蝴蝶蘭的組織培養(yǎng).doc

蝴蝶蘭的組織培養(yǎng)蝴蝶蘭phalaenopsis 為蘭科蝴蝶蘭屬植物,它是一種熱帶氣生蘭,俗稱“洋蘭”。蝴蝶蘭花型似蝴蝶,形態(tài)美妙、色彩豐富、花期長(zhǎng),在熱帶蘭中素有“蘭花皇后”之美稱,。蝴蝶蘭種類豐富,分布廣,東起菲律賓、新幾內(nèi)亞,南達(dá)澳大利亞北部,西蘇門答臘,北到我國(guó)臺(tái)灣、云南、四川西部均有原種(野生的蝴蝶蘭) 存在,約有50 多種,其中我國(guó)有7 種,全部為附生蘭。蝴蝶蘭商品化大規(guī)模栽培十分成功，是近年來(lái)在國(guó)際花卉市場(chǎng)上最受歡迎的洋蘭。從離體器官誘導(dǎo)產(chǎn)生類原球莖，通過(guò)類原球莖的增殖培養(yǎng)，得到大量幼苗，為實(shí)現(xiàn)蝴蝶蘭工廠化生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。類原球莖是一類呈珠粒狀的幼嫩器官（種子萌發(fā)時(shí)先是胚的膨大,種皮破裂,一定時(shí)間后發(fā)育成肉眼可見淺黃色的原胚呈球狀,稱為原球莖，由其它外植體誘導(dǎo)產(chǎn)生的稱類原球莖），在蘭科植物中多以這種器官發(fā)育、增殖和分化。蝴蝶蘭的組培快繁有胚培養(yǎng)、葉片培養(yǎng)和腋芽培養(yǎng),腋芽培養(yǎng)形成試管苗,再以叢生芽的方式增殖快繁,可以有效地保持母本的優(yōu)良性狀,變異率最低。1 材料與方法（1）材料 取已過(guò)盛花期帶休眠芽的花梗作為外植體材料。（2）材料消毒與接種 切下其帶芽莖段,長(zhǎng)約2 - 3cm ,用自來(lái)水清洗干凈,在飽和漂白粉上清液中浸泡15 min ,浸泡時(shí)不斷攪動(dòng),浸泡后的莖段用流水沖洗干凈,置于超凈工作臺(tái)上,先用75 %的酒精消毒30 s ,無(wú)菌水清洗1 次,再用0. 1 %的升汞浸泡10 min ,經(jīng)無(wú)菌水沖洗數(shù)次,將帶芽莖段接種到經(jīng)設(shè)計(jì)的不同激素組合的誘導(dǎo)培養(yǎng)基上,重復(fù)3 。（3）培養(yǎng)基的配制 花梗腋芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基為1/ 2MS +BA2. 5 mg/L + NAA0. 2 mg/L 。 增殖培養(yǎng)基為1/ 2 MS + BA3. 5 mg/L + KT1. 0 mg/L + NAA0. 5 mg/L + 椰乳10 %。 生根培養(yǎng)基為1/ 2MS + BA1. 5 mg/L +NAA0. 3 mg/L + 80 g/L 香蕉泥 以上培養(yǎng)基p H 均為5. 52 結(jié)果 在培養(yǎng)條件每天光照12 h ,光強(qiáng)1 600Lx ,溫度25 2 獲得以下效果。 （1）誘導(dǎo)培養(yǎng)效果：蝴蝶蘭花梗接種到不同激素濃度的培養(yǎng)基上,生長(zhǎng)1 周后在花梗的基部有褐色物質(zhì)產(chǎn)生,腋芽開始萌動(dòng),1 月后腋芽可以長(zhǎng)到1. 5 cm 高，出芽率可達(dá)50。 （2）增殖培養(yǎng)效果：將長(zhǎng)出的芽選取約1. 5cm 的苗，取出后切去葉片和基部褐化部分,轉(zhuǎn)接到增殖培養(yǎng)基中,40 d 后，增殖倍數(shù)可達(dá)到3倍以上。 （3）生根培養(yǎng)效果：將高約2. 