（微生物與生化藥學(xué)專業(yè)論文）鹽酸克倫特羅時間分辨熒光免疫分析方法的建立.pdf

摘要 摘要 食品安全問題已經(jīng)成為當(dāng)今世界關(guān)注的焦點問題之一。近年來，鹽酸克倫特羅 ( c l e n b u t e r o l ，c b l ) 殘留致使食物中毒的報道屢見報端，嚴(yán)重危害了人們的健康與生 命。時間分辨熒光免疫分析方法( t i m e r e s o l v e df l u o r o i m m u n o a s s a y ，t r f i a ) 是近十年 發(fā)展起來的一種新興的非放射性免疫標(biāo)記技術(shù)，具有靈敏度高、特異性強、重復(fù)性好等 優(yōu)點，并且非常適合大規(guī)模樣品的篩選。 本論文旨在開發(fā)具有我國自主知識產(chǎn)權(quán)的高靈敏、快速檢測c b l 的t r f i a 試劑盒。 首先，重氮化的c b l 分別與血藍(lán)蛋白( k e y h o l e l i m p e th e m o c y a n i n ，k l h ) 和卵清蛋白 ( o v a l b u m i n ，o v a ) 交聯(lián)，合成免疫抗原c b l k l h 和包被抗原c b l o v a 。免疫原 c b l - k l h 按免疫程序免疫新西蘭大白兔，產(chǎn)生的抗血清效價高達l ：2 0 4 8 0 0 。以此抗 體為基礎(chǔ)，設(shè)計了間接競爭兩步t r f i a ( c b l t r f i a ) 方法：固相c b l 與蝣離c b l 共同競爭有限的抗c b l 抗體，用稀土離子e u 3 + 標(biāo)記的羊抗兔抗體進行示蹤。研制出可 方便得應(yīng)用于各個實驗室中的間接競爭c b l t r f i a 檢測試劑盒。此t r f i a 試劑盒靈 敏度達到：o 0 0 7 6 肛g l ，比酶聯(lián)免疫吸附檢測法( e n z y m e l i n k e di m m u n os o r b e n t a s s a y ， e l i s a ) 高了1 0 倍，顯示了該檢測方法的優(yōu)越性。體液( 尿液和血液) 和組織回收率 為8 0 一1 2 0 。通過精密度、準(zhǔn)確度、穩(wěn)定性和特異性等參數(shù)來評估此檢測方法，并與 c b l - e l i s a 試劑盒進行了比較。結(jié)果表明，此間接競爭c b l t r f i a 試劑盒各項指標(biāo)符 合標(biāo)記免疫試劑的要求，并能達到實際檢測的需要。 關(guān)鍵詞：鹽酸克倫特羅，c b l ，時間分辨熒光免疫分析方法，t r f i a a b s t r a c t a b s t r a c t f o o ds a f t yh a sa l r e a d yb e c o m et h eg l o b a lf o c u so fa t t e n t i o n i nr e c e n ty e a r s ，al o to f n e w sa b o u tf o o dp o i s o n i n gr e s u l t i n gf r o mc l e n b u t e r o l ( c b l ) r e s i d u e si nf o o dh a sb e e n r e p o r t e d c u r r e n t l y , t h e r ei sa p p r e c i a b l ec o n c e r na b o u tt h ep o t e n t i a lc o n s u m e rh e a l t h h a z a r d sa s s o c i a t e d 、i t l lt h ei l l e g a lu s eo f c l e n b u t e r o la sag r o w t hp r o m o t i n ga g e n t t i m e r e s o l v e df l u o r o i m m u n o a s s a y ( t r f i a ) d e v e l o p e di nr e c e n tt e ny e a r si so n ek i n do f i n f a n tn o n r a d i o l a b e l e di m m u n o a s s a y , w h i c hi sr a p i d ，s e l e c t i v i t ya n dw e l l r e p r o d u c i b i l i t yt o s c r e e nl a r g es a m p l e s i no r d e rt op r o v i d ear a p i da n ds e l e c t i v i t yt r f i ak i tw i t ho w ni n t e l l e c t u a lp r o p e r t y r i g h t s f o rt h ed e t e r m i n a t i o no fc l e n b u t e r o l ，c l e n b u t e r o lw a sd i a z o t i z e df i r s t l ya n dt h e n c o u p l e d t o k e y h o l e l i m p e th e m o c y a n i n ( k l h ) a n do v a l b u m i n ( o v a ) t os y n t h e s i s i m m u n o g e na n dc o a t i n ga n t i g e nr e s p e c t i v e l y a n t i c b la n t i b o