（生物化學(xué)與分子生物學(xué)專業(yè)論文）里氏木霉swollenin在米曲霉中的表達(dá)和純化.pdf

浙江理工大學(xué)學(xué)位論文版權(quán)使用授權(quán)書 學(xué)位論文作者完全了解學(xué)校有關(guān)保留、使用學(xué)位論文的規(guī)定，同意學(xué)校保留 并向國(guó)家有關(guān)部門或機(jī)構(gòu)送交論文的復(fù)印件和電子版，允許論文被查閱或借閱。 本人授權(quán)浙江理工大學(xué)可以將本學(xué)位論文的全部或部分內(nèi)容編入有關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn) 行檢索，可以采用影印、縮印或掃描等復(fù)制手段保存和匯編本學(xué)位論文。 本學(xué)位論文屬于 保密口，在 不保密口 。 學(xué)位論文作者簽名：書劭 日期：伽jo 年弓月v f 日 年解密后使用本版權(quán)書。 指導(dǎo)教師簽名： 日期：妒o 年 弓月刎日 本研究由 國(guó)家8 6 3 計(jì)劃 ( n o 2 0 0 7 a a 0 2 1 7 0 3 ，n o 2 0 0 7 a a l 0 0 5 0 4 ) 和浙江省自然科學(xué)基金 ( n o y 3 0 8 0 1 8 3 ) 提供資助 at h e s i ss u b m i t t e dt oz h e j i a n gs c i t e c h u n i v e r s i 鉀 - f o r d e g r e e o fm a s t e ro fs c i e n c e c a n d i d a t e sn a m e ： 業(yè)n gm 遜叢a 一 s u p e r v i s o r ： s u b m i s s i o nd a t e ： 墜金。2 q q 2 研究生學(xué)號(hào) 0 7 2 0 2 010 40 浙江理工大學(xué)碩士學(xué)位論文 摘要 s w o ll e n i n 蛋白與植物e x p a n s i n 相似，雖然本身沒有水解活性，但是能夠使 濾紙能結(jié)晶纖維素結(jié)構(gòu)疏松，協(xié)同纖維素酶降解纖維素，因其對(duì)棉纖維的膨脹作 用被命名為s w o l l e n i n ，基因名為s w o 。 纖維物是地球上最豐富的碳水化合物，在生產(chǎn)能代替汽油的化學(xué)物質(zhì)方面具 有良好的應(yīng)用前景。但是，用纖維素酶降解纖維材料使得該過程花費(fèi)高。因此， 盡管s w o l l e n i n 和植物e x p a n s i n 本身缺乏水解活性，它們?cè)诶w維素酶降解纖維材 料的過程中具有非常重要的作用。植物e x p a n s i n 跨物種表達(dá)困難，分離純化的分 離方法不能滿足工業(yè)上的需要，而s w o l l e n i n 蛋白則有在微生物宿主中異源表達(dá) 的優(yōu)勢(shì)，能夠通過微生物發(fā)酵提高s w o l l e n i n 的產(chǎn)量，從而滿足應(yīng)用需要。目前 對(duì)s w o l l e n i n 蛋白的研究主要集中在該蛋白的活性方面，而很少有培養(yǎng)基成分和 培養(yǎng)條件對(duì)s w o l l e n i n 蛋白活性影響的研究。 s w o 基因編碼4 9 3 個(gè)氨基酸殘基，生物信息學(xué)方法預(yù)測(cè)s w o l l e n i n 蛋白分子 量為5 1 5k d ，等電點(diǎn)為4 8 。對(duì)s w o l l e n i n 蛋白的結(jié)構(gòu)域分析表明，它主要有纖 維素結(jié)合域、e x p a n s i n - e g 4 5 和e x p a n s i n c b d 三個(gè)結(jié)構(gòu)域。對(duì)該蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu) 分析表明，它以p 折疊和無規(guī)卷曲為主，催化域的結(jié)構(gòu)最為松散。我們成功表達(dá) 了重組米曲霉中的s w o l l e n i n 蛋白，并以該蛋白的協(xié)同活性為指標(biāo)，對(duì)碳源、氮源 等培養(yǎng)基成分和部分培養(yǎng)條件進(jìn)行了優(yōu)化并得到最適合s w o l l e n i n 表達(dá)的培養(yǎng)條 件：以甘油為碳源，以花生餅粉為氮源，接種量為1 5 1 0 7 個(gè)孢子4 0m l 培養(yǎng)基， p h5 6 ，培養(yǎng)8 8 h 。在該發(fā)酵條件下，s w o l l e n i n 的最高產(chǎn)量為5 0m g l 。分別用親 和層析和離子交換層析對(duì)發(fā)酵液中的s w o l l e n i n 蛋白進(jìn)行純化，但是親和層析分離 得到的蛋白沒有協(xié)同活性，可能原因是蛋白變性；用硫酸銨沉淀和離子交換層析 兩步法成功分離得到s w o l l e n i n 蛋白，純化后蛋白的純度為9 5 1 ，總回收率為 5 3 2 ，從1 l 發(fā)酵液中分離得到2 6 6m gs w o l l e n i n 蛋白。