0 cm 的蝴蝶蘭試管苗接種到生根培養(yǎng)基中, 50 d 后，全部生根，平均生根3.5條，長(zhǎng)2.5cm。 （4）壯苗培養(yǎng)與馴化移栽：壯苗。生根組培苗壯苗培養(yǎng)基1/2MS+ 蔗糖10g/L+ 瓊脂粉3.5 g/L+ 活性炭1.5 g/L ，pH5.4，溫度( 252) , 光照強(qiáng)度2000Lx, 光照時(shí)間14h/d。培養(yǎng)15d 后移栽。馴化：室內(nèi)開瓶煉苗3d室外煉苗3d。 移栽基質(zhì)：最適合的栽培基質(zhì)為水苔，椰糠也是良好的移栽基質(zhì)。3 討論（1）蝴蝶蘭和其他蘭科植物一樣,在組培快繁生產(chǎn)中存在著易褐化死亡的問(wèn)題,因此如何克服褐變成了組培快繁生產(chǎn)成功與否的關(guān)鍵，活性炭2 g/L ,或PVP 1 g/L效果顯著；適時(shí)切除培養(yǎng)物的褐化部分并及時(shí)更換新鮮培養(yǎng)基，能有效抑制外植體褐變死亡；培養(yǎng)基中加入10%椰子水，也能促進(jìn)原球莖的生長(zhǎng)，減少原球莖增殖過(guò)程中的褐變；蝴蝶蘭的群體效應(yīng)很明顯，單芽容易褐化死亡，且增殖較慢，因此，剛誘導(dǎo)出的原球莖狀體不能過(guò)早切割轉(zhuǎn)移，在繼代階段接種時(shí)，應(yīng)盡量避免切成單芽，增殖時(shí)切塊也不宜過(guò)小，否則容易褐化死亡；添加香蕉汁對(duì)蝴蝶蘭原球莖形成及幼苗生長(zhǎng)具有明顯的促進(jìn)作用。（2）另有報(bào)道：蝴蝶蘭原球莖的誘導(dǎo)主要受外植體、培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件等因素的共同影響,其中,外植體最難以控制,這與外植體本身的生長(zhǎng)發(fā)育和生理生化狀態(tài)有關(guān)。因此,對(duì)外植體的篩選是組培中較關(guān)鍵的技術(shù)。蝴蝶蘭組織培養(yǎng)過(guò)程中,采用同樣培養(yǎng)基處理時(shí),莖尖比葉片、花梗側(cè)芽作為外植體效果較好。)在激素濃度相同條件下, 1 /2MS、MS、White、B5 作為基本培養(yǎng)基均能誘導(dǎo)出原球莖,但MS效果最好,且誘導(dǎo)的原球莖數(shù)量多,密度大。以MS作為基本培養(yǎng)基對(duì)蝴蝶蘭原球莖進(jìn)行增殖培養(yǎng),附加NAA 1. 00 mg/L和6BA 2. 00 mg/L時(shí),增殖效果最好。蝴蝶蘭生根過(guò)程中,在1 /2MS培養(yǎng)基上根生長(zhǎng)最快,生根率可達(dá)94. 42%,根長(zhǎng)可達(dá)0. 86 cm,長(zhǎng)勢(shì)最粗壯,數(shù)量最多,說(shuō)明低濃度的鹽分有利于側(cè)根發(fā)生?；九囵B(yǎng)基中添加蔗糖濃度為3%,瓊脂為6. 00 g/L,活性炭為1. 00 g/L; pH值為5. 60 5. 80;培養(yǎng)溫度為( 25 1) ;光照時(shí)間為13h /d;光照強(qiáng)度為1 5002 000 lx。 （3）組織培養(yǎng)是蝴蝶蘭快速繁殖的有效途徑，主要通過(guò)兩條途徑：一是利用種子無(wú)菌發(fā)芽，二是從離體器官誘導(dǎo)產(chǎn)生原球莖，通過(guò)原球莖的增殖培養(yǎng)，得到大量幼苗。早在1949 年，Potor利用無(wú)菌培養(yǎng)技術(shù)成功地促使蝴蝶蘭花梗上的休眠芽發(fā)育成完整植株，該方法經(jīng)過(guò)其他研究人員改進(jìn)后，曾一度成為蝴蝶蘭的主要無(wú)性繁殖方式。