d yw a sr a i s e d b y i m m u n i z a t i o na g a i n s tc b l k l hi nn e wz e a l a n dw h i t er a b b i t s t h ea s s a yr e s u l t ss h o w e d t l l a tt h er a b b i t sa n t i s e r u mt i t r ei sa sh i 曲a sl ：2 0 4 8 0 0 b a s e do nt l l i sa n t i b o d y , a c o m p e t i t i v ei n d i r e c tt r f i aw a sd e s i g n e d c b l - o v aw a sc o a t e db yp h y s i c a la d s o r p t i o n o n t ot h em i c r o t i t r ep l a t e c b lo rs a m p l ew i t hc b la sac o m p e t i t o r b o t ht h e mw e r e i n c u b a t e dw i t hl i m i t e da n t i - c b la n t i b o d y , a n dag o a ta n t i r a b b i ti g g - e u 3 + c o n j u g a t ew a su s e d a sat r a c e la c o m p e t i t i v ei n d i r e c tc b l - t r f i ak i tw a sd e v e l o p e d i tp r o v i d e dal i m i to f d e t e c t i o no fo 0 0 7 6 p g l ，r e c o v e d s o d yf u i da n dt i s s u e s ) b e t w e e n8 0a n d1 2 0p e r c e n t p r e l i m i n a r ye v a l u a t i o no fa s s a yp e r f o r m a n c et h r o u g hf o l l o w i n gi t e m s ：r e p r o d u c i b i l i t y , s e n s i t i v i t y , p r e c i s i o n ，a n da c c u r a c ys h o w e dt h a tt h i st r f i ak i tc a r la p p l i e dt op r a c t i c a l d e t e c t i o nf o rc b l m o r e o v e gi tw a sc o m p a r e dw i t l lt h ee n z y m e l i n k e di m m u n o s o r b e n t a s s a y ( e l i s a ) k i t k e yw o r d s ：c l e n b u t e r o l ，t i m e r e s o l v e df l u o r o i m m u n o a s s a y ( t r f i a ) i i 獨創(chuàng)性聲明 y 9 6 7 7 6 6 本人聲明所呈交的學(xué)位論文是本人在導(dǎo)師指導(dǎo)下進行的研究工 作及取得的研究成果。盡我所知，除了文中特別加以標(biāo)注和致謝的地 方外，論文中不包含其他人已經(jīng)發(fā)表或撰寫過的研究成果，也不包含 本人為獲得江南大學(xué)或其它教育機構(gòu)的學(xué)位或證書而使用過的材料 與我一同工作的同志對本研究所傲的任何貢獻均已在論文中作了明 確的說明并表示謝意。 簽名：因建日期：年月日 關(guān)于論文使用授權(quán)的說明 本學(xué)位論文作者完全了解江南大學(xué)有關(guān)保留、使用學(xué)位論文的規(guī) 定：江南大學(xué)有權(quán)保留并向國家有關(guān)部門或機構(gòu)送交論文的復(fù)印件和 磁盤，允許論文被查閱和借閱，可以將學(xué)位論文的全部或部分內(nèi)容編 入有關(guān)數(shù)據(jù)庫進行檢索，可以采用影印、縮印或掃描等復(fù)制手段保存、 匯編學(xué)位論文，并且本人電子文檔的內(nèi)容和紙質(zhì)論文的內(nèi)容相致。 保密的學(xué)位論文在解密后也遵守此規(guī)定。 簽名： 茸趣 導(dǎo)師簽名； 日期： 9 爭 年月日 第一章緒論 第一章緒論 人類的生存和發(fā)展要求外界提供安全的，有營養(yǎng)的，能促進健康的食品，其中食品 的安全性是最基本的要素。所謂食品安全是指食品中不應(yīng)含有可能損害或威脅人體健康 的有毒有害物質(zhì)或因素，不會導(dǎo)致消費者急慢性中毒或感染疾病，不會產(chǎn)生危害消費者 及其后代健康的隱患l l j 。當(dāng)前，每年有數(shù)億人因?qū)嵱昧瞬话踩氖称范鴮?dǎo)致患病甚至死 亡，因而，食品安全已經(jīng)成為全球關(guān)注的焦點問題之一，引起了各個國家的高度重視。 我國，食品安全也成為廣泛關(guān)注的問題，已經(jīng)寫入中央文件的發(fā)展規(guī)劃和綱要中【2 l 。 隨著畜牧業(yè)規(guī)?；蜕虡I(yè)化的發(fā)展，獸藥及飼料添加劑在畜牧業(yè)生產(chǎn)中得到了廣泛 應(yīng)用。它能減低動物死亡率，縮短動物飼養(yǎng)周期，促進動物性產(chǎn)品的產(chǎn)量的增長和動物 集約化養(yǎng)殖的發(fā)展。