（植物病理學專業(yè)論文）稻瘟菌定殖與擴展過程中特異表達基因分析.pdf

福建農林大學碩士學位論文 摘要 稻瘟病菌與水稻互作系統(tǒng)，是理想的病原菌與植物互作的模式系統(tǒng)，也是病害生態(tài) 控制的理想模式。為了探索稻瘟病菌與水稻互作的分子機理，本文采用基因芯片的方法 篩選了稻瘟病菌在定殖與擴展過程中與水稻互作的特異表達基因，并對這些基因進行初 步的分析和部分基因r t - p c r 驗證。 基因芯片結果顯示，若以兩倍的變化作為標準，在稻瘟病菌定殖和擴展過程中，稻 瘟病菌共有3 3 0 9 個基因發(fā)生上調，3 4 5 3 個基因發(fā)生下調；水稻有9 7 4 個基因上調，1 1 3 4 個基因下調。參照n c b i 數(shù)據庫、稻瘟病菌數(shù)據庫和水稻基因組數(shù)據庫結合p r o t c o m p8 0 軟件，對基因芯片結果中稻瘟病菌中上調最大的1 2 2 個基因，下調最大的6 7 個基因； 水稻上調最大的6 2 個基因，下調最大的7 個基因，進行基因表達產物的分析和亞細胞 定位。并對基因芯片中稻瘟病菌上調最大的2 0 個基因進行r t - p c r 的驗證，結果發(fā)現(xiàn) 其中有1 8 個基因與基因芯片結果一致，有2 個基因未能擴增得到產物。 主題詞：稻瘟病菌水稻基因芯片互作差異表達 福建農林大學碩士學位論文 a b s t r a c t t h es y s t e mo fr i c e m a g n a p o r t h eg r i s e a , i sa ni d e a lm o d e ls y s t e mo ft h ep l a n t s i n t e r a c t i o nw i t ht h e i rp a t h o g e n sa n dt h ee c o l o g i c a lc o n t r o lo fp l a n td i s e a s e i no r d e rt o u n d e r s t a n dt h ei n t e r a c t i o nm o l e c u l a rm e c h a n i s mb e t w e e nm a g n a p o r t h eg r i s e aa n dr i c e ，t h e s p e c i f i ce x p r e s s i o ng e n e sd u r i n gt h ep a t h o g e ni n f e c t i o nw e r es c r e e n e do u tb yt h et e c h n o l o g y o fg e n ec h i pa n ds o m eo ft h e mw e r ev e r i f i e db yr t - p c r 。 t h er e s u l to fg e n ec h i pe x p e r i m e n ts h o w e dt h a t ，f o rm o r et h a n2 - f o l dc h a n g e ，t h e r ew e r e 3 3 0 9u p - r e g u l a t e dg e n e sa n d3 4 5 3d o w n r e g u l a t e dg e n e sf r o mm a g n a p o r t h e g r i s e a ；a n d9 7 4 u p r e g u l a t e dg e n e sa n d113 4d o w n r e g u l a t e dg e n e sf r o mr i c e t h en c b i ，m a g n a p o r t h e g r i s e ag e n o m ea n dr i c eg e n o m ea n n o t a t i o np r o j e c td a t a b a s e s ，a n dp r o t c o m p8 0s o f t w a r e w e r eu s e dt oa n n o t a t et h ep r o t e i n sa n dt h e i rs u b c e l l u l a rl o c a l i z a t i o n so ft h em o s to b v i o u s l y c h a n g e dg e n e s ，i nw h i c h 12 2u p r e g u l a t e da n d6 6d o w n r e g u l a t e dg e n e sf r o mm g r i s e a ，a n d 6 2u p r e g u l a t e da n d6 6d o w n r e g u l a t e dg e n e sf r o mr i c e f i n a l l y , t h et o p2 0u p - r e g u l a t e d g e n e sw e r es e l e c t e df r o mm a g n a p o r t h eg r i s e aa n dv e r i f i e db yr t - p c ra n a l y s i s k e yw o r d s ：m a g n a p o r t h e g r i s e a r i c e g e n ec h i pi n t e r a c t i o n d i f f e r e n t i a le x p r e s s i o n i i 獨創(chuàng)性聲明 本人聲明，所呈交的學位( 畢業(yè)) 論文，是本人在指導教師的指導下獨立完 成的研究成果，并且是自己撰寫的。