最后，我們對(duì)純化蛋白 的協(xié)同活性進(jìn)行了研究，結(jié)果表明，純化后的s w o l l e n i n 蛋白具有顯著的協(xié)同活性， 當(dāng)含有0 。0 6f p u 纖維素酶和3 0 0i t gs w o h e n i n 蛋白g 濾紙的混合溶液作用于濾紙 時(shí)，水解產(chǎn)生的還原糖含量比對(duì)照多8 1 7 。 關(guān)鍵詞s w o l l e n i n ：米曲霉；膨脹素；純化；協(xié)同活性 浙江理工大學(xué)碩士學(xué)位論文 a bs t r a c t t h es w o l l e n i np r o t e i ni ss i m i l a rt op l a n te x p a n s i n , i tc a na c to nc e l l u l o s em a t e r i a l s a n dc a u s el o o s es t r u c t u r e ，p r o m o t ec e u u l a s et od e c o p o s i t o nc e l l u l o s ed e s p i t et h el a c ko f h y d r o l y t i ca c t i v i t yi t s e l f t h ep r o t e i nw a sn a m e ds w o l l e n i na n dt h eg e n ew a sn a m e d s w o ld u et oi t sa b i l i t yt os w e l lc o t t o nf i b e r s c e l l u l o s ei st h em o s ta b u n d a n tf o r m so fc a r b o h r r d r a t ei nn a t u r ea n dr e p r e s e n t s p o t e n t i a lf e e d s t o c k sf o rt h ep r o d u c t i o no fc h e m i c a l st or e p l a c ep e t r o l e u m o na c o m m e r c i a ls c a l e ，t h ec o n v e r s i o no fc e l l u l o s i cb i o m a s s r e q u i r e st h eu s eo f c e l l u l a s et h a t m a k e st h ep r o c e s sm o r ec o s t l y a c c o r d i n g l y ，t h ea c t i v i t yo fs w o l l e n i na n dp l a n t e x p a n s i ni sv e r yh e l p f u lt oc e l l u l o s ed e c o m p o s i t i o nb yc e l l u l a s ed e s p i t et h el a c ko f h y d r o l y t i ca c t i v i t yt h e m s e l v e s h o w e v e r ，i ti sd i f f i c u l tt oe x p r e s sp l a n te x p a n s i ni n o t h e rs p i e c e s ，o n l yp u r i f i c a t i o nc a nn o tm e e tt h ei n d u s t r i a ln e e d , s w o l l e n i nh a v ea n a d v a n t a g ei nt h a ti tc a nb ee x p r e s s e dh e t e r o l o g o u s l yi nad i f f e r e n tm i c r o o r g a n i s mh o s t ， a n dt h u st h ee x p r e s s i o nl e v e lc a nb ei m p r o v e dt h r o u g hm i c r o o r g a n i s mf e r m e n t a t i o n m o s to ft h ep r e v i o u sw o r k so ns w o l l e n i nm a i n l yf o c u s e do nt h e i n v e s t i g a t i o no f s w o l l e n i na c t i v i t y ，l i t t l ei n f o r m a t i o na b o u tt h ee f f e c t so fm e d i u mc o m p o s i t i o na n d e x p r e s