但是不當(dāng)或非法使用這些藥物，使得過量的藥物殘留在動物體內(nèi)， 一旦人們食用了這些動物性食品后，過量的殘留藥物會在人體內(nèi)蓄積，產(chǎn)生過敏、畸形 和腫瘤等不良后果，直接危害人體的健康和生命 3 “5 l 。雖然近年來合格率有所提高， 但是問題依然十分突出，其中有很大部分是因為鹽酸克倫特羅( c l e n b u e r o l ，c b l ) 超標(biāo)所引起的。 2 0 世紀(jì)8 0 年代初，美國一家公司意外發(fā)現(xiàn)，c b l 具有明顯的激素樣作用能使肥豬 多長瘦肉少長膘。它添加到飼料中能改變養(yǎng)分在動物體內(nèi)的代謝途徑，能促進動物肌肉 特別是骨骼肌中蛋白質(zhì)的合成，并抑制脂肪的合成和積累，從而改變胴體品質(zhì)，使后肢 肌肉飽滿凸出，肉色特別紅潤鮮亮，瘦肉率提高很多，所以c b l 被俗稱為“瘦肉精” 一】。隨后，它作為增肉添加劑被一些國家應(yīng)用于養(yǎng)殖業(yè)藥或畜禽飼料添加劑。近年來， 在經(jīng)濟利益的驅(qū)動下，因c b l 殘留導(dǎo)致的中毒事件一度見諸于各大報刊，c b l 的污染 引起了人們對食品安全性的恐慌?！胺判娜狻钡暮袈晞倓傔^去，“安全肉”的課題又?jǐn)[在 了我們面前。c b l 的公害已成為全社會關(guān)注的熱點踴。 1 1c b l 簡介 1 , 1 1c b l 的理化性質(zhì) c b l 是一種白色或類白色的結(jié)晶粉末，無臭，味苦，熔點1 7 2 1 7 5 0 ，溶于水，乙 醇，微溶于丙酮，不溶于乙醚?；瘜W(xué)名羥甲基叔丁腎上腺素忉 上 h c h 一一e c h ， 圖1 - 1 c b l 化學(xué)結(jié)構(gòu)式 f i 9 1 一lc h e m i c a ls t r u c t u r eo f c l e n b u t e r o l i 堅墮奎蘭堡主蘭竺堡蘭 c b l 屬于芳香胺類化合物，c b l 的分子式為c 1 2 h 1 8 c 1 2 n 2 0 ，化學(xué)結(jié)構(gòu)式如圖1 1 ， 分子量3 1 3 6 5 。 1 1 2c b l 的毒性分析 c b l 是人工合成的腎上腺素1 32 受體選擇性激動劑，對心臟有興奮作用，可引起交 感神經(jīng)興奮，所以又稱為1 3 興奮劑。c b l 在動物體內(nèi)分布快，半衰期長，消除緩慢， 主要分布在肝臟，肌肉中，人食用后容易引起人體中毒性反應(yīng)嘲。 1 1 2 1c b l 的毒理作用 c b l 急性中毒主要是由于激動心臟和骨骼肌的1 32 腎上腺素受體所致。c b l 在胃腸 道吸收快，1 5 - 2 0 分鐘即起作用，2 - 3 小時血漿濃度達到峰值，一般健康人食用2 0 a g 藥 效會有所表現(xiàn)，5 一l o 倍的攝入量則會導(dǎo)致中毒。癥狀表現(xiàn)為肌肉振顫、心動過速、心悸 和緊張等。重復(fù)染毒主要癥狀為心動過速，較高劑量時發(fā)生心肌壞死，這可能與心動過 速導(dǎo)致心肌血液灌流減少有關(guān)【9 】 1 1 2 2 對運動能力的影響 近年來，某些體格健康的運動員將1 32 激動劑作為肌肉增強劑或者營養(yǎng)再分配劑濫 用。c b l 由于比其他同類產(chǎn)品具有更長的半衰期和更強的效力，被認(rèn)為有可能提高運 動成績，因而使得c b l 的濫用比其它b2 腎上腺素受體激動劑類藥物更為普遍。但研究 者經(jīng)動物實驗之后報道說，長期使用c b l 不但不能提高運動成績，反而會降低運動成 績，并且對使用者的心肌和心臟都會產(chǎn)生有害影響【i o l 。 1 1 2 3 生殖內(nèi)分泌毒性作用 研究表明，長期使用c b l 的雌性食用牛，其雌激素和孕激素的受體發(fā)生明顯改變n 】。 另外據(jù)報道，c b l 對與性相關(guān)的雙態(tài)腦神經(jīng)核和大鼠性行為有明顯影響【1 2 1 3 1 。 1 1 2 4 生態(tài)毒性作用 c b l 由于性質(zhì)穩(wěn)定、降解緩慢，可以在環(huán)境中蓄積、轉(zhuǎn)移和轉(zhuǎn)化，特別是貯存在 水環(huán)境中的c b l 可擴展和演化【4 l 。顯然，c b l 是一種環(huán)境激素，能通過食物鏈影響公 共健康。 1 1 3c b l 殘留引發(fā)的安全事件 1 9 9 0 年前后，國外發(fā)生多次因食用含有c b l 的肉制品而集體中毒的事件，據(jù)楊詩 興( 2 0 0 1 ) 總結(jié)資料：西班牙1 9 9 0 年三月有1 3 5 人中毒，1 9 9 1 年有4 3 人中毒，1 9 9 2 年有2 3 2 件中毒病例：法國1 9 9 0 年出現(xiàn)9 家2 6 人中毒事件；意大利1 9 9 6 年發(fā)生6 2 人 集體中毒事件。 我國最早報道是在1 9 9 8 年，香港有人因食用含有c b l 的豬肺而發(fā)生的急性中毒事 2 蘭二蘭墮堡 件：隨后，2 0 0 2 年0 4 月1 7 日，廣東遂溪縣發(fā)生一起3 1 人因食私自屠宰的豬內(nèi)臟和豬 肉，導(dǎo)致食物中毒的事件，經(jīng)查明是“瘦肉精”所致。2 0 0 1 年1 1 月1 7 日，北京有1 4 位居民因服用含有c b l 的豬肉而中毒。最多的兩次是2 0 0 1 年8 月廣東信宜的5 3 0 中 毒和廣東河源的6 9 0 人中毒。( 來自各大網(wǎng)站) 1 2 國內(nèi)外c b l 限量標(biāo)準(zhǔn)進展 近年來關(guān)于c b l 的危害已引起世界各國的極大關(guān)注，很多國家已明令禁止在動物 源性食品中使用c b l ，對其制定了最高允許量。隨著我國加入w t o ，建立自己的質(zhì)量 標(biāo)準(zhǔn)，監(jiān)控c b l 是必要的。 