1974 年，Intuwong等利用蝴蝶蘭莖尖誘導(dǎo)產(chǎn)生了原球莖狀體，再由原球莖分化成植株，為實(shí)現(xiàn)蝴蝶蘭工廠化生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。蝴蝶蘭的組織培養(yǎng)中有幾個(gè)關(guān)鍵的時(shí)期：原球莖的誘導(dǎo)、原球莖的繼代增殖、壯苗的培育。蝴蝶蘭組培的快繁技術(shù)，包括外植體的選擇、不同基本培養(yǎng)基、激素、添加物對(duì)其增殖與分化的影響、外植體褐變的防治以及生根壯苗的方法等。 外植體的選擇：誘導(dǎo)蝴蝶蘭原球莖采用的外植體主要有根段、花梗苗根尖、花梗腋芽、莖尖、葉片、胚、花葶節(jié)間（花葶：地上無(wú)莖植物從地表，通常自基生蓮座抽出的無(wú)葉花序梗）、花梗節(jié)或花梗節(jié)間切段、種子等。蝴蝶蘭不同外植體的成活率有差異，其中花梗側(cè)芽的成活率最高，其次為花梗，葉片和根尖最差。針對(duì)不同外植體，取材方法也不同，通常取花梗節(jié)之間12cm 長(zhǎng)的幼嫩部分，切取長(zhǎng)23mm 的切段作為外植體。如利用23cm 長(zhǎng)的根尖段，將其切成0.50.8cm，接種2 周后根端切口處開始膨大，產(chǎn)生淡綠色瘤狀愈傷組織；采用無(wú)菌種子苗莖尖作為外植體時(shí)，培養(yǎng)30d 后基部出現(xiàn)愈傷組織，出愈率達(dá)85%以上；而利用正在培養(yǎng)的花梗苗生長(zhǎng)旺盛的根尖進(jìn)行培養(yǎng)，20d 左右外植體膨大且表面顏色明顯加深；用花梗腋芽為起始材料誘導(dǎo)花葶，由花葶節(jié)間切片可以高頻率誘導(dǎo)分化不定芽。 基本培養(yǎng)基的選擇：蝴蝶蘭組織培養(yǎng)所采用的基本培養(yǎng)基包括 MS、1/2MS、VW、B5、KC、花寶及其改良型等。但由于蝴蝶蘭品種差異及外植體來(lái)源不同對(duì)最適培養(yǎng)基的選擇是不同的：以紅花品種為試材，以改良KC 的效果最好，1/2MS 次之，MS 最差；蝴蝶蘭的原球莖增殖培養(yǎng)以較低的無(wú)機(jī)鹽濃度為好，大量元素對(duì)原球莖增殖有很大影響，1/2MS 對(duì)原球莖增殖最有利。在花梗節(jié)間切段誘導(dǎo)原球莖的實(shí)驗(yàn)過(guò)程中對(duì)培養(yǎng)基進(jìn)行篩選，也發(fā)現(xiàn)1/2MS 或改良MS 較MS 效果好，減少M(fèi)S 中大量元素和部分微量元素及有機(jī)成分，適當(dāng)增加少量的葉酸和生物素有利于原球莖的增殖生長(zhǎng)；但MS 培養(yǎng)基最適合蝴蝶蘭種子的萌發(fā)。也有報(bào)道B5 培養(yǎng)基更有利于蝴蝶蘭根段原球莖的誘導(dǎo)和增殖。 植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)蝴蝶蘭原球莖增殖與分化的影響：蝴蝶蘭組織培養(yǎng)中常用的細(xì)胞分裂素為6-BA，較高濃度（18mg/L）的6-BA 能促進(jìn)蝴蝶蘭原球莖增殖，較低濃度（0.10.5mg/L）的6-BA 則能促進(jìn)原球莖分化。有研究表明，低濃度6-BA有利于原球莖的增殖，而高濃度（6mg/L）的6-BA 刺激多酚氧化酶作用，使原球莖容易產(chǎn)生褐化。低濃度的NAA 對(duì)原球莖增殖和出苗均有促進(jìn)作用，高濃度的則不利。