s i o n c o n d i t i o n so nt h ep r o d u c t i v i t yo fs w o l l e n i n p r o t e i ni sa v a i l a b l e t h es w o lg e n ee n c o d e sap o l y p e p t i d eo f4 9 3a m i n oa c i dr e s i d u e s ，t h e b i o - i n f o r m a t i c ss o f t w a r ea n a l y s i sr e s u l ti n d i c a t e st h a tt h ep r e d i c t e dm o l e c u l a rw e i g h t a n dp io ft h ep r o t e i nw a s51 5k da n d4 8 ，r e s p e c t i v e l y t h es w o l l e n i np r o t e i nh a st h r e e m a i n l yd o m a i na sf o l l o w s ：c e l l u l o s eb i n d i n gd o m a i n , e x p a n s i n e g4 5d o m a i na n d e x p a n s i n - c b d t h es e c o n d a r ys t r u c t u r eo fs w o l l e n i ni sm a i n l yp - s h e e ta n dr a n d o nc o i l ， e s p e c i a l l yt h e s t r u c t u r eo fc b di st h em o s tl o o s y w es u c c e s s f u l l ye x p r e s s e dt h e s w o l l e n i np r o t e i ni nr e c o m b i n a n ta s p e r g i l l u so r y z a e ，w i t hr e g a r dt ot h es w o l l e n i n b i o a c t i v i t y ，i n v e s t i g a t i o n so nt h ee f f e c t so fc u l t u r ec o m p i s i t o n ( s u c ha sc a r b o ns o u r c e a n dn i t r o g e ns o u r c e ) a n dc u l t u r ec o n d i t i o n sd e v e l o p m e n tw e r ep r e s e n t e dh e r e t h e o p t i m a lc o n d i t i o n sw e r ed e t e r m i n e da sf o l l o w s ：c u l t i v a t i o ni nt h em e d i u m 、析mg l y c e r i n a n dp e a n u ta st h ec a r b o na n dn i t r o g e ns o u r c e ，r e s p e c t i v e l y ，研也t h e1 5 10 7 s p o r e si n 4 0 m lc u l t u r e ，a tp h5 6 ，a n de x p r e s s i o nf o r8 8h u n d e rt h ea b o v eo p t i m a lc o n d i t i o n s ， t h eh i g h e s tp r o d u c t i v i t y ( 5 0 m g l ) o fs w o l l e n i nw a sa c h i e v e d s w o l l e n i ni nc u l t u r a l 浙江理工大學(xué)碩士學(xué)位論文 s u p e t n a t a n t w i l l s p u r i f i e db ya f f i n i t yc h r o m a t o g r a p h y a n dc a t i o n i c e x c h a n g e c h r o m a t o g r a p h y ，b u tt h es w o l l e n i np u r i f i e db ya f f i n i t yc h r o m a t o g r a p h yd i dn o ts h o w s y n e r g i s t i ca c t i v i t y ，t h ep r o b a b l er e a s o ni st h a tt h ep r o t e i nh a db e e nd e n a t u r e d ；t h e s o l u b l es w o l l e n i np r o t e i n sw e r et h e ns u c c e