美國食品藥品管理局( f d a ) 和世界衛(wèi)生組織( w h o ) 建議，畜產(chǎn)品中c b l 的最高 殘留限量為：肉0 2 9 9 k g ，肝0 61 a g k g ，腎0 6 p g k g ，脂肪0 2 p g k g ，奶0 0 5 p g k g 。 我國農(nóng)業(yè)部也規(guī)定了c b l 的殘留標(biāo)準(zhǔn)，馬、牛肌肉0 1 p g k g ，肝、腎0 5 g k g ，牛奶 0 0 5 g k g l l ”。同時，國際奧委會也將c b l 列為被查的興奮劑名單，禁止運動員非法使 用。 近年來，國際上紛紛開展動物性食品中c b l 殘留檢測的研究，以建立起一個完整 的動物性食品檢測系統(tǒng)，保障人民的健康安全。 1 3c b l 的現(xiàn)有檢測方法及其局限 動物組織中c b l 殘留的測定方法通常有以下四類：感官識別，綜合化學(xué)法，色譜 技術(shù)和免疫分析技術(shù)。感官識別和綜合化學(xué)方法只能定性判斷，免疫分析技術(shù)一般用作 “篩選法”，色譜技術(shù)一般用作“驗證法” 1 3 1 感官識別和綜合化學(xué)法 凡飼喂c b l 比較嚴(yán)重的豬宰后肉色特別鮮紅，后臀肌肉飽滿突出，脂肪非常薄， 肉皮緊貼著瘦肉，瘦肉纖維比較疏松，肉皮與瘦肉之間無肥肉( 肥膘厚度不到1 5 c m ) ， 有時有少量“汗水”滲出肉面。而一般健康肉淡紅色，肉質(zhì)彈性好，也不會有“出汗” 現(xiàn)象。但是通過這種感官識別方法只能簡單，定性對動物性食品中有無c b l 作出初步 判定0 5 a 6 1 。 根據(jù)c b l 的化學(xué)結(jié)構(gòu)與性質(zhì)，也可以參照國家藥典標(biāo)準(zhǔn)方法進行綜合鑒別【 l 。因 其溶于水和乙醇，故可以用水進行提取。c b l 可顯示芳香一胺類的鑒別反應(yīng)，也可以 顯示氯化物的鑒別反應(yīng)，同時，用分光光度計檢測，可在2 4 3 n m 與2 9 6 n m 的波長處得 到最大吸收綜合分析可以判定動物性食品中是否存在c b l 類物質(zhì)，且該法不需昂貴的 儀器與試劑，也沒有復(fù)雜的樣品前處理，同樣此方法也只能簡單、定性的對動物性食品 中有無c b l 作出初步判定。 3 江南大學(xué)碩士學(xué)位論文 1 3 2 色譜技術(shù) 目前，檢測c b l 殘留常用的色譜技術(shù)有高效液相色譜法( h p l c ) 、氣相色譜- 質(zhì)譜聯(lián) 用法( o c m s ) 、毛細(xì)管區(qū)帶電泳法( c e ) 、高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法( h p l c - m s ) 、氣相色 譜傅立葉紅外聯(lián)用法( o c f t i r ) 、薄層色譜法( t l c ) 。其中前三種方法最常用。 1 3 2 1 高效液相色譜法( 1 口l c ) 新檢測器的使用，一定程度上提高了h p l c 的檢出靈敏度。目前，中國已將h p l c 法 作為檢測c b l 殘留的半確證性方法，最低檢測限范圍為i - 1 5 n g g ，其優(yōu)點是檢測精確 度高，而且假陽性率低；缺點是檢測過程煩瑣、檢測時間長，需貴重儀器、難于操作、 價格昂貴【1 8 】。 1 3 2 2 氣相色譜質(zhì)譜法( g c - m s ) c g - m s 法是測定樣品中c b l 的最常用和最成熟的方法之一，它把色譜高效快速的 分離效果和質(zhì)譜高靈敏度的定性分析有機結(jié)合起來，既可定性又可定量，其優(yōu)點是能在 多種殘留物同時存在的情況下對某種特定的殘留物進行定性、定量分析，而且具有較高 的靈敏度。c g m s 法與h p l c 法相比，檢測靈敏度更高假陽性率更低。因此，中國將 c g - m s 法定為檢測c b l 的確證性方法，c g - m s 法的缺點同h p l c 相似【1 9 2 0 i 。 1 3 2 3 毛細(xì)管電泳法唧) c e 法非常適用于那些難以用傳統(tǒng)的液相色譜法分離的離子化樣品的分離與分析。 其分離效率可達幾百萬理論塔板數(shù)。優(yōu)點是具有很大的靈活性，許多分離參數(shù)，如緩沖液 的組成和p h 值、毛細(xì)管的類型以及所使用的電場的波形等都可以調(diào)節(jié)操作簡便，所 需樣品量極少，一般只需幾納升口o 】。缺點是檢測時間較長，需較復(fù)雜的儀器。另外不足 之處是目前尚缺乏合適的、配套的檢測器，因此，只有研究、開發(fā)靈敏度更高的檢測系 統(tǒng)，c e 法的優(yōu)勢才能充分發(fā)揮出來【2 l l 。 1 3 3 免疫分析技術(shù) 免疫分析技術(shù)是“邁向2 1 世紀(jì)的醫(yī)學(xué)檢驗技術(shù)”之一，被列為2 0 世紀(jì)9 0 年代優(yōu) 先研究、開發(fā)和利用的藥物殘留分析技術(shù)，聯(lián)合國糧農(nóng)組織( f a o ) 已向許多國家推薦 此項技術(shù)，美國化學(xué)會將免疫分析和氣相色譜、液相色譜共同列為藥物殘留分析的支柱 技術(shù)【2 2 】。免疫分析技術(shù)主要有放射免疫分析技術(shù)( m d i o i m m u n o a s s a y ，r i a ) 和酶免疫 分析技術(shù)( e n z y m ei m m u n o a s s a y ，e i a ) 。 1 3 3 1 放射免疫分析法( i l i a ) 放射免疫分析法具有特異性強，靈敏度高，準(zhǔn)確，快速，操作簡便，易于標(biāo)準(zhǔn)化等 優(yōu)點。但是由于放射免疫分析法需要較昂貴的液體閃爍儀或y 放射儀，且放射性同位 素對工作人員有一定的傷害，廢棄物又不易處理，這些不利因素限制了該法的廣泛應(yīng)用 4 苧= ! 