盡我所知，除了文中作了標注和致謝中已作 了答謝的地方外，論文中不包含其他人發(fā)表或撰寫過的研究成果。與我一同對本 研究做出貢獻的同志，都在論文中作了明確的說明并表示了謝意，如被查有侵犯 他人知識產權的行為，由本人承擔應有的責任。 學位( 畢業(yè)) 論文作者親筆繇鑰剪螗日期：妒尹似 論文使用授權的說明 本人完全了解福建農林大學有關保留、使用學位( 畢業(yè)) 論文的規(guī)定，即學 校有權送交論文的復印件，允許論文被查閱和借閱；學?？梢怨颊撐牡娜炕?部分內容，可以采用影印、縮印或其他復制手段保存論文。 保密，在年后解密可適用本授權書。 口 不保密，本論文屬于不保密。日 學位( 畢業(yè)) 論文作者親筆簽名：劫遺考烀 日期： 礦尸 心 指導教師親筆簽名： 日期： 一 福建農林大學碩士學位論文 l 刖百 寄主植物與病原微生物的相互作用在自然界中是廣泛存在的，也是長期以來兩者之 間相互選擇的結果。體現(xiàn)在農業(yè)生產上，一個抗病品種的大面積使用后，致病菌中很快 就會出現(xiàn)新的致病生理小種，并大量繁殖，最后使原抗病品種的抗病性喪失。因此，找 到農作物與病原菌之間互作的機理，具有深遠的理論意義和重大的實際意義。 目前對寄主植物與病原微生物互作的解釋有“基因對基因”假說和后人對該假說的 補充，即：植物抗病性是由植物的抗病基因r 與相應的病原物的無毒基因a v r 的相互 作用所決定的，r 基因和a v r 基因稱為主效基因；同時還有一些基因的表達產物由于 涉及信號傳導、植物防衛(wèi)基因的激活及與微生物毒性基因互作等，可能會影響植物與微 生物互作的表現(xiàn)，但效應遠不及r 基因和a v r 基因，被稱為微效多基因。因此，如果 找出這些基因，并明確它們的作用機理，對揭示寄主植物與病原微生物互作原理和解決 病原菌致病的關鍵問題將有很大幫助。 而新興的基因芯片技術，使人們能夠同時高通量地檢測基因表達及基因間的相互作 用，因而得到廣泛的應用。該方法也是全面獲取植物與病原微生物互作后差異表達基因 的有利工具。 水稻是我國主要糧食作物之一，種植面積最廣。稻瘟病菌( m a g n a p o r t h eg r i s e a b a r n ) 侵染水稻引起的稻瘟病是影響水稻生產的三大主要病害之一。由于水稻是禾本科 的模式植物，稻瘟病菌是致病絲狀真菌的模式生物，并且水稻和稻瘟病菌的基因組測序 工作也先后完成【1 3 】。因而，研究水稻與稻瘟菌互作系統(tǒng)是研究植物與致病微生物相互 作用的最佳模式系統(tǒng)之一。本研究采用基因芯片技術，找出稻瘟病菌與水稻互作中差異 表達基因，從而為揭示稻瘟病菌與水稻的互作機理打下研究基礎。 1 1 稻瘟病菌生物學特性及致病相關基因的研究現(xiàn)狀 稻瘟病菌( m a g n a p o r t h eg r i s e ab a r r ) 弓l 致的水稻稻瘟病是世界性的水稻重要病害，并 且易暴發(fā)成災，一般可導致水稻減產1 0 2 0 【1 1 ，重則造成水稻絕收，直接關系到世界 糧食的安全生產問題。因此，多年來無數(shù)科學家針對該病的發(fā)生流行規(guī)律、綜合防治策 略和措施等方面開展了大量研究。稻瘟病菌作為絲狀子囊菌，易于開展遺傳分析，在生 長發(fā)育、侵染致病機制等方面有許多特點，同時稻瘟病菌還可侵染大麥、小麥、粟等禾 本科植物，以及可以從葉、莖、根侵染水稻，引發(fā)同樣的癥狀【4 5 】，因此，它成為研究絲 狀真菌生長發(fā)育和侵染致病機制的重要模式生物【6 7 】。 二十世紀八十年代后，隨著分子生物學的發(fā)展，科學工作者們明確了水稻與稻瘟病 福建農林大學碩士學位論文 菌的互作符合基因對基因假說，并從分子水平證明了這一互作機制【1 3 】。并且研究者們 普遍認為稻瘟病也已成為研究植物病原真菌與寄主互作較為理想的模式系統(tǒng)之一【6 8 9 】。 z h u 等人通過不同水稻品種混栽增加遺傳多樣性以控制稻瘟病的研究，使得該病害系統(tǒng) 成為研究病害生態(tài)控制的理想模式【1 0 】。而在該研究系統(tǒng)中，與稻瘟病菌侵染相關的分子 遺傳學和細胞生物學研究已取得較大的進展【6 】。特別是該菌基因組全序列的測定，極大 地推進了該菌的研究。至今，已報道了數(shù)十個與稻瘟病菌致病相關的基因，另外還有一 部分與生長、產孢等形態(tài)分化過程有關的基因也已得到克隆和研究。這些研究為最終揭 示稻瘟病菌致病及與寄主互作的機理奠定了堅實的基礎，同時也為該病的防治提供了理 論依據。 1 1 1 稻瘟病菌的生物學特性 稻瘟病菌的有性世代為m a g n a p o r t h eg r & e a ( h e b e r t ) b a r r ，屬于子囊菌亞門。無性世 代為p y r i c u l a r i ag r i s e a ( c o o k e ) s a c e ，稱為灰梨孢( = p y r i c u l a r i ao r y z a ec a v ，稱稻梨孢) ， 屬于半知菌亞門。