s s f u l l yr e c o v e r e df r o mt h ec u l t u r a l s u p e r n a t a n tb ya n a m o n i u ms u l f a t ep r e c i p i t a t i o na n dc a t i o n i ce x c h a n g ec h r o m a t o g r a p h y t h ep u r i t ya n do v e r a l l r e c o v e r yo ft h es w o l l e n i nw a s9 5 1 a n d5 3 2 a f t e r p u r i f i c a t i o n , r e s p e c t i v e l y 2 6 6m gs w o l l e n i nc o u l db ep u r i f i e df r o m1l f e r m e n t a t i o n m e d i u m f i n a l l y ，t h es y n e r g i s t i ca c t i v i t yo fp u r i f i e ds w o l l e n i nw a si n v e s t i g a t e d ，a n dt h e p r o t e i ne x h i b i t e das i g n i f i c a n ts y n e r g i s t i ce f f e c to nc e l l u l o s eh y d r o l y s i s 、析也c e l l u l a s e w h e nam i x t u r ec o n t a i n i n go 0 6 f p uc e l l u l a s ca n d3 0 0l x go fs w o h c n i np e rgo ff i l t e r p a p e rw a se v a l u a t e d , t h er e l e a s e dr e d u c i n gs u g a ry i e l dw a s81 7 h i g h e rt h a nt h a to f c o n t r 0 1 k e yw o r d ss w o l l e n i n ；a s p e r g i l l u so r y z a e ；e x p a n s i n ；p u r i f i c a t i o n ；s y n e r g i s t i ca c t i v i t y 浙江理1 二大學(xué)碩士學(xué)位論文 摘要 目錄 i i v a b s t r a c t 目錄 縮略語 第一章文獻(xiàn)綜述 l 2 1 1 概述2 1 2 纖維材料的結(jié)構(gòu)特征3 1 2 1 纖維素的組成結(jié)構(gòu)3 1 2 2 植物材料的結(jié)構(gòu)特征4 1 3 纖維素的生物降解6 1 3 1 酶解機(jī)制6 1 3 2 纖維素降解中的非酶因子7 1 4 膨脹因子e x p a n s i n 及其膨脹作用8 1 4 1e x p a n s i n 的分類8 1 4 2e x p a n s i n 的結(jié)構(gòu)一9 1 4 3e x p a n s i n 的作片j 機(jī)制1 0 1 4 4e x p a n s i n 的生化性質(zhì)l l 1 4 5e x p a n s i n 的生物功能12 1 4 6 其他物種中的e x p a n s i n 1 2 1 5 真菌s w o l l e n i n 1 3 1 5 1s w o l l e n i n 的研究進(jìn)展1 3 1 5 - 2 真菌s w o l l e n i n 對(duì)纖維素材料的膨脹作用及其在降解纖維素中的協(xié)同作用。1 4 1 6 論文的選題依據(jù)1 5 1 7 主要研究?jī)?nèi)容1 6 第二章序列分析 1 7 2 1 生物信息學(xué)工具1 7 2 2 方法1 7 2 3 結(jié)果17 2 3 1s w o l l e n i n 蛋白氨基酸序列1 7 2 3 2 理化性質(zhì)預(yù)測(cè)1 8 2 3 3 疏水性分析1 9 2 3 4 信號(hào)肽的預(yù)測(cè)2 0 2 3 與功能位點(diǎn)分析2 0 2 3 6 二級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)2 2 2 3 7s w o l l e n i n 氨基酸序列同源性分析2 2 2 4 本章小結(jié)2 3 第三章s w o l l e n i n 蛋白的表達(dá) 3 1 主要材料與試劑2 4 3 1 1 菌種2 4 3 1 2 纖維素酶作用底物2 4 w 浙江理工大學(xué)碩士學(xué)位論文 3 1 3 試劑2 4 3 1 4 試劑的配制2 4 3 2 主要儀器2 6 3 3 方法2 6 3 3 1 菌種活化2 6 3 3 2 搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)2 6 3 3 3s d s p a g e 電泳分析2 7 3 3 4 發(fā)酵液的活性測(cè)定2 8 3 3 5 還原糖濃度測(cè)定方法：2 9 3 4 結(jié)果與討論2 9 3 4 1s w o l l e n i n 的表達(dá)情況分析2 9 3 4 2 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線3 0 3 4 3 發(fā)酵液與纖維素酶的協(xié)同活性3 l 3 5 本章小結(jié)。