有HIV抗體的可能性就越大 表2中正常獻(xiàn)血員 感染率30 10萬 中等強(qiáng)度反應(yīng)時 HIV抗體陽性概率僅為1 高強(qiáng)度反應(yīng)時 則為86 1 見表2 不僅要看陰陽結(jié)果 還要看反應(yīng)強(qiáng)度或S CO比值 表2HIV感染機(jī)率與ELISA反應(yīng)強(qiáng)度的關(guān)系 注 1 數(shù)字表示相應(yīng)強(qiáng)度反應(yīng)的血清中含有HIV抗體的概率2 低度為S CO6 三 確認(rèn)試驗 WB為主 還有 線性免疫試驗 LIA 放射免疫沉淀試驗 RIPA 和免疫熒光試驗 IFA WB存有培養(yǎng)病毒的宿主細(xì)胞成分 容易出現(xiàn)非特異性反應(yīng)造成不確定結(jié)果 LIA使用重組蛋白 多肽 非特異性大大減少 試劑盒有INNO LIA Pepti Lav等 IFA很少使用 一 HIV抗體強(qiáng)度與抗體帶型的關(guān)系 二 HIV病毒載量與抗體帶型的關(guān)系 三 造成WB假陽性或不確定的原因 1 實驗室操作中 陰性樣本被污染或洗滌不徹底 2 HIV感染急性期 窗口期附近 僅顯示gp160或120 或P24 P31 P55帶 此時ELISA往往已顯示陽性反應(yīng)3 晚期AIDS病人 部分抗體如P24 P31丟失4 其他病毒感染的交叉反應(yīng) 如風(fēng)疹 麻疹 腮腺炎等5 自身免疫病 高丙種球蛋白血癥 全身性紅斑狼瘡 6 腎衰竭和血透析7 遺傳性胰腺囊腫8 多次懷孕或輸血9 肝病10 乙肝 狂犬等疫苗注射 使用胸腺肽 11 線粒體核酸和T細(xì)胞白細(xì)胞抗原引起的抗體 在無高危行為的獻(xiàn)血和孕婦人群中 WB不確定率10 15 甚至高達(dá)32 Gag蛋白抗體條帶最常見 ELISA篩查陽性結(jié)果中 WB不確定占4 20 俄羅斯報告占12 7 我國 125份確認(rèn)為HIV 1抗體陽性 條帶出現(xiàn)百分率為 gp160 p24為100 gp120 gp41 p66 p51和p31在96 以上 p17 p55分別為86 4 和85 6 上海 36例WB試驗gp120和p24雙陽性者的跟蹤隨訪和核酸輔助診斷發(fā)現(xiàn) 至少24例可判定為HIV 1感染 5例樣本的核酸測定結(jié)果與血清學(xué)隨訪檢測結(jié)果的符合率達(dá)到100 25例隨訪到的對象中 18例樣本平均17天后條帶有明顯進(jìn)展 可以判定為HIV抗體陽轉(zhuǎn) 四 WB不確定結(jié)果的有關(guān)數(shù)據(jù) 五 假陰性結(jié)果 指EIA WB的假陰性原因急性感染后的抗體遲反應(yīng)不同HIV毒株型發(fā)病晚期抗體消失窗口期 幾周到6個月 與當(dāng)?shù)豀IV流行率有關(guān)HIV亞型 M N O組間差異 六 確認(rèn)試驗不確定標(biāo)本的常規(guī)處理 按照 全國艾滋病檢測技術(shù)規(guī)范 2004年版 的要求 只能作 3個月后復(fù)檢 的處理 三個月后復(fù)檢1次 連續(xù)2次 共6個月 其轉(zhuǎn)歸有兩種可能 仍呈現(xiàn)不確定或陰性 則診斷為HIV抗體陰性 帶型發(fā)生進(jìn)展 符合HIV抗體陽性判斷標(biāo)準(zhǔn) 則診斷為HIV抗體陽性 后者是真正的窗口期感染者 一般為2 3個月 最長6個月 只占很小的比例 大多數(shù)為非感染者 但由于WB反應(yīng)的敏感性而出現(xiàn)條帶 如有必要 可用輔助診斷方法對不確定樣本進(jìn)行實驗診斷 確認(rèn)結(jié)果不確定標(biāo)本的輔助診斷 1 病毒載量 RT PCR NASBA b DNA 高拷貝的結(jié)果提示感染 小于18個月嬰兒在10000拷貝 毫升應(yīng)做HIV感染處理 注意不同方法間結(jié)果的差異 陰性不排除感染 2 免疫標(biāo)志物 CD4 CD8 CTL 微球蛋白和Neopterin等 CD4計數(shù)常用 CD4 CD8小于1提示感染 3 核酸定性 DNA PCR或RT PCR 陽性不能單獨(dú)用于感染的診斷 陰性不排除感染 4 P24抗原檢測 陽性結(jié)果需經(jīng)中和實驗確認(rèn) 才提示HIV感染 陰性不排除感染 因敏感性低 30 80 5 病毒分離 特異性好 但敏感性不高 潛伏期難分離6 流行病學(xué)調(diào)查和臨床癥狀 近期是否有HIV高危行為 是否有急性期的相關(guān)癥狀 四 HIV感染的早期 窗口期 診斷 1 早期診斷的意義通常窗口期急性感染時出現(xiàn)病毒血癥 此期間病毒載量 P24抗原均很高 是HIV快速復(fù)制階段 具有高感染力 以下情況下 非常有必要盡快開展HIV感染早期診斷 1 安全用血 窗口期血液篩查 2 個體需求 暴露后診斷 包括通過輸血 靜脈吸毒