稻瘟病菌侵染致病包括接觸、侵入、擴展等過程。稻瘟病菌分生孢子 著落在寄主植物表面，依靠頂端的膠狀物緊緊地粘著在疏水植物組織表面，在有水珠的 條件下便很快萌發(fā)形成芽管，4 h 內分化出附著胞 1 1 - 1 3 】。成熟附著胞壁內層可以沉積大量 的黑色素，而在附著胞和植物表面間黑色素不沉淀或很少沉積。在附著胞朝向植物表面 的一端基部有附著胞小孔，由于黑色素的沉積使細胞壁上的孔徑小于l n m ，僅允許小分子 物質通過，而甘油等有機分子不能通過，從而維持一定的滲透壓，即膨壓。h o w a r d 等 通過試驗計算出稻瘟病菌的一個附著胞可以產生的壓強為6 - 8 m p a ，是汽車輪胎壓強的 3 0 4 0 倍【1 5 16 1 。有巨大膨壓的附著胞致使侵入栓有足夠的力量穿過寄主的角質層，侵入 寄主組織內部。已有試驗表明，不產生黑色素、沒有甘油積累的附著胞突變體往往失去 侵染致病能力或需要通過人為造傷以后才能致病【1 3 1 4 】。 稻瘟病菌的侵入栓刺穿細胞壁進入寄主表皮細胞，在侵入的最初細胞內形成侵染菌 絲。在水稻葉片內，侵染菌絲在細胞內和細胞間迅速延伸，在接種的7 2 h 后，病原菌的 生物量已經達到感染葉片的1 0 t 1 7 1 。稻瘟病菌侵入5 7 天后，水稻葉片上形成可見的灰 色病斑。病菌菌絲在病斑處產生分生孢子梗，從氣孔或直接穿透寄主表皮暴露到空氣中， 在分生孢子梗頂端形成無性分生孢子。有試驗證明，稻瘟病菌每夜可向田間釋放 2 0 0 0 6 0 0 0 個孢子，并能持續(xù)2 周左右 18 1 。成熟的分生孢子，借風傳播，可達2 0 k i n ，在 高達2 3 0 0 m 的高空也可收集到稻瘟病菌的分生孢子，分生孢子隨風雨接觸到新的水稻植 株，開始新輪的循環(huán)【1 9 】。 2 福建農林大學碩士學位論文 1 1 2 稻瘟病菌致病相關基因的研究現(xiàn)狀 在整個稻瘟病菌侵染水稻的過程中，病菌和寄主兩方面都有大量的基因參與【2 0 1 ，僅 病菌方面就包括如下三類：一類是與侵染有關的形態(tài)分化過程信號識別基因：第二類是 與毒性相關的無毒基因、毒性決定因子等；第三類是與病菌在侵入水稻組織后定殖和擴 展有關的基因【2 1 1 。已有的大量研究主要集中在附著胞的分化以及侵染早期相關的基因， 弧m p g l 、p t h l i 、c p k a 、生c l 、m a g b 、p m k l 、a l b l 、r s y l 、b u f l 、p t h 2 、t p s l 、 p l s l 、m s t l 2 、m s t l l 、m s t 7 、m p s l 、c b p l 、g a s i 、g a s 2 、p d e l 、c y p l 、m h p l 等【6 2 2 2 3 1 。它們有的參與附著胞分化的信號傳導，如識別表面疏水信號的m p g l 、p 刀訂j 基因，進行信號傳遞的c p k a 、m a c ，、m a g b 、p 紜j 、m s t l l 、m s t 7 等基因，這些 基因識別的信號經g 蛋白，激活細胞內的c a m p 和m a p k 蛋白激酶等信號途徑，決定 了該菌附著胞的形成【2 3 2 5 2 6 1 。它們有的參與形成附著胞的正常功能，如黑色素合成基 因a l b l 、b u f l 和r s y l ，肉毒堿乙酰轉移酶基因p t h 2 和海藻糖合成酶基因t p s l 等與 附著胞中膨壓的形成有關；p l s l 、嬲”2 、m p s i 、g s j 、g 舵、p d e l 、c y p l 等基因 與侵入栓的形成和功能有關【6 2 7 之9 1 。m h p l 為最新報道的與病菌疏水性表面形成有關的 基因，該基因的突變會影響病菌侵染相關形態(tài)的發(fā)育，并使病菌的侵染和定殖能力下降 【2 2 1 。此外，l i 等考察了稻瘟病菌中與酵母p a k 激酶基因s t e 2 0 類似的c h m l 和m s t 2 0 基因，發(fā)現(xiàn)c h m l 基因與病菌附著孢的形成和穿透寄主有關，但與酵母中不同的是， c h m l 并沒有調控稻瘟病菌的p m k l 激酶【3 0 1 。 盡管己鑒定到幾十個稻瘟菌無毒基因 7 , 3 1 1 ，但是，也許是受到克隆基因難度的限制， 迄今只有五個無毒基因p w l 2 、a v r l c 0 3 9 、a v r p i t a 、a c e l 和a v r - p i z t 已經克隆 3 2 - 3 5 , 1 0 5 。其中無毒基因a v r - p i t a 的結構及其與水稻抗病基因p i t a 的互作功能得到了深 入的研究【3 _ 4 ，3 6 1 。a v r p i t a 編碼一個金屬蛋白酶，盡管尚無直接的生化依據，但只要改 變該金屬蛋白酶結構域中的一個氨基酸，它就不能與抗病基因p i t a 互作【3 】。功能分析表 明，a v r p i t a l 7 6 直接與水稻細胞內的p i t a 蛋白的富亮氨酸區(qū)域( l r d ) 結合，激發(fā)尸婦 調控的防衛(wèi)反應，從而導致水稻的抗病反應。 關于稻瘟病菌穿透組織后定殖發(fā)展階段的基因調控則研究的很少。