3 2 第四章培養(yǎng)基成分和培養(yǎng)條件的優(yōu)化 4 1 材料與試劑3 3 4 1 1 材料3 3 4 1 2 試劑3 3 4 1 3 試劑配制3 3 4 2 主要儀器3 3 4 3 方法3 4 4 3 1 碳源的優(yōu)化3 4 4 3 2 氮源的優(yōu)化一3 4 4 3 3 微量元素的影響3 4 4 3 4 最適接種量的選擇3 4 4 3 5 發(fā)酵時(shí)間的選擇一3 4 4 3 6 起始p h 的選擇一3 5 4 4 結(jié)果與討論3 5 4 4 1 反應(yīng)p h 對(duì)纖維素酶活性的影響3 5 4 4 2 碳源的優(yōu)化3 5 4 4 3 氮源的優(yōu)化3 8 4 4 4 微量元素的影響3 9 4 4 5 接種量的影響3 9 4 4 6 發(fā)酵時(shí)間的選擇4 0 4 4 7 起始p h 的選擇4 l 4 5 本章小結(jié)4 2 第五章s w o l l e n i n 蛋白的純化及活性研究 5 1 材料與試劑4 4 5 1 1 材料4 4 5 1 2 試齊u z m 5 1 3 試劑配制4 4 5 2 主要儀器4 5 5 3 方法4 6 5 3 1 親和層析4 6 v 浙江理工大學(xué)碩七學(xué)位論文 5 3 2c m - s e p h a r o s e 離子交換層析4 6 5 3 3 蚩白濃度的測(cè)定4 8 5 3 。4 回收率的計(jì)算4 8 5 3 5s w o l l e n i n 蛋白對(duì)纖維素水解的協(xié)同作用4 9 5 3 6s w o l l e n i n 蛋白濃度對(duì)協(xié)同活性的影響4 9 5 4 結(jié)果與分析5 0 5 4 1 親和層析5 0 5 4 2 離子交換層析5 l 5 4 3b r a d f o r d 定量5 3 5 4 4 回收率5 4 5 4 5s w o l l e n i n 蛋白對(duì)纖維素水解的協(xié)同作用5 4 5 4 6s w o l l e n i n 蛋白濃度對(duì)協(xié)同活性的影響5 5 5 5 本章小結(jié)5 6 總結(jié) 參考文獻(xiàn) 致謝 5 8 5 9 6 3 浙江理工大學(xué)碩士學(xué)位論文 嚼 b l a s t b p b s a c i ) n a c b d d n s f p u m n c b i o d p a g e r p m s d s t e m 匣d t r i s 縮略語 b a s i ca l i g n m e ms e a r c h t o o l b a s ep a i r b o v i n es e r u ma l b u m i n c o m p l e m e n t a r yd e o x y r i b on u c l e i ca c i d c e l l u l o s eb i n d i n gd o m a i n 3 , 5 - d i n i t r o s a l i c y l i ca c i d f i l t e rp a p e ru n i t k i l l o d a l t o n n a t i o n a lc e n t e rf o rb i o t e c h n o l o g yi n f o r m a t i o n o p t i c a ld e n s i t y p o l y a c r y l a m i d eg e le l e c t r o p h o r e s i s r e v o l u t i o n s p e rm i n u t e s o d i u md o d e c y ls u l f a t e 十二烷基硫酸鈉 n n n ，n t t e t r a m e t h y l e t h y l e n e d i a m i n en , n , n ，n 四甲基乙二胺 t r i s0 a y d r o x y m e t h y l ) a m i n o m e t h a n e 3 羥甲基氨基甲烷 浙江理丁大學(xué)碩士學(xué)位論文 1 1 概述 第一章文獻(xiàn)綜述 石油、煤炭等礦產(chǎn)資源是當(dāng)前最主要的能源物質(zhì)和化工原料，但是它們不可 再生，大量消耗必將導(dǎo)致快速枯竭，這將導(dǎo)致現(xiàn)代工業(yè)化社會(huì)的發(fā)展規(guī)模難以維 系。尋找可再生的替代能源和化工原料，已成為維持人類社會(huì)可持續(xù)發(fā)展的緊迫 任務(wù)。