絲絲 1 9 1 。目前國外已生產(chǎn)出運用r i a 測定c b l 的試劑盒產(chǎn)品。還建立了類似放射免疫分析法 的放射受體分析法，這種方法是用受體代替抗體結(jié)合c b l ，檢測限可達到2 4 n g g 。國內(nèi) 在此方面的研究尚屬空白牡3 2 4 1 。 1 3 3 2 酶聯(lián)免疫分析法( e i a ) 酶聯(lián)免疫分析法中應(yīng)用最廣泛的是酶聯(lián)免疫吸附檢測法( e n z y m e l i n k e di m m u n o s o r b e n t a s s a y ，e l i s a ) ，e l i s a 法是c b l 殘留檢測中最為常用的一種方法。 e l i s a 的優(yōu)點是特異性強，靈敏度高，操作簡便，檢測迅速【2 6 】，特別適用于大批 量樣品的檢測。目前，我國進出口檢驗檢疫，獸醫(yī)衛(wèi)生部門及屠宰場多采用德國 r - b i o p h a r r f l ，英國r a n d o x 等公司生產(chǎn)的c b l - e l i s a 檢測試劑盒，但由于進口試劑盒 價格昂貴，在一定程度上限制了它的使用范圍。國產(chǎn)e l i s a 試劑盒普遍存在靈敏度不 夠、假陽性率高、不穩(wěn)定等諸多問題，難以推廣應(yīng)用。 1 3 3 3 熒光免疫分析法( 簡稱熒免法，v i a ) 熒免法同放免法相比，克服了放免法中的核輻射缺點。與色譜法相比，熒免法檢測 藥物殘留具有特異性高，穩(wěn)定性好，對樣品處理要求比較簡單及一次可檢測多個樣品等 優(yōu)點。缺點是對溫度的強烈依賴性和熒光強度取決于激發(fā)波長【2 6 】。 1 4 時間分辨熒光免疫分析法 時間分辨熒光免疫分析法( t i m er e s o l v e df l u o r o i s n m u n o a s s a y , t r f i a ) 是近十年發(fā) 展起來的一種微量分析方法，是利用免疫反應(yīng)的高度特異性和標(biāo)記示蹤物的高度靈敏性 相結(jié)合而建立的一類非放射性的新興檢測技術(shù)。近年來以其特出的優(yōu)點逐漸為人們所重 視，目前，該技術(shù)已不局限于臨床診斷領(lǐng)域，而滲透到生物學(xué)研究的各個領(lǐng)域。它是目 前最靈敏的超微量分析技術(shù)之一，其靈敏度高達1 0 1 9 m o l ，較r i a 的1 0 d 6m o l l 高出 3 個數(shù)量級1 2 7 j 。采用t r f i a 方法建立的試劑盒具有效期長、無放射性污染、操作流程 短、靈敏度高、標(biāo)準(zhǔn)曲線量程寬、可全自動操作及應(yīng)用范圍十分廣泛等優(yōu)點瞄l 。 1 4 1 基本原理 t r f i a 和通常的普通的熒光分析原理基本相同，只是t r f i a 采用了一種特殊的標(biāo) 記物，即三價稀土離子( e u 3 + 、t b ”、s m 3 * 、d y 3 + 等) 及其螯合劑( 代替熒光物質(zhì)、同 位素或酶) 。標(biāo)記蛋白質(zhì)、多肽、激素、抗體、核酸探針或生物活性細(xì)胞，待反應(yīng)體系( 如： 抗原抗體免疫反應(yīng)，生物素親和素反應(yīng)、核酸探針雜交反應(yīng)、靶細(xì)胞與效應(yīng)細(xì)胞的殺傷 反應(yīng)等) 發(fā)生后，用時間分辨熒光儀測定最后產(chǎn)物中的熒光強度，根據(jù)熒光強度和相對 熒光強度比值，判斷反應(yīng)體系中分析物的濃度，達到定量分析的目的【2 9 - 3 l 】。 t r f i a 的基本原理是：( 1 ) 使抗原或抗體結(jié)合到某種固相載體表面，并保持其免疫 活性。( 2 ) 使抗原或抗體與某種稀土離子連接成標(biāo)記抗原或抗體，這種標(biāo)記標(biāo)抗原或抗 體既保留其免疫活性，又保留稀土離子的熒光特性。在測定時，把受檢標(biāo)本( 測定其中 堊墮查蘭堡主蘭垡堡奎 的抗體或抗原) 和標(biāo)記抗原或抗體按不同的步驟與固相載體表面的抗原或抗體起反應(yīng)。 用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復(fù)合物與其他物質(zhì)分開，最后結(jié)合在固相載 體上的稀土離子量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量成一定的比例。通過延緩時間測量稀土離子的 熒光，消除自然熒光的干擾，從而使測定方法達到很高的敏感度2 引。 圖1 - 2 時間分辨熒光免疫分析的基本原理 嘶1 - 2t h ep r i n c i p l eo ft i m e - r e s o l v e df l u o r oi m m n n o n s s a y 1 4 2 時間分辨熒光免疫分析的標(biāo)記【2 8 j 時間分辨熒光免疫分析是以鑭系元素如銪( e u ) 、釤( s m ) 、鏑( d y ) 、鋱( t e ) 等稀土 離子為標(biāo)記物，稀土離子需通過雙功能螯合劑的橋聯(lián)作用才能標(biāo)記抗原或抗體，雙功能 螯合劑的一端與e 艫+ 等連接，另一端同抗原或抗體分子上的氨基連接。常用的螯合荊有 n 2 一【p 一異硫氰酸一苯基】一二乙烯三胺四醋酸( d t t a ) 、異硫氰酸一苯基一e d t a 及 環(huán)化二乙烯三胺五醋酸酐( c d p t a ) 等，它們含有帶氨基羧酸或帶異硫氰酸基羧酸等活 性基團，有很強的螯合稀土元素的能力。 該類標(biāo)記物具有以下特點：( 1 ) 以小分子量的稀土離子標(biāo)記與酶和生物素等大分子 標(biāo)記物相比，對于被標(biāo)記物的生物活性和結(jié)構(gòu)影響較小，同時，標(biāo)記物更多、穩(wěn)定性更 好、檢測亦更靈敏。