b a l h a d e r e 和 t a l b o t 發(fā)現(xiàn)，稻瘟病菌p 型a t p 酶的基因p d e l 與侵入菌絲的發(fā)育和最終在細胞內的定 殖有關2 9 1 ；m h p l 基因的突變也使病菌的侵染和定殖能力下降【捌；而a t p 驅動的輸出 泵蛋白基因a b c l 與病菌的親和性互作密切相關1 2 1 。另外，甲硫氨酸和組氨酸的合成， 以及金屬硫因叫e t a l l o t m o n e i n ) 等也與稻瘟病菌的侵染過程有關【3 7 r3 8 1 。不過，這方面的 堡壟壟簽奎蘭堡主堂垡笙苧 研究離認識稻瘟病菌在植物組織內定殖擴展的調控機理還差很遠。 因此，盡管對稻瘟病菌的生長、侵入、發(fā)病等各個階段已展開了較為系統(tǒng)的研究， 并取得了一些重大的研究進展，但對稻瘟病菌致病過程的分子機理仍然未完全弄清楚， 特別是稻瘟病菌侵入后在寄主體內如何與寄主發(fā)生互作，并導致病菌的定殖與擴展，最 終形成感病反應的研究非常稀少。近年來，雖然有多個實驗室運用m r n a 差異顯示、 c d n a 抑制消減雜交( s s h ) 、s a g e 、基因芯片和表達序列標簽( e s t ) 分析的方法來研究 水稻與稻瘟菌互作的相關基因，得到了大量的信息【3 9 4 8 1 。但這些研究獲得的信息中，有 些由于采用人工培養(yǎng)或人造疏水性表面代替植物接種，得到的信息與來源于真正的與寄 主互作還存在差異，特別是無法找到病菌中特異參與定殖與擴展的基因。 1 2 植物抗病的機理及水稻抗稻瘟病基因的研究 1 2 1 植物抗病的機理 植物在生長過程中，經常會遭到一些病原微生物( 包括真菌、細菌和病毒等) 的危害。 病原物侵染寄主植物的能力是病原物與寄主植物協(xié)同進化的結果，有很多植物在進化過 程中還出現(xiàn)抵抗病原菌侵染的能力，即為寄主植物的抗病性。目前對植物的抗病機理流 行著兩種學說： 一種是f l o r l 9 7 1 年提出的“基因對基因”假說( g e n e f o r - g e n eh y p o t h e s i s ) 。主要用來解 釋植物抗病基因和病原菌之間的特異性相互作用。其廣為接受的觀點是受體激發(fā)子模 型，即病原物入侵寄主后，病原菌無毒基因( a v o 的產物被寄主相對應的抗性基因( r ) 產 物識別后，激活了侵染點細胞的過敏性反應( h y p e r s e n s i t v er e s p o n s e ，h r ) ，導致這些細胞 快速地程序性死亡，使侵染的病原物生長繁殖受到抑制，被控制在這些細胞中【4 9 1 。這一 假說一直以來得到廣泛的肯定和補充。但是多數(shù)已經克隆的抗病基因產物和其對應的無 毒基因產物尚未證實能直接發(fā)生作用。 另一種假說是v a nd e rb i e z e n 等1 9 9 8 年提出的防衛(wèi)假說( g u a r dh y p o t h e s i s ) ，該假說 認為病原為了使周圍環(huán)境更有利于自身侵染、繁殖，釋放了一類效應子( e f f e c t o r s ) ，效應 子能夠作用并修飾寄主的某些目標( t a r g e t ) 蛋白，抗病蛋白則作為防衛(wèi)( g u a r d e r ) 蛋白，通 過與這些目標蛋白的互作啟動寄主的抗病反應【5 0 , 5 1 】。防衛(wèi)假說的提出徹底改變了我們過 去對抗病基因功能的認識，抗病蛋白不再是被動地等待無毒蛋白的結合，而是主動的， 時時刻刻地從各個方面監(jiān)控由病原物引發(fā)的自身生理變化過程，迅速啟動防衛(wèi)反應。 1 2 2 水稻抗稻瘟病菌基因的研究現(xiàn)狀： k i y o s a w a 等通過遺傳分析，先后在粳稻中的8 個位點( p i k 、p i a 、p i i 、p i z 、p i t a 、p i b 、 4 福建農林大學碩士掌位論文 p i t 、p i s h ) 鑒定了1 3 個抗病基因儼f a 、p i - i 、p i - k 、p i k a 、p i ，k m 、p i k s 、p i 砌、p i - z 、 尸，捌、p i ，t a 、p i t a 2 、p i b 和p i - t ) ，并在此基礎上確立了一套單基因鑒別品種，它由1 2 個品種組成，每個品種包含一個己知的抗稻瘟病基因，這套單基因鑒別品種大大提高了 對稻瘟病生理小種的鑒別能力【5 2 1 。 y u 等先后利用近等基因系鑒定t - - 個稻瘟病抗性基因，p i - 1 似 p i 一1 1 、p i 一2 ( 0p i - z 哥 和p i - 4 ( t ) p i 趔并分別定位于第1 1 、6 和1 2 染色體上 5 3 , 5 4 1 ；i m b e 等鑒定并將p i 2 0 基 因定位到水稻的第1 2 號染色體上【5 5 】；n a q v i 等利用r a p d 和r f l p 技術在重組自交系 中還定位了第5 號染色體上的抗稻瘟病基因p f j d 5 6 1 。朱立煌等利用r a p d 技術，在 水稻第8 染色體上首次發(fā)現(xiàn)稻瘟病抗性基因，即尸唧扣，j 俐，它離r a p d 標記b p l 2 7 a 的遺傳距離為1 4 9 c m e 5 7 1 。