利用高新技術(shù)手段開發(fā)生物質(zhì)能源，已成為當(dāng)今世界發(fā)達(dá)國(guó)家能源戰(zhàn) 略的重要內(nèi)容。 生物質(zhì)是太陽(yáng)能最主要的吸收器和儲(chǔ)存器，這些能量是人類發(fā)展所需能源的 源泉和基礎(chǔ)。生物質(zhì)能既不同于常規(guī)的礦物能源，又有別于其他新能源，兼有兩 者的特點(diǎn)和優(yōu)勢(shì)，是人類最主要的可再生能源之一。 生物質(zhì)具體的種類很多，植物類中最主要也是我們經(jīng)常見到的有木材、 農(nóng)作物( 秸稈、稻草、麥稈、豆稈、棉花稈、谷殼等) 、雜草、藻類等。 纖維素是自然界分布最廣、含量最多的一種多糖，是植物細(xì)胞壁的骨架物質(zhì)， 占植物干重的3 5 - - 5 0 。一些植物纖維幾乎是純纖維素，如棉纖維的纖維素含 量接近1 0 0 ，為天然的最純纖維素來源，麻纖維中纖維素含量為7 0 8 0 ，一 般木材中，纖維素占4 0 5 0 。纖維素是地球上最豐富、最廉價(jià)的可再生資源， 如何把纖維素轉(zhuǎn)化成為人類可以直接利用的能源和資源，是人們長(zhǎng)期渴望解決的 重大課題。當(dāng)今世界，能源和資源日趨危機(jī)，開發(fā)高效轉(zhuǎn)化木質(zhì)纖維素類可再生 資源的技術(shù)，利用工農(nóng)業(yè)廢棄物等發(fā)酵生產(chǎn)燃料、化工產(chǎn)品和解決環(huán)境污染問題， 具有極其重要的意義和發(fā)展前景。2 0 世紀(jì)3 0 年代，巴西就已經(jīng)開始用甘蔗進(jìn)行 發(fā)酵生產(chǎn)乙醇燃料，目前，它是世界上唯一不使用純汽油做汽車燃料的國(guó)家。 1 9 7 9 年，美國(guó)采用生物質(zhì)燃料直接燃燒發(fā)電，在2 0 世紀(jì)9 0 年代建立了利 用稻殼等纖維素廢料發(fā)電的電站。 纖維素酶是多組分酶系，在分解纖維素時(shí)起生物催化作用。自從1 9 0 6 年s e i l l i e r e 在蝸牛消化道中發(fā)現(xiàn)纖維素酶以來，人們就開始關(guān)注纖維素的微生物 降解問題。后來發(fā)現(xiàn)纖維素經(jīng)微生物降解后，可轉(zhuǎn)化為燃料、飼料及化工產(chǎn)品等 生產(chǎn)原料，且有望解決因自然界不斷產(chǎn)生的工農(nóng)業(yè)廢棄物導(dǎo)致的環(huán)境污染問題， 2 浙江理t 大學(xué)碩+ 學(xué)位論文 于是纖維素酶得到了廣泛的關(guān)注。隨著人們對(duì)纖維素酶的深入研究，越來越多具 有不同結(jié)構(gòu)和功能的纖維素酶被發(fā)現(xiàn)，使得纖維素酶的應(yīng)用日益廣泛。但是由于 對(duì)纖維素酶的結(jié)構(gòu)了解得不夠透徹，對(duì)其功能也還缺乏足夠的了解，使得纖維素 酶在工業(yè)上的高效應(yīng)用受到很大的局限。 1 2 纖維材料的結(jié)構(gòu)特征 1 2 1 纖維素的組成結(jié)構(gòu) 纖維素大分子的基環(huán)是d 一葡萄糖以p 1 ，4 糖苷鍵組成的大分子多糖， 分子量約5 0 k 2 5 0 0 k ，相當(dāng)于3 0 0 , - 一1 5 0 0 0 個(gè)葡萄糖基脫水葡萄糖，其分子 式為：( c 6 h 1 0 0 5 ) n ，其化學(xué)組成含碳4 4 4 4 、氫6 1 7 、氧4 9 3 9 。 纖維素不溶于水和乙醇、乙醚等有機(jī)溶劑。 f i g1 1 纖維素的結(jié)構(gòu) f i g1 1t h es t r u c t u r eo fc e l l u l o s e 纖維素是線形葡萄糖，葡萄糖殘基間形成大量氫鍵，相鄰分子間氫鍵使帶狀 分子彼此平行地連在一起，這些纖維素分子鏈都具有相同的極性，這些相鄰、平 行的伸展鏈在殘基環(huán)面的水平向通過鏈內(nèi)和鏈間的氫鍵網(wǎng)形成片層結(jié)構(gòu)( s h e e t s t r u c t u r e ) ，這樣若干條鏈聚集成緊密的有周期性晶格的分子束，稱微晶( c r y s t a l l i t e ) 或膠束( m i c e l l e ) t 。多個(gè)這樣的平行膠束組成了微纖絲( m i c r o f i b r i l ) ，若干個(gè)微纖 絲又組成大纖絲( m a c r o f i b r i l ) ，構(gòu)成自然界不同類型、不同長(zhǎng)度、不同大小的纖 浙江理工大學(xué)碩士學(xué)位論文 維素纖維。 在自然界中，纖維素分子一般與半纖維素、木質(zhì)素一起以復(fù)合體形式存在， 形成較復(fù)雜的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。天然的纖維素中存在排列相對(duì)松散的、不規(guī)則的無定形 區(qū)，其分子密度小，分子間隙小，定向差；除此之外，還存在分子密度大、平行 排列的結(jié)晶區(qū)。