（應(yīng)用化學(xué)專業(yè)論文）微環(huán)境對(duì)PPL在SBA15上固定化及固定化酶性能的影響.pdf

摘要 微環(huán)境對(duì)p p l 在s b a 1 5 上固定化及固定化酶性能的影響 摘要 本文以s b a - 1 5 為固定化酶載體，利用較大孔徑的s b a - 1 5 與酶 分子之間的較弱相互作用，實(shí)現(xiàn)了酶的固定化，考察了不同幾何微環(huán) 境和化學(xué)徼環(huán)境s b a - 1 5 對(duì)豬胰脂肪酶( p p l ) 擴(kuò)散吸附的影響，以 及化學(xué)微環(huán)境對(duì)固定化酶性能的影響。 利用水熱合成法合成s b a - 1 5 ，除采用加入擴(kuò)孔劑t m b 方法，又 提出了通過調(diào)變晶化溫度來實(shí)現(xiàn)s b a 1 5 孔徑的調(diào)變，在1 0 0 。c 1 4 0 c 晶化溫度范圍可以合成孔徑為6 n m 至1 1 0 r i m 的s b a - 1 5 ，調(diào)變晶化溫度 法合成的s b a 1 5 的有序度和均一度明顯高于通過加入t m b 法合成的 s b a o l 5 。利用原位合成法將二甲基或二異丙基基團(tuán)引入到介孔材料 的孔道中，產(chǎn)物s b a - 1 5 具有良好的介孔有序結(jié)構(gòu)，表面含有烷基具 有疏水性質(zhì)。 研究了以不同孔徑和不同表面性質(zhì)的s b a 1 5 載體上p p l 的擴(kuò)散 吸附行為，并用三種常見的動(dòng)力學(xué)模型：準(zhǔn)一級(jí)、準(zhǔn)二級(jí)和粒內(nèi)擴(kuò) 散模型對(duì)吸附動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合，發(fā)現(xiàn)準(zhǔn)一級(jí)動(dòng)力學(xué)模型不符合， 粒內(nèi)擴(kuò)散模型部分符合，準(zhǔn)二級(jí)動(dòng)力學(xué)模型很符合s b a - 1 5 吸附p p l 過程，由二級(jí)動(dòng)力學(xué)常數(shù)計(jì)算出的的吸附階段的活化能表明p p l 在 s b a - 1 5 中擴(kuò)散吸附過程屬于物理吸附過程。進(jìn)一步對(duì)p p l 在s b a - 1 5 孔道中擴(kuò)散吸附過程進(jìn)行研究，采用蛋白質(zhì)在圓柱形孔道中的限制 北京化工大學(xué)碩士學(xué)位論文 性擴(kuò)散方吸附方程對(duì)動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合，得出p p l 在孔徑較小或 者在烷基改性的s b a - 1 5 固定化過程主要由擴(kuò)散控制，隨著孔徑的增 大擴(kuò)散作用減弱，p p l 在s b a 1 5 內(nèi)表面的吸附作用越來越明顯。 改性后的s b a 1 5 與未改性的s b a 1 5 固定化酶進(jìn)行對(duì)比，固定 化效率和催化性能更優(yōu)。固定化酶與游離酶相比，固定化酶的最適溫 度、p h 穩(wěn)定性、熱穩(wěn)定性和儲(chǔ)藏穩(wěn)定性與載體的微環(huán)境有很大的關(guān) 系。 關(guān)鍵詞：s b a 1 5 ，酶，表面性質(zhì)，微環(huán)境，內(nèi)擴(kuò)散，穩(wěn)定性 i l 摘要 i m m o b i l i z e dp r o c e s sa n ds t a b i l i t yo fp p l a s s e m b l e do ns b a 1 5m e s o p o r o u sm 睛t e r i a l s ： e f f e c t so fp h y s i c a la n dc h e m i c a l m i c r o e n v i r o n m e n t a b s t r a c t s b a o l 5 ，a st h eh i g hs u r f a c ea r e a , l a r g ep o r e sa n da b u n d a n th y d r o x y l g r o u p so nt h es u r f a c eo fm e s o p o r o u sm a t e r i a l ，i su s e da st h es u p p o r tf o r i m m o b i l i z a t i o no fp o r c i n ep a n c r e a t i c l i p a s e ( p p l ) t h i sd i s s e r t a t i o n f o c u s e so nt h ee f f e c to fm i c r o - e n v i r o n m e n to nt h ei m m o b i l i z i n gp r o c e s s a n ds t a b i l i t yo f p p la s s e m b l e do ns b a - 1 5m e s o p o r o u sm a t e r i a l h i 曲l y o r d e r e dh e x a g o n a lm e s o p o r o u sm a t e r i a ls b a - 1 5w i t h d i f f e r e n tp o r es i z e sw a sp r e p a r e dv i at w om e t h o d s ：u n d e rd i f f e r e n t c r y s t a l l i z a t i o nt e m p e r a t u r e ss y n t h e s i sa n db yt h ea d d i t i o no fc o = s o l v e n t o r g a n i cm o l e c u l e s1 ，3 ，5 - t r i m e t h y l b e n z e n e ( t m b ) ，u s i n gn o n i o n i c t r i b l o c kp 1 2 3a st e m p l a t e i tw a sf o u n dt h a ts b a 1 5h a dm o r eo r d e r e d h e x a g o n a lp o r e su n d e rd i f f e r e n tc r y s t a l l i z a t i o nt e m p e r a t u r et h a na d d i n g t m bt oe x p a n dt h ep o r es i z e so ft h es b a - 1 5 t w of u n c t i o n a l i z e d i l l 北京化工大學(xué)碩士學(xué)位論文 s b a - 1 5 - t y p em o l e c u l a rs i e v e sw i t hd i m e t h o x ys i l a n e ( d 峋，d i i s o p r o p y l d i m e t h o x ys i l a n e ( d i p ) ，r e s p e c t i v e l y , w e