w a n g 等利用重組自交系c 0 3 9 m o r o b e r e k a n 定位了兩個來自 粳稻的稻瘟病抗性基因p i - 5 ( t ) 和p i - 7 ( t ) ，分別在第4 染色體上，位于r f l p 標記r g 4 9 8 和r g 7 8 8 之間；和第1 1 染色體上，位于標記r g l 6 和r g l 0 3 a 間。另外，他們還發(fā)現(xiàn) 了1 0 個控制部分抗性的q t l ，位于第8 條染色體上，它們控制著病斑的大小、數(shù)量和 病葉的面積，這是首次對稻瘟病微效抗性基因進行定位【5 8 】。 1 9 9 5 年，中國水稻所的鄭康樂等利用r f l p 技術從品種紅腳占中定位了抗稻瘟病基 因p i h 一，例，位于第1 2 染色體上，距離r f l p 標記r g 8 6 9 為5 1 c m 5 9 】。日本m i y a m o t o 等發(fā)現(xiàn)源于秈稻品種的抗稻瘟病基因p i - b 位于第2 染色體的近末端，與r f l p 標記r z l 2 3 及r a p d 標記b 1 共分離。他們還找到了兩個標記r z 2 1 3 和g 1 2 3 4 。前者位于靠近端粒 的一邊距r a p d 標記b 11 9c m 處，后者位于距著絲點的一邊r a p d 標記b 1 只有0 5 c m 處。因此，他們不僅找到了p i b 兩側的標記，而且找到了與目的基因完全共分離的標記， 為該基因克隆奠定了基礎 矧。w a n g 等在1 9 9 9 年克隆了該基因。r y b k a 等用r f l p 和 r a p d 標記定位了來源于秈稻品種t a d u k a n 的兩個抗稻瘟病基因p i - t a 和p i t a 2 ，它們被 定位在第1 2 染色體距離著絲點非常近的中部，且緊密連鎖。他們還發(fā)現(xiàn)這兩個基因與 標記x n p b 2 8 9 和x n p b l 9 6 共分離【6 1 1 。w u 等從1 4 4 0 個r a p d 引物擴增產物中篩選出 1 8 個條帶，均與尸正，口連鎖，并且構建了基因所在區(qū)域的精密圖譜。b r y a n 等在2 0 0 0 年 克隆了p i - t a 基剛6 2 1 。p a n 等1 9 9 8 年從云南的品種m a o w a n g u 中鑒定到p i l 3 、p i l 42 個 基因盼6 4 1 。b e r r u y e r 等2 0 0 3 年從i r 6 4 中鑒定到p i 3 3 基因；2 0 0 4 年，c h e n 等從 中國的秈稻品種地谷中鑒定并作圖了2 個基因p i d l 和p i d 2 觚6 7 1 。 迄今為止，通過性狀標記或分子標記( 微衛(wèi)星標記，s s r ，限制性片段長度多態(tài)性 r f l p 等) 技術，已經有超過6 0 個稻瘟病抗性基因被定位到染色體上。 目前已經克隆的基因有：p i b 、p i t a 、p i 2 、p i 9 、p i d 2 和尸切六個基因。 氣 福建農林大學碩士學位論文 其中，由p i b 基因編碼的蛋白質，是由1 2 5 1 個氨基酸殘基組成的含一個核苷酸結 合位點( n u c l e o t i d eb i n d i n gs i t e ，n b s ) 和富含亮氨酸重復( 1 e u c i n e r i c hr e p e a t s ，e r r ) 的蛋白 質。其n 端的n b s 區(qū)有激酶l a 、2 和3 a 結構域的重復單位，l r r 的中部有8 個成簇的 胱氨酸殘基68 6 9 1 。p i b 基因在水稻中以多拷貝形式存在，目前該基因的抗病機理尚不清 楚。 而尸扣幻基因編碼的蛋白，是富含l r r 序列的細胞質膜受體蛋白，由9 2 8 個氨基酸 殘基組成。它在水稻中以單拷貝形式存在【7 0 1 。并且根據j i a 等的研究還發(fā)現(xiàn)，p i t a 基因 的抗病機制遵循基因對基因的學說，即它編碼的產物與稻瘟病菌中相應的無毒基因 a v r p i t a 表達產物能相互作用引發(fā)抗病反應【7 1 】。 研究證明，尸忍位于第6 染色體上，抗譜廣且完全顯性基因，是一個基因簇成員【7 2 。7 5 1 。 p i 2 編碼一個由1 0 3 2 個氨基酸組成的n b s l r r 蛋白。根據尸刀的序列信息，在品種 t o f i d e l 中發(fā)現(xiàn)了它的等位基因p i z - t ，也編碼n b s l r r 蛋白，但是由1 0 3 3 個氨基酸組 成。兩個基因在編碼的三個連續(xù)組成的l r r 結構域中有八個氨基酸不同【7 6 1 。 p i 9 也同樣是位于第6 染色體上的一個廣譜抗性的基因，和尸f 2 屬于同一個基因家族。 編碼n b s l r r 蛋白，由1 0 3 2 個氨基酸組成。p i 2 和p i 9 的克隆為從分子水平上解釋稻 瘟病基因簇的形成和進化提供t i f f _ 據【7 7 1 。q u 等認為抗性是由l r r 結構域決定的【7 引。 1 3 基因芯片技術及其應用 基因芯片又稱d n a 芯片，是專門用于核酸檢測的生物芯片。它是指在固相載體上 按照特定的排列方式固定上大量序列己知的d n a 片段，形成d n a 微矩陣。將樣品基 因組d n a 或r n a 通過體外逆轉錄、p c r 或r t - p c r 擴增等技術摻入標記分子后，與位 于微陣列上的已知序列雜交，通過激光共聚焦熒光檢測系統(tǒng)等對芯片進行掃描，檢測雜 交信號強度，計算機軟件進行數(shù)據的比較和綜合分析后，即可獲得樣品中大量基因序列 特征或基因表達特征信息。