至今已發(fā)現(xiàn)固態(tài)纖維的五種結(jié)晶變體，即天然纖維素( 纖維素d ， 人造纖維素i i 、人造纖維素i 、人造纖維素、人造纖維素v 【2 】。纖維素的這種 結(jié)晶結(jié)構(gòu)非常牢固，使細(xì)胞壁具有高強(qiáng)度，導(dǎo)致纖維素對(duì)生物降解的天然抗性【3 】。 纖維素具有兩個(gè)結(jié)構(gòu)特點(diǎn)：首先，纖維的各個(gè)分子包裝的非常密，組裝成細(xì) 胞壁、表皮等超結(jié)構(gòu)，酶等大分子和水等小分子都不能滲透；其次，結(jié)構(gòu)晶體化， 分布離散。纖維素的結(jié)構(gòu)復(fù)雜性和不溶于水的性質(zhì)給其處理過程帶來很大的困 難，使得人們?cè)谘芯扛鞣N纖維素酶，尤其是內(nèi)切葡聚糖酶時(shí)，常用高水溶性的羧 甲基纖維素作為底物，但是這在一定程度上削弱了纖維素酶分解纖維素的意義， 畢竟羧甲基纖維素和天然的不溶于水的纖維素在結(jié)構(gòu)和性質(zhì)上還是有差別的，人 們希望用纖維素酶來處理大量的天然纖維素。 1 2 2 植物材料的結(jié)構(gòu)特征 植物纖維是最主要的纖維原料，而纖維素則是植物纖維細(xì)胞細(xì)胞壁的主要成 分。植物細(xì)胞壁由胞間層( i n t e r c e l l u l a rl a y e r ) 、初生壁( p r i m a r yw a l l ) 以及次生壁 ( s e c o n dw a l l ) 組成( 圖1 2 ) 。初生細(xì)胞壁的主要成分是多糖，蛋白以及一些離子 ( 圖1 3 ) ，而多糖主要是纖維素，半纖維素和果膠質(zhì)；次生壁又分內(nèi)( s 1 ) 、( s 2 ) 、 外( s 3 ) 三層，外層和內(nèi)層都很薄，只有中層最厚，占次生壁厚度的7 0 9 0 ， 主要成分是纖維素、半纖維素和木質(zhì)素。次生壁中積累的生物質(zhì)占植物生物質(zhì)總 量的絕大部分，它是地球上生物質(zhì)的主要形式和人類所需纖維材料和生物能源原 料【4 】。 4 浙江理工大學(xué)碩士學(xué)位論文 i 敲：藕舶l(fā) a t v i a 圖1 2 植物細(xì)胞壁的亞顯微結(jié)構(gòu) f 逛1 2t h es u b m i c r o s c o p i cs t r u c t u r eo fp l a n tc e l lw a l l 圖1 3 初生細(xì)胞壁的纖維結(jié)構(gòu) r i g1 3t h ef i b e rs t r u c t u r eo fp r i m a r y c e l lw a l l 構(gòu)成細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)成分中，9 0 是多糖( p o l y s a c c h a r i d e s ) ，包括纖維素，半 纖維素、果膠物質(zhì)，它們是由葡萄糖、阿拉伯糖、半乳糖醛酸等聚合而成；此外 還含有結(jié)構(gòu)蛋白、酶類、木質(zhì)素以及礦物質(zhì)等( 表1 1 ) 。 (rj|蘭 浙江理工大學(xué)碩士學(xué)位論文 表1 1 從懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞分離的細(xì)胞壁的組成 t a b l e1 1t h ec o m p o s i t i o no fc e l lw a l ls e p a r a t e df r o ms u s p e n d e dc u l t u r e dc e h 1 3 纖維素的生物降解 在纖維素的生物降解過程中，除了微生物產(chǎn)生的纖維素酶的酶解作用，還發(fā) 現(xiàn)了一些新的蛋白因子。 1 3 1 酶解機(jī)制 纖維素酶是降解纖維素生成纖維素分子鏈、纖維二糖和葡萄糖的一類酶的總 稱，主要作用于p 1 ，4 葡萄糖苷鍵，由于降解纖維素的微生物所產(chǎn)生的纖維素 酶是多種具有不同功能的組分，所以纖維素酶又有纖維素酶復(fù)合物之稱。在纖維 素酶的分類上，最初是1 9 5 0 年由美國(guó)的r e e s e 等1 5 j 提出了c 1 c x 的概念。認(rèn)為 主要包括c 1 酶、c x 酶和p 一葡萄糖苷酶。這三種不同的酶協(xié)同作用，且必須同 時(shí)存在，才能將纖維素徹底地水解為葡萄糖。c 1 酶主要作用于天然纖維素，進(jìn) 攻纖維素的非結(jié)晶區(qū)，形成新的游離末端；c x 酶又可分為c x l 酶和c x 2 酶，c x l 酶是內(nèi)斷型纖維素酶，作用于水合非結(jié)晶纖維素分子內(nèi)部的p 1 ，4 糖苷鍵，生 成纖維糊精和纖維二糖，c x 2 酶為外斷型纖維素酶，作用于水合非結(jié)晶纖維素分 子非還原端的p 1 ，4 糖苷鍵；1 3 一葡萄糖苷酶將纖維二糖水解成兩個(gè)葡萄糖分子， 因此又被稱為纖維二糖酶。 