研究表明，適宜濃度的6-BA 配合較低濃度的NAA，更有利于原球莖的增殖，2.0mg/L 6-BA 和0.3mg/L NAA 配合使用是蝴蝶蘭原球莖增殖的最佳組合。高濃度的NAA 對(duì)蝴蝶蘭原球莖增殖有一定的抑制作用，NAA 濃度從1mg/L 增加到3mg/L，增殖率相應(yīng)從98.3%下降到38.3%；采用3.0mg/L 6-BA + 0.2mg/L NAA 配方，能夠有效的誘導(dǎo)原球莖，同時(shí)還發(fā)現(xiàn)提高激素配比（5.0mg/L 6-BA + 0.2mg/LNAA + 活性碳1.0g/L），則有利于原球莖的增殖，提高增殖系數(shù)，且不用轉(zhuǎn)接就可直接生根成苗，避免轉(zhuǎn)接過(guò)程帶來(lái)的污染損失，簡(jiǎn)化了培養(yǎng)過(guò)程，因而是一種值得推廣的方法；此外，在培養(yǎng)基中加入1.0mg/L GA3 對(duì)原球莖分化成芽有一定的抑制效果，為獲得大量原球莖而避免分化成芽，適當(dāng)添加GA3 是有一定作用的。 添加物對(duì)蝴蝶蘭原球莖增殖和分化的影響：一些氨基酸類添加物，也可以作為培養(yǎng)基中的有機(jī)氮源，例如甘氨酸能促進(jìn)離體根的生長(zhǎng)。絲氨酸和谷氨酰胺有利于花藥、胚狀體或不定芽的分化。水解酪蛋白和水解乳蛋白對(duì)胚狀體或不定芽或多胚的分化有良好的促進(jìn)作用。而在培養(yǎng)基中加入一些天然有機(jī)物，如椰乳、香蕉泥、番茄汁等，也能提供一些必要的微量營(yíng)養(yǎng)成分、生理活性物質(zhì)和生長(zhǎng)激素等，如加入100200mg/L 香蕉泥，具有較大的pH 緩沖作用，對(duì)幼苗發(fā)育有促進(jìn)作用。水解酪蛋白對(duì)蝴蝶蘭原球莖增殖有明顯促進(jìn)作用，而水解酪蛋白和香蕉勻漿相結(jié)合卻對(duì)原球莖增殖有抑制作用，有機(jī)添加物之間的相互作用或有機(jī)添加物與培養(yǎng)基之間的相互作用可能對(duì)原球莖增殖有影響。許多研究也表明，添加適量的香蕉泥、椰乳或含膠質(zhì)的果菜汁等均對(duì)原球莖增殖有明顯促進(jìn)效果。培養(yǎng)基中添加活性炭，低濃度（0.51.0g/L）時(shí)對(duì)原球莖增殖影響不明顯，高濃度（2.03.0g/L）時(shí)對(duì)原球莖增殖有促進(jìn)作用，但原球莖有黃化現(xiàn)象。蔗糖作為培養(yǎng)基的能源物質(zhì)和滲透調(diào)節(jié)劑，對(duì)原球莖的增殖生長(zhǎng)影響較大，2%的蔗糖濃度有利于原球莖生長(zhǎng)，2%3%蔗糖促進(jìn)芽的形成，5%的蔗糖有利于根的分化和生長(zhǎng)。 生根壯苗：壯苗培養(yǎng)是提高移栽成活率的一項(xiàng)重要措施，生根效果也直接影響到生產(chǎn)效益。此階段的關(guān)鍵在于嚴(yán)格篩選激素的種類和濃度，一般需降低培養(yǎng)基的激素含量，以便形成健壯苗。常用的生長(zhǎng)素有IBA(0.31.5mg/L)、NAA(0.10.8mg/L)。GA3 0.1mg/L + NAA 0.1mg/L 的組合能明顯提高生根率，且植株健壯，長(zhǎng)勢(shì)好。無(wú)機(jī)營(yíng)養(yǎng)是影響蝴蝶蘭叢生芽生根率的主要原因，蔗糖次之，NAA 和多效唑影響程度較弱。（4）.提高原球莖的增殖率：組織培養(yǎng)是蝴蝶蘭快速繁殖的有效途徑,通過(guò)無(wú)性快繁,繼代培養(yǎng),然后誘