由于其檢測基因的高通量性，基因芯片在基因的表達和調控， 疾病的診斷和檢測、新基因功能的確定等各個方面得到了日益廣泛的應用7 9 棚】。 基因芯片檢測的最基本原理同s o u t h e r nb l o t 、n o r t h e r nb l o t 一樣，都是基于堿基互 補的核酸分子雜交。他們的區(qū)別是：s o u t h e r nb l o t 、n o r t h e r nb l o t 中把樣本的d n a 或 r n a 固定到( 固相) 膜上，再用標記好的探針進行雜交；基因芯片則是把大量的已知序列 的基因探針有序地固定在固相介質上，再把樣品中總的靶基因進行標記，與帶有探針的 芯片進行常規(guī)的分子雜交，因此可以大規(guī)模高通量的進行基因序列的研究【8 2 】。 1 3 1 基因芯片的種類： 6 堡堡奎莖奎蘭堡主蘭垡笙莖 由于載體材料、制備方法、所用d n a 的種類及用途等方面的不同?；蛐酒笾?可分為一下幾類： 就基因芯片所用的載體材料的不同，可分為玻璃芯片、濾膜芯片、硅芯片、陶瓷芯 片等。目前，玻璃芯片由于其熒光背景低、材料易得和應用方便等優(yōu)點，而在國際上得 到廣泛應用。 按照芯片的制備方法的不同，可以分為以下兩類：一類是在基質上直接原位合成寡 核苷酸的點陣；另一類是用微量點樣技術將d n a 片段直接點至基質上。根據芯片載體 上所點的d n a 種類不同，可以分為寡核苷酸芯片和e d n a 芯片兩種： 寡核苷酸芯片是以寡核苷酸為探針，是人工合成的，一般以原位合成方式固定到載 體上，具有密集程度高、可合成任意序列的寡聚核苷酸等特點，適用于d n a 序列測定、 s n p 分析等。但是選擇這種：簽片，要求研究者對基因有充分的了解，即基因的位置和長 度有一定的認識。由于合成寡聚核苷酸長度在1 5 7 0 m e r 左右，因而特異性差，而且隨 長度的增加，合成的錯誤率也會增高。同時寡核苷酸芯片也可通過直接點樣制備，但固 定率較d n a 芯片差。寡核苷酸芯片主要用于點突變和測序等，也可用于表達譜研究【8 3 8 4 】 a e d n a 芯片的探針是e d n a ，由于e d n a 就是與m r n a 互補的d n a ，因此被認為 是真實表達的基因。是將微量e d n a 片段在玻璃等載體上按矩陣密集排列并固化，基因 點樣密度較傳統(tǒng)載體，如混合纖維素濾膜或尼龍膜的點樣密度要高得多，可達到每張載 玻片6 萬個基因。e d n a 芯片最大的優(yōu)點是靶基因檢測特異性非常好，目前許多實驗室 和制藥公司都用此類芯片。e d n a 芯片主要用于一般的檢測芯片和表達譜研究8 5 ，8 6 1 。 按基因芯片的用途可分為表達譜芯片、診斷芯片、指紋圖譜芯片、測序芯片和毒理芯片 等。 1 3 2 基因芯片的應用： 基因芯片技術產生以后，由于其檢測的快速和高通量性，便得到了廣泛的應用，并 不斷發(fā)展。最初在醫(yī)學研究、藥物篩選等方面開始應用，后又逐步擴展到動物、植物、 昆蟲和微生物等領域。已經用于基因差異表達檢測、突變體檢測、基因組多態(tài)性分析、 基因文庫作圖和雜交測序等方面的研究?；蛐酒饕獞糜谝韵聨追矫?。 1 3 2 1 基因表達水平的檢測 常規(guī)檢測基因表達的方法不僅工作量大，而且存在著一次僅能檢測少量基因以及靈 敏度不高等局限性，而基因芯片技術可以高敏感度地定量、定性檢測基因表達水平，既 可以同時比較不同標本基因表達水平的差異，也能夠提供某一基因或一群基因的表達模 7 福建農林大學碩士學位論文 式與其他基因表達模式相互間關聯(lián)的信息。目前多是將不同來源、不同組織、不同時期、 不同外界條件下m r n a 或c d n a 與芯片雜交，從而獲得相應的基因表達譜。 s c h e n a 等人首次使用e d n a 基因芯片檢測擬南芥( ar a b i d o p s i st h a l i a n a ) 中不同基因表 達和表達水平的差異，用4 5 個擬南芥e d n a ( 1 4 個完全序列和3 1 個e s t 序列) 和3 個對 照( 分別來源于不同種屬的人類a c h 受體、鼠糖皮質激素受體和酵母t r p 4 的c d n a ) 構 建成的微陣列，同時用麗絲胺( 1 i s s am i n e ) 和熒光素( f l u o r e s c e i n ) 分別標記探針，探針與微 陣列雜交。結果發(fā)現(xiàn)，在對照組中均未檢測到雜交信號，說明該微陣列的特異性很高； 在根和葉組織中檢測到2 6 個基因的表達存在差異，其中參與葉綠素合成的c a b i 基因 在葉組織中的表達水平較根組織中的表達水平高5 0 0 倍【8 7 1 。s h i n j i 等用不同鹽濃度處理 水稻耐鹽品種( v a r p o k k a l i ) 的根并構建c d n a 文庫，得到1 7 2 8 個片段組成的c d n a 微陣 列，結果顯示，在鹽脅迫l 小時內約有1 0 的序列表達水平發(fā)生顯著變化，隨著時間的 增長，對照和處理的差異在持續(xù)數(shù)小時后變小，一周后處理中在l 小時內表達升高的序 列恢復到對照水平，說明隨著植株對鹽脅迫的適應，基因的表達情況也在發(fā)生著動態(tài)變 化【8 8 】。