目前公認(rèn)的纖維素酶的分類方法是，根據(jù)各種酶催化反應(yīng)功能的不同可分 為l ，g - i s 一葡聚糖水解酶或p 一1 ，4 一葡聚糖內(nèi)切酶( 1 , 4 一p d g l u c a n g l u c a n o h y d r o l a s e 或e n d o - 1 ，4 - 1 3 d g l u c a n a s e ，e c 3 2 1 4 ，來自真菌的簡(jiǎn)稱e g ， 6 浙江理工大學(xué)碩+ 學(xué)位論文 來自細(xì)菌的簡(jiǎn)稱c e n ) 、外切葡聚糖酶( 1 ，4 d d g l u c a nc e l l o b i l h y d r o l a s e 或 e x o 1 4 - 1 3 d g l u e a n n a s e ，e c 3 2 1 9 1 ，來自真菌的簡(jiǎn)稱c b h ，來自細(xì)菌的簡(jiǎn) 稱c e x ) 和d 一葡聚糖苷酶( p 1 ，4 g l u c o s i d a s c ，e c 3 2 1 2 1 ，簡(jiǎn)稱b g ) ，其 中葡聚糖水解酶作用于纖維素多糖鏈內(nèi)部的無定型區(qū)，隨機(jī)水解p 1 ，4 糖苷 鍵，將長(zhǎng)鏈纖維素分子截短，產(chǎn)生大量的帶有非還原性末端的小分子纖維素；外 切葡聚糖酶作用于還原性和非還原性的纖維素多糖鏈的末端，水解p 1 ，4 糖 菅鍵，每次切下一個(gè)纖維二糖分子，故又稱為纖維二糖水解酶( c e l l o b i o h y d r o l a s e ) ： b 葡聚糖苷酶可水解纖維二糖或可溶性纖維糊精產(chǎn)生葡萄糖。 由于人們沒有重視纖維素分子的結(jié)晶結(jié)構(gòu)對(duì)降解的影響，在現(xiàn)代實(shí)驗(yàn)技術(shù)飛 速發(fā)展的情況下，雖然目前對(duì)纖維素酶水解纖維素的機(jī)理已基本清楚，但是高效 降解天然結(jié)晶纖維素的問題仍未得到解決，致使多年來進(jìn)行的提高纖維素酶解效 率的工作成效不大。纖維素酶本身與淀粉酶在比活力方面差異不大，但是它們酶 解纖維素和淀粉的速度卻差異較大，其主要原因是纖維素與淀粉的結(jié)構(gòu)差異。 1 3 2 纖維素降解中的非酶因子 一些研究【鯽】通過蒸汽爆破等物理、化學(xué)方法對(duì)纖維材料進(jìn)行預(yù)處理，結(jié)晶 區(qū)被“無定形”化后的纖維材料很容易被纖維素酶完全水解，水解速率與淀粉酶相 似，具有良好的應(yīng)用前景。 纖維素糖苷鍵的酶解已被大量研究，一部分研究也顯示，在纖維素的生物降 解過程中，除了酶解機(jī)制外還有其它降解機(jī)制或因子的存在。1 9 世紀(jì)5 0 年代初， r e e s e 等【5 j 提出能夠破壞纖維素結(jié)晶結(jié)構(gòu)的“氫鍵酶”的存在，但是至今仍沒有研 究能很好地證實(shí)他的這一觀點(diǎn)【1 0 1 。k n o w l e s 等人和閻伯旭等人f 1 2 1 對(duì)c b d 進(jìn) 行的研究均證實(shí)了c b d 具有協(xié)同降解纖維素的作用，會(huì)破壞纖維素分子的高級(jí) 結(jié)構(gòu)，但是不產(chǎn)生還原糖，即不水解糖苷鍵；另外還發(fā)現(xiàn)一些微生物產(chǎn)生的蛋白 和作用因子具有誘導(dǎo)和調(diào)節(jié)纖維素酶降解纖維底物的功能【1 3 1 4 1 。近年來在研究 中還發(fā)現(xiàn)一些低分子量的因子，這些組分雖然沒有纖維素水解活性，但是能夠促 進(jìn)纖維素酶對(duì)結(jié)晶纖維素的降解【1 5 ，1 6 1 ，這些研究對(duì)人們研究纖維素的降解機(jī)制 有重要意義。 近年來，人們?cè)谥参锛?xì)胞壁中發(fā)現(xiàn)了一類新的蛋白家族，被稱為e x p a n s i n ( 膨 7 浙江理工大學(xué)碩十學(xué)位論文 脹素) 。該蛋白的發(fā)現(xiàn)起始于1 9 8 9 年c o s g r o v e 對(duì)黃瓜下胚軸的研究，該研究顯示， 在對(duì)植物細(xì)胞壁進(jìn)行酸誘導(dǎo)生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)時(shí)，細(xì)胞壁僅在實(shí)驗(yàn)開始伸長(zhǎng)很快，隨后1 2 h 膨脹變慢，但黃瓜下胚軸細(xì)胞壁的膨脹持續(xù)時(shí)間比較長(zhǎng)，這表明黃瓜下胚軸細(xì) 胞壁有穩(wěn)定的壁膨脹機(jī)制。1 9 9 2 年，c o s g r o v e 實(shí)驗(yàn)室的m c q u e e n m a s o n 等首次用 細(xì)胞壁擴(kuò)張?bào)w外重組方法從黃瓜幼苗下胚軸伸長(zhǎng)區(qū)中分離鑒定出一種特異性蛋 白，這是一個(gè)重要突破。該蛋白能在離體條件下恢復(fù)變性細(xì)胞壁的伸展活性，而 其他蛋白質(zhì)沒有發(fā)現(xiàn)有這種性質(zhì)。它能恢復(fù)熱失活后的黃瓜下胚軸細(xì)胞壁的伸展 現(xiàn)象，而且細(xì)胞壁的伸展強(qiáng)度和動(dòng)力學(xué)性質(zhì)均與正常生長(zhǎng)的細(xì)胞壁類