( 2 ) 這些離子可產(chǎn)生熒光，在游離狀態(tài)下，該稀土離子的熒光信號 很弱，當(dāng)其螯合物在紫外光或氮激光的激發(fā)下，從激發(fā)態(tài)躍回到基態(tài)時發(fā)射熒光，其熒 光激發(fā)光波長范圍較寬，發(fā)射光譜峰范圍窄，激發(fā)光和發(fā)射光之間有一個較大的s t o k e s 位移，可以通過干涉濾光片將發(fā)射光譜與激發(fā)光譜完全分離，有利于排除干擾、增強測 量的特異性，提高分辨率。( 3 ) 熒光信號為持久性，可反復(fù)測量，其熒光不僅強度高， 而且，熒光衰變時間長。利用時間分辨測量技術(shù)延緩測量時間，待測樣品中短壽命 的自然熒光衰變后，再測定稀土離子的熒光，可消除自然熒光的干擾。還可以加入增強 液，使熒光強度可增強1 0 0 萬倍，大大提高檢測靈敏度。每秒鐘檢測樣品1 0 0 0 次，結(jié) 果取平均值，有利于提高檢測準(zhǔn)確性。( 4 ) 將e u 3 + 等稀土離子標(biāo)記免疫分子，就可建立 飽和或競爭的t r f i a 。t r f i a 能夠克服酶標(biāo)記物的不穩(wěn)定和化學(xué)發(fā)光易受環(huán)境干擾及 僅能一次發(fā)光等缺點，使非特異性信號降低到可以忽略的程度，達到極高的信噪比，從 而，大大地提高了檢測的靈敏度。( 5 ) 時間分辨熒光免疫分析還有一技術(shù)優(yōu)勢，即可以 進行多指標(biāo)分析，若同時采用銪、釤、鏑、鋱等稀土離子標(biāo)記不同的抗原或抗體，它們 具有不同的發(fā)射光譜和不同的熒光壽命，利用該特點可以進行雙標(biāo)記或多標(biāo)記，就能夠 在一次分析中得到多個數(shù)據(jù)。t r f i a 多標(biāo)記的特點是其它免疫分析技術(shù)所不具備的【3 0 6 蔓二蘭絲絲 3 1 1 。 1 4 3 時間分辨熒光免疫分析的方法 根據(jù)免疫分析方法模式的不同，可以分為競爭法和夾心法兩種。 ( 1 ) 競爭法：主要用于小分子抗原、半抗原及一些抗體的檢測，如生物毒素、1 32 微球蛋白等 3 2 1 ，可采用直接競爭法或間接競爭法，直接競爭法一般在微孔板預(yù)先包被第 二抗體，先加入一定量的第一抗體和樣品，孵育洗滌后再加入e u 3 + 標(biāo)記的小分子抗原競 爭結(jié)合第一抗體。間接競爭法一般在微孔板預(yù)先包被抗原，加入一定量的第一抗體和樣 品，孵育洗滌后再加入e u 標(biāo)記的第二抗體進行示蹤。而在一些抗體的檢測中，標(biāo)記抗 體和樣品中的抗體通過競爭結(jié)合一定量的中和抗原來進行分析的。最后，通過孵育洗滌 加入增強溶液，所測得的熒光強度與樣品的含量成反比，標(biāo)準(zhǔn)曲線為競爭抑制曲線。 ( 2 ) 夾心法；用于大分子生物活性物質(zhì)的檢測，該分析的微孔板包被一株抗體，稀 土離子標(biāo)記另一株抗體，最后形成抗體- 抗原抗體標(biāo)記物復(fù)合物，所測得的熒光強度與 樣品的含量成正比，標(biāo)準(zhǔn)曲線為飽和平衡曲線【3 3 1 。 1 4 4 時間分辨熒光免疫分析儀 目前，國內(nèi)市場上常用的時間分辨熒光檢測儀器有e g g w a l l a c 公司的全自動 a u t o d e l f i a - 1 2 3 5 ( 圖1 3 ) 、半自動的v i c t o r l 2 3 0 、v i e t o r l 2 3 4 、v i c t o r l 4 2 0 和國內(nèi)廠家 生產(chǎn)的半自動時間分辨測量儀器( 圖1 4 ) 。全自動d e l f i a - 1 2 3 5 的操作實現(xiàn)全部自動 化，儀器包括樣品架、樣品條碼識別器、液面?zhèn)鞲衅?、吸樣針、傳送裝置，孵育器，洗 板機、加樣裝置、孵育部分、測量部分、程序編制和數(shù)據(jù)處理的電腦等，可同時進行8 個品種、近千份測試，在電腦編程后，可自動進行樣品識別、吸樣、孵育，加增強液及 測量等步驟，在幾個小時內(nèi)最多可出近千份的結(jié)果，非常適合大樣本、多指標(biāo)的檢測， 如果用于食品安全的檢測，可以進行大通量的篩查。 圖l - 3 全自動時閫分辨熒光分析儀 f 嘻1 - 3t h e a u t o d e l f i a - 1 2 3 5 7 圖l - 4 半自動時閫分辮熒光分析儀 f i g 1 4t h es e m i a u t o - d e l f i a 江南大學(xué)碩士學(xué)位論文 1 5 本課韙的立題目的，意義和研究內(nèi)容 1 5 1 目的和意義 根據(jù)目前國內(nèi)外檢測c b l 各種方法的進展情況以及c b l 濫用及殘留的嚴(yán)峻性，建 立一種克服各種檢測方法缺點的靈敏度高，穩(wěn)定性好，精確檢測c b l 的技術(shù)勢在必行。 在檢測方面，各國不余遺力，并采用最新的檢測方法，加大檢測力度。如果我國食品出 口到歐盟等市場，其檢驗檢疫必須符合有關(guān)動物源性食品安全規(guī)定的要求，在這方面我 國產(chǎn)品的出口已遭受了很多的損失。而且獸藥殘留限量也是貿(mào)易保護的一種技術(shù)壁壘， 有的國家利用檢測污染物的技術(shù)優(yōu)勢，設(shè)置技術(shù)壁壘，此外歐盟委員會不斷嚴(yán)格動物源 性食品中c b l 的限量標(biāo)準(zhǔn)，其允許值常低于我國現(xiàn)有免疫學(xué)方法的檢測限。如果我們 跟在國外進行研究的話，我們就無法超越國外的標(biāo)準(zhǔn)，也就隨時有被限制的可能。因此， 盡快建立高靈敏、快速便捷的相關(guān)的檢測，研制具有我國自主知識產(chǎn)權(quán)的試劑盒，超越 國外的技術(shù)壁壘是當(dāng)務(wù)之急。