j a c e o u d 等則將基因芯片技術應用于水稻品種資源的遺傳多樣性分析【8 9 1 。r u u s k a 等等利用c d n a 微陣列芯片檢測擬南芥種子在發(fā)育過程的基因表達，發(fā)現(xiàn)淀粉合成相關 基因在幼嫩種子中的表達十分活躍，而隨著種子逐漸成熟這些基因的表達量逐漸減小 9 0 l 。l u 等結合c d n a 微陣列和s s h 技術，分離并鑒定了一個與稻瘟病親和與非親和性 反應有關的新基因 9 1 1 。m i s s o n 等使用a f f y m e t r i x 的a t h l 芯片測定擬南芥短期、中期和 長期磷缺乏的基因表達差異，發(fā)現(xiàn)在短期磷缺乏情況下，7 2 個基因被誘導表達，4 個基 因沉默，隨著磷元素的缺乏，基因被誘導表達的數(shù)量逐漸增多【9 2 1 。c a s u 等利用a f f y m e t r i x 基因芯片研究甘蔗莖細胞壁代謝和發(fā)育基因表達，檢測到了1 1 9 個高度表達的轉錄本， 并發(fā)現(xiàn)了一些與纖維素合成相關的基因 9 3 1 。k l o o s t e r m a n 等構建了含1 ，3 1 5 c d n a 的馬鈴 薯基因芯片，研究馬鈴薯塊莖發(fā)育【9 4 】。 c a r l s s o n 等利用擬南芥花器官特異c d n a 芯片研究甘藍型油菜c m s 的機理，發(fā)現(xiàn)保 持系與不育系之間的基因表達差異很大，其中一些在花藥或花粉中表達的基因在c m s 中不表達，與細胞壁形成有關的基因表達在c m s 材料中受到了抑制【9 5 1 。c e r c o s 等用含 7 , 0 0 0 個基因的c d n a 芯片研究克里曼丁桔( c i t r u sc l e m e n t i n a ) 果實發(fā)育和成熟時的基因 表達變化，揭示了在果實成熟過程中檸檬酸及細胞質酸性下降的分子機理1 9 6 。p u t h o f f 等利用基因芯片分析了擬南在不同胞囊線蟲侵染下基因表達譜的變化，他們發(fā)現(xiàn)，用甘 蔗胞囊線蟲( h e t e r o d e r as c h a c h t i i ) 侵染擬南芥時，1 2 8 個基因的表達發(fā)生變化而用大豆胞 囊線蟲( h g l y c i n e s ) 侵染時僅1 2 個基因的表達發(fā)生變化，并且這1 2 個基因包含在前面的 8 福建農林大學頓士學位論文 1 2 8 個基因中【9 7 1 。m a r a s c h i n 等利用與胚發(fā)育相關的表達標簽制作的芯片，揭示了大麥 孤雄生殖的分子機理【9 8 1 。n 等利用含8 , 0 9 5 個油菜基因的芯片研究經寡聚糖 ( o l i g n c h i t o s a n ) 處理后的油菜基因表達譜變化，發(fā)現(xiàn)共3 9 3 個基因表達發(fā)生改變，其中， 2 5 7 個沉默，1 3 7 個上調表達】。n e g i s h i 等還以包含有8 9 8 7 條水稻c d n a 克隆的微陣 列研究了大麥根部鐵元素脅迫的表達譜變化，并獲得了一批鐵元素脅迫相關的基因【1 0 0 。 愛荷華州立大學利用這種高通量工具對2 0 0 0 0 個玉米e s t 序列的37 端進行了研究。這 些研究為研究物種的基因組表達及相互關系提供科學依據和豐富的數(shù)據庫資源。并且在 差異表達基因的研究方面，由于基因芯片的敏感性和高通量性，很好地解決了普通的消 減雜交和差異篩選技術中存在的富集和扣除之間的矛盾，還可以同時對大量基因的表達 差異進行對比分析。 1 3 2 2 功能相關基因的檢測 生物的很多生理過程不是單基因控制的，而是由一系列直接或間接作用的功能相關 基因，相互作用的結果?；蛐酒夹g通過平行監(jiān)測眾多基因表達模式進行功能分析， 有助全面了解生物在特殊處理和不同環(huán)境脅迫下較為完整的基因表達情況，從而找到與 特定功能相關的基因情況。 饒志明等( 2 0 0 2 ) 用2 2 0 0 條來源于受稻瘟病菌處理的水稻e s t 序列制備成c d n a 微 陣列，分析了抗稻瘟病近等基因系g 2 0 5 和g 7 1 受稻瘟病菌脅迫后基因表達的差異，檢 測到3 8 個差異表達克隆，其功能涉及到病程相關、信號轉導、逆境脅迫及光合作用和 糖代謝等方面，基本構成了從信號傳導到主動和被動防衛(wèi)反應的復雜防衛(wèi)系統(tǒng)【1 0 l 】。 1 3 2 3 尋找新基因 生物體的發(fā)育分化及對環(huán)境因子刺激所產生的應答反應等一系列生命活動過程均由 基因來調控。利用基因芯片技術可以從表達序列水平對生物基因組進行快速、高通量研 究，如尋找動植物抗病、生物抗藥性、植物抗旱和抗寒以及高產、優(yōu)質相關基因，有利 于新基因的發(fā)現(xiàn)和利用。h a r o n i 等從草莓中分離了1 7 0 1 個c d n a 片段構建微陣列，研 究草莓果實不同成熟期果實顏色與成熟度的關系，發(fā)現(xiàn)有4 0 1 個基因在綠、白和紅色果 實中表達顯著差異，通過r n a 雜交發(fā)現(xiàn)新基因，其中草莓乙?；D移酶基因( s t r a wb e r r y a l c o h o la c y l tr a ns e r f a s e ，s a a t ) ，在草莓成熟時特殊風味合成中起很重要的作用 1 0 2 1 。 