r ep r e p a r e db ys i l o x y p r o p a n e t e t h e r st ot h es i l i c e o u ss u r f a c eo fs b a - 1 5v i ai ns i t us y n t h e s i s ，w h i c ht h e s i l i c e o u ss u r f a c eo fs b a - 15h a v eb e e na l k y l i z e dw i t hd i f f e r e n td e g r e e h y d r o p h o b i c i t y p o r c i n ep a n c r e a t i cl i p a s e ( p p l ) h a sb e e ns u c c e s s f u l l yi m m o b i l i z e d i nt h em e s o p o r o u sc h a n n e l so fs b a - 1 5w i t hd i f f e r e n tp o r es i z ea n d d i f f e r e n ts u r f a c ec h a r a c t e r s 。t h r e ek i n e t i cm o d e l sv i z t h ep s e u d o f i r s t o r d e r , t h ep s e u d o s e c o n do r d e ra n dt h ei n t r a p a r t i c l ed i f f u s i o nm o d e l s w e r eu s e dt os i m u l a t et h ee x p e r i m e n t a ld a t a i tw a sf o u n dt h a tt h e p s e u d o - f i r s to r d e rk i n e t i cm o d e l c a nn o tb eu s e dt ot h ea d s o r p t i o np r o c e s s t h ep s e u d o s e c o n do r d e rk i n e t i cm o d e lc o u l db eu s e dt od e s c r i b et h e a d s o r p t i o np r o c e s s m o s ts a t i s f a c t o r i l y t h ei n t r a p a r t i cd i f f u s i o nw a s p r e s e n t ，b u tn o tt h eo n l yr a t e c o n t r o l l i n gs t e p i n o r d e rt os t u d yt h e h i n d e r e dd i f f u s i o n ，ac o n t i n u i t ye q u a t i o nf o rap r o t e i ni nc y l i n d r i c a lp o r e w a sa d o p t e d t h es m a l l e rp o r ed i a m e t e ro ra l k a n ef u n c t i o n a l i z e di n n e r s u r f a c eo f t h es b a 一1 5a sh o s t sf o re n z y m ei m m o b i l i z a t i o nh a ss i g n i f i c a n t e f f e c t so nt h ei n t e r n a ld i f l u s i o n d i f f u s i o nf u n c t i o nw e a k e n e dw h i l et h e a d s o r p t i o ne f f e c t so f p p l o ni n n e rs u r f a c eb e c a m e m o r ea n dm o r ed i s t i n c t c o m b i n e dw i t ht h ee n l a r g i n gp o r ed i a m e t e r s c o m p a r i n g w i t h p u r e l y s i l i c e o u ss b a 一15 ，t h ef u n c t i o n a l i z e d s b a - 1 5h a sm o r ee f f i c i e n c yi nt h ee n z y m ei m m o b i l i z a t i o n t h e i v 荷蔓 c h a r a c t e r so ft h ei m m o b i l i z e de n z y m ew e r ea l s os t u d i e da n dc o m p a r e d w i n l 丘e ee n z y m e t h er e s u l t ss h o wt h a tt h eo p t i m u m t e m p e r a t u r eo f p p l i si n c r e a s e da f t e ri m m o b i l i z a t i o n ；a n dt h es t a b i l i t i e so ft h ei m m o b i l i z e d 既z y i t l e o fp hv a l u ew e r el o w e rt h a nf r e ee r l z y n l e ，h o w e v e r , t h e t h e r m o s t a b i l i t ya n ds t o r e d s t a b i l i t yw e r eo b v i o u s l yh i g h e r k e y w o r d s ：s b a - 1 5 ，l i p a s e ，s u r f a c ep r o p e r t y ，m i c r o e n v i r o n m e n t , v 北京化工大學(xué)碩士學(xué)位論文 符號(hào)說明 p p l 初始濃度，m g l - 。 s b a 1 5 孔道中p p l 的濃度，m g l - 1 溶液中p p l 的平衡濃度，m g l - 1 f 時(shí)刻p p l 濃度，m g l - 1 p p l 在液相中的擴(kuò)散系數(shù)，i n 2 f 1 有效傳質(zhì)系數(shù)，m 2 s - 1 活化能，k j m o t f r e u n d l i c h 常數(shù) l a n g m u i r 吸附等溫線常數(shù)，l m o t l p p l 分子半徑，i l m 溶液體積，l 溫度，k p p l 分子長(zhǎng)軸長(zhǎng)度，h i l l p p l 分子短軸長(zhǎng)度，n l l l 準(zhǔn)一級(jí)動(dòng)力學(xué)常數(shù)，m i n - 1 準(zhǔn)二級(jí)速率常數(shù)，g m g - 1 m i n - 1 吸附速率因子，l t o o l - 1 m i n - 1 玻爾茲曼常數(shù)，j k 1 脫附速率因子