另一方面，我國及歐盟都明令禁止使用c b l ，同樣也要 求檢測方法靈敏度越高越好，不法份子即便只喂養(yǎng)c b l 一次，也能將其檢測出來 t r f i a 在醫(yī)學(xué)等超微量檢測領(lǐng)域中以其具有的更高靈敏度和精確度逐步替代了 e i a 等檢測方法，因此我們采用t r f i a 技術(shù)，建立c b l 的高靈敏的t r f i a 的檢測方 法，完善其應(yīng)用基礎(chǔ)研究，并研制具有我國自主知識產(chǎn)權(quán)的快速檢測試劑盒，滿足國內(nèi) 食品安全檢測市場的迫切需要，讓人們吃上安全肉。應(yīng)用t r f i a 檢測c b l ，其檢測的 靈敏度和精密度將大大高于酶聯(lián)免疫，該方法在國內(nèi)乃至國際上還未有報導(dǎo)，可以大大 提高我國在獸藥殘留檢測方面的技術(shù)水平 1 5 2 研究內(nèi)容 本研究的主要內(nèi)容是建立高靈敏的c b l t r f i a 分析方法，建立相關(guān)的檢測試劑盒， 并對試劑盒進行考核，完成應(yīng)用基礎(chǔ)研究，為產(chǎn)業(yè)化發(fā)展打下基礎(chǔ)。具體內(nèi)容包括： 1 c b l 免疫原的合成與鑒定； 2 抗c b l 抗體的制備； 3 定量檢測c b l 的間接競爭t r f i a 方法的建立： 4 間接競爭c b l - t r f i a 試劑盒的組裝； 5 進行c b l - t r f i a 試劑盒的考核。， 8 第二章鹽酸克倫特羅抗體的制各 第二章鹽酸克倫特羅抗體的制備 獲得親合力高，針對分析物的抗體是免疫學(xué)測定最重要的步驟。c b l 是典型的小 分子半抗原，只有反應(yīng)原性而沒有免疫原性，即不能刺激動物機體產(chǎn)生抗體。必須與大 分子載體進行結(jié)合，增加其分子量及抗原分子表面的抗原決定簇結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性后，才能 獲取免疫原性。由于c b l 是小分子化合物，難以直接吸附到酶標(biāo)板上，因此篩選時還 需制備另一種人工抗原作為固相篩選抗原 c b l 分子中含有氨基，采用重氮化法將c b l 分別與血藍(lán)蛋白( k e y h o l e l i r n p e t h e m o e y a n i n ，k l h ) 和卵清蛋白( o v a l b u m i n ，o v a ) 交聯(lián)，合成免疫原c b l - k l h 和 固相篩選抗原c b l - o v a ，通過紫外掃描鑒定交聯(lián)結(jié)果，采用紫外分光光度法估算兩種 偶聯(lián)復(fù)合物的結(jié)合比。c b l - k l h 免疫兔子后，間接酶聯(lián)免疫方法測定抗體的效價。 2 1 試驗材料 2 1 1 主要儀器 紫外可見分光光度計s p 2 1 0 0 u v 酶標(biāo)儀m u l t i s k a nm k 3 紫外掃描儀d u 6 5 0 型架盤藥物天平h c t p l l 精密酸度計p h s 3 t c 漩渦微型振動器h 1 2 1 2 主要試劑與材料 鹽酸克倫特羅( c b l ) 卵清蛋白( o 、a ) 血藍(lán)蛋白( k l h ) 弗氏完全佐劑和不完全佐劑 辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗兔抗體 ( h r p 羊抗兔i g g ) 新西蘭大白兔 上海光譜儀器有限公司 t h e r m ol a b s y s t e m s b e c k m a n 上海精密科學(xué)儀器有限公司 上海天達儀器有限公司 上海青浦滬西儀器廠 中國藥品生物制品檢定所產(chǎn)品 s i g m a 公司 s i g m a 公司 s i g m a 公司 洛陽華美生物工程公司產(chǎn)品 江蘇省原子醫(yī)學(xué)研究所動物中心 亞硝酸鈉，碳酸鈉，碳酸氫鈉，磷酸二氫鈉，磷酸氫二鈉，氯化鈉，氫氧化鈉等全部為 分析純試劑，均為中國醫(yī)藥集團上?；瘜W(xué)試劑總公司產(chǎn)品。 9 江南大學(xué)碩士學(xué)位論文 2 2 方法 2 2 1 重氮化法制備c b l - o v a 固相篩選抗原 在低溫條件下，c b l 苯環(huán)上的氨基與亞硝酸鈉反應(yīng)形成重氮鹽，再與o v a 蛋白質(zhì) 分子上的酪氨酸、組氨酸、色氨酸殘基反應(yīng)形成偶氮鍵交聯(lián)的結(jié)合物，從而制備出 c b l o v a 人工抗原 3 4 1 ，如圖2 1 所示。 n ：參一。一c 銻 c r 一焉一一c 礤 i - h - 。s l0 v 一c h 。心o h 圖2 1c b l 人工抗原的合成路線圖 f i g 2 - 1c h e m i c a lm u t et os y n t h e s i z ei m m u n o g e nf o r e l e n b u t e r e l ( 1 ) 重氮化：2 5 r a gc b l 溶于4 m l0 1 m o l l 預(yù)冷的h c l 中，緩慢滴加i m o l l 亞硝 酸鈉溶液，用淀粉試紙檢驗至試紙變?yōu)樯钭仙珪r停止，得到重氮化衍生物。 ( 2 ) 偶合反應(yīng)：稱取1 0 0 m g o v a 溶于p h9 6 ，o 0 5 m o l l 的碳酸鹽緩沖液中。將重 氮化的c b l 慢慢滴入o v a 溶液中，用i m o l l n a o h 調(diào)節(jié)p h 維持在9 0 9 5 ，滴加結(jié)束 后，將反應(yīng)生成的橙黃色反應(yīng)液置于4 下輕微攪拌過夜。將偶聯(lián)反應(yīng)后的反應(yīng)液在4 下用p h 7 4 ，o 0 1m o f l 的p b s 透析4 8 小時，得到c b l o v a 結(jié)合物。 