9 福建農林大學碩士學位論文 2 1 試驗材料 2 材料與方法 2 1 1 供試菌株及植物 稻瘟病菌g u y l l 菌株由法國d i d i e r t h a r r e a u 博士提供； 稻瘟病菌7 0 1 5 菌株由美國普渡大學徐金榮博士贈送； 水稻品種為c 0 3 9 近等基因系( c 0 3 9 n i l s ) 2 1 2 培養(yǎng)基 菌絲生長培養(yǎng)基：酵母完全培養(yǎng)基( c m ) ( 酵母粉6 嘰，水解酪蛋白6 9 l ，蔗糖1 0 9 l ，瓊 脂粉2 0g l ) ；酵母液體培養(yǎng)基( c m ) ( 酵母粉6 9 l ，水解酪蛋白6 9 l ，蔗糖l o g l ) ； 產孢培養(yǎng)基：米糠培養(yǎng)基( 米糠3 0 9 l ，瓊脂粉2 0 9 l ，p h6 。o ) 。 2 1 3 生化試劑 p c r 試劑( 1 0 xt a qb u f f e r 、d n t p 、t a q 酶) ，其它常規(guī)試劑均為國產分析純，引物由福州 博鴻生物技術有限公司合成。t r i z o l 總r n a 提取試劑( 天根生化科技有限公司) ；基因芯 片試驗所需試劑( 詳見附件) ；r t - p c r 試驗所用試劑采用p r o r n e g a 公司的r t - p c r 試劑盒。 基因芯片采用a g i l e n t 公司的m a g n a p o r t h eg r i s e a2 0o l i g om i c r o a r r a yk i t ，它包含了 1 5 ，1 7 0 個mg r & e a 探針，和6 , 3 2 5 水稻探針，每個探針由6 0 個核苷酸組成。 2 2 試驗方法 2 2 1 稻瘟病菌菌絲體獲得 切取在酵母完全培養(yǎng)基上活化好的g u y ll 菌絲塊，轉移至酵母液體培養(yǎng)基中，于2 5 1 2 、1 3 0 r p m 振蕩培養(yǎng)4 8 h 一7 2 h ，后用經高壓蒸汽滅菌過的濾紙片過濾收集菌絲體。 2 2 2 稻瘟病菌侵染水稻后病葉的獲得 用米糠培養(yǎng)基培養(yǎng)稻瘟病菌菌絲，待菌絲長滿平板時，刮除菌絲，置于2 5 ( 2 光照培 養(yǎng)3 d ，用無菌水洗脫分生孢子，經兩層擦鏡紙過濾分生孢子懸浮液，將濃度調整至l 1 0 6 個m l ，噴霧接種3 葉1 心的水稻植株，2 5 ( 2 黑暗保濕2 4 h 后，移到相對濕度8 0 以上 的人工氣候培養(yǎng)室培養(yǎng)。以同樣處理，但接種清水的為對照。于接種后的4 8 h 、7 2 h 、9 6 h 分別取樣，迅速投入液氮，至一8 0 ( 2 冰箱待用。 2 2 3 總r n a 的提取( t r l z o l l 1 0 望堡奎簽奎蘭墮主堂垡笙莖 提取g u y l l 菌絲體和稻瘟病菌孢子接種水稻后不同時間段水稻葉片的總r n a ，具 體方法如下： ( 1 ) 將收集的菌絲和水稻葉片用液氮研磨成粉末( 在研磨過程中注意保持組織處于冷凍狀 態(tài)) ，轉k 2 m l 離心管中，按每1 0 0 m g 樣品加入1 m lt r i z o l ，振蕩混勻，室溫靜置5 m i n ； ( 2 ) 然后加入0 2 倍體積的氯仿，蓋子蓋緊后劇烈振搖1 5 秒使混勻，室溫放置3 m i n ，4 。c 1 2 ，0 0 0 r p m 離心1 0 分鐘，離心后形成下層紅色的酚氯仿相，中間相和上層無色水相； ( 3 ) 將上層水相轉移至一個新的離心管( 水相的體積大約為所用t r i z o l 體積的6 0 ) ，加入 o 8 倍體積的異丙醇，混勻，靜置1 5 m i n ( 或更久) ，4 c1 2 ，0 0 0 r p m 離心1 0 m i n ，棄上清； ( 4 ) = l j n n 7 0 酒精，顛倒離心管數(shù)次以洗去沉淀所含鹽分。如沉淀較大可用t i p 頭先將沉 淀打散。然后4 7 , 0 0 0 r p m 離心1 0 分鐘，棄上清； ( 5 ) 室溫涼置5 1 0 m i n ，然后加入適量的無r n a s e 的水溶解； ( 6 ) j 口e k 0 5ul1 0 m g m ld n a s ei 于3 7 。c 反應1 h ； ( 7 ) 反應結束后，加入無r n a 酶的水，將體系擴大至5 0 01 al ，加入等體積的水飽和酚：氯 仿：異戊醇( 2 5 ：2 - 4 ：1 ) ； ( 8 ) 4 c1 2 ，0 0 0 r p m 離心1 0 m i n ； ( 9 ) 轉移上清至另一干凈的無r n a 酶的離心管中，加入2 5 倍體積冰凍無水乙醇和0 1 倍體 積3 mn a a c ( p h5 2 ) ，混勻，- 2 0 放置過夜； ( 1 0 ) 4 1 2 ，0 0 0 r p m 離心1 0 m i n ； ( 1 1 ) 棄上清，加入7 0 酒精洗沉淀2 次，晾干5 1 0 m i n ，加入適量的無r n a s e 的水溶解沉 淀。 ( 1 2 ) 用分光光度計分析r n a 濃度，1 瓊脂糖電泳檢測r n a 的純度。 2 2 41 瓊脂糖電泳檢測r n a 的純度 ( 1 ) 配置用d e p c 處理的電泳緩沖液5 0 t a e ，高壓滅菌后待用； ( 2 ) 使用電