2 2 2c b l - k l h 免疫原的制備 方法類同于c b l o v a 的制備，c b l 用量為4 m g ，k l h 用量為1 0 m g ，其余步驟均同。 2 2 3c b l - o v a 完全抗原的鑒定裴外分光光度計法 “ 采用分光光度法進行結(jié)合比率的估測：采用b r a d f o r d 法和l o w r y 法對偶聯(lián)物進行 蛋白質(zhì)含量的測定。偶聯(lián)物是由兩種分子( 蛋白質(zhì)半抗原) 組成，但偶聯(lián)物的絕對含 量常以蛋白質(zhì)的相對濃度表示。測定偶聯(lián)物的濃度與測定偶聯(lián)物溶液中蛋白質(zhì)的相對含 量是一致的。所以，在此用考馬斯亮藍(lán)染色法( b r a d f o r d 法) 確定蛋白質(zhì)含量，然后再 按照測定后的含量配制濃度相同的o v a 標(biāo)準(zhǔn)液。 1 0 苧三蘭苧墼塞絲量里墊竺塑型魚 配制幾個不同濃度的c b l 標(biāo)準(zhǔn)液( 1 0 t t g m l 、2 0 i _ t g m l 、3 0 t t g m l 、4 0 t t g m l ) ，用 u v - 2 1 0 0 紫外掃描儀，在a 2 0 0 - 4 0 0 的范圍內(nèi)分別進行掃描，得到c b l 的最大吸收波長， 并得到該波長下的吸光值。在c b l 的最大吸收波長下分別測c b l o v a 和o v a 的吸光 值，根據(jù)參考文獻1 3 6 1 中介紹的紫外分光光度法計算交聯(lián)率。 2 2 4 抗c b l 多克隆抗體的制備 2 2 4 1 油包水抗原乳化劑的制備 油包水乳化劑有助于促進免疫反應(yīng)性，也起到部分保護不穩(wěn)定抗原的作用，可延長 抗原在體內(nèi)的吸收，這樣可減少加強注射的次數(shù)，在弗氏不完全佐劑中加入殺死的分枝 桿菌或卡介苗就制成弗氏完全佐劑，分枝桿菌能增強局部淋巴結(jié)的炎癥反應(yīng)，擴大免疫 應(yīng)答，有助于促進最終高親合力抗體的形成。因此首次可用完全佐劑，以后幾次選用不 完全佐劑。 方法：用弗氏完全佐劑或弗氏不完全佐劑1 2 m l 混合2 m gc b l - k l h ，用勻漿器混 合2 小時，將制好的乳化劑滴入盛有冷水的燒杯中，若一滴乳化劑狀態(tài)完整地停留在水 面上，而不擴散，表明形成穩(wěn)定的油包水抗原乳化劑蚓。 2 2 4 2 免疫新西蘭大白兔 選取4 周大的，體重約1 5 k g 的健康新西蘭大白兔2 只。首次免疫用完全佐劑使c b l - k l h 終濃度約為l g l 作為免疫原。加強免疫采用不完全佐劑乳化c b l k l h ，劑量同前。 先將新西蘭大白兔背部的毛小心剪去，然后取6 0 0 9 l 制備好的油包水抗原乳化劑，用微 量注射器多位點地進行皮下注射，一只動物背部兩側(cè)注射總數(shù)約為8 1 0 點，使抗原能 緩慢擴散，每隔l - 2 周免疫一次，觀察注射點是否紅腫，如果糜爛可用紫藥水收干。在 免疫3 - 4 次后，從兔子的耳緣靜脈抽血約l m l ，離心1 0 分鐘后，得血清可進行效價鑒 定。共進行6 次免疫，在末次免疫5 天后采用頸動脈放血法取血。 頸動脈放血法：在大白兔頸外側(cè)做皮膚切口，拉開皮膚后可見斜行的胸鎖乳突肌， 將此肌鈍性分離并推向后方，即可見到淡紅色有彈性的總動脈。將此動脈輕輕游離( 連 同與之同行的迷走神經(jīng)) ，用絲線將遠(yuǎn)心端結(jié)扎，近心端用止血鉗夾住，另一止血鉗夾 住動脈迷走神經(jīng)，用以固定。沿結(jié)扎處剪斷血管，用固定止血鉗將斷端鉗住，插入輸血 針管，慢慢打開夾持的止血鉗，動脈血立即通過輸血針管流入瓶中。 采用室溫自然凝固分離抗血清，然后放置3 7 l 小時，再4 1 2 過夜，待凝塊收縮， 4 0 0 0 r p m 離心1 5 分鐘，收集上清，分裝后- 2 0 保存。 2 2 5 抗c b l 多克隆抗體效價的測定 采用酶聯(lián)免疫吸附檢測法( e l i s a ) 測定抗c b l 多克隆抗體的效價。由于是以 c b l k l h 免疫家兔，為避免載體蛋白抗體的影響，因此用c b l - o v a 作為固相篩選抗 原，此時若兔血清中含c b l 的特異抗體，就會被固定于板上，不然則會被洗去，再加 i l 堊墮查蘭堡主蘭竺絲苧 入能與兔血清中抗體反應(yīng)的h r p 羊抗兔抗體，如能顯色，則表明有抗體與c b l 反應(yīng)， 即有抗體的產(chǎn)生。 h r p 與顯色液a ( h 2 0 z ) 和顯色液b ( t m b ，四甲基聯(lián)苯胺) 的作用能顯藍(lán)色， 加終止液后，可通過比較4 5 0 n m 下的o d 值來判斷。從而可得到結(jié)合的抗體的量( 圖2 2 ) 。 朔r l 托鯫 ( 舟饑佩) j i 禽 圖2 - 2 抗體的檢測 f 毽2 - 2d e t e c t 酣o f n t i l m l i a 步驟如下： ( 1 ) c b l - o v a 用0 0 5 m ，p h 9 6 的碳酸鹽緩沖液( n a i - i c 0 3 - n a 2 c 0 3 ) 稀釋至1 t g m l 加入9 6 孔微孔板中，l o o “u 孔，4 放置過夜 ( 2 ) 棄去包被液，洗滌液洗兩次，拍干 ( 3 ) 加入含2 9 l o v a 的碳酸鹽緩沖液，2 0 0 p l 孔，室溫下封閉2 小時，棄去封閉液， 拍干 “) 抗血清用o 2 p b s 稀釋成l ：2 0 0 、l ：4 0 0 、l ：2 0 4 8 0 0 ，各l o o u l 加入以 上板條中，同時以陰性血清作對照，每個濃度重復(fù)3 次 ( 5 ) 3 t c 溫育2 小時后，洗滌液洗4 次 ( 6 ) h r p - 羊抗兔i g g 用0 2 p b s 稀釋為l ：2 0 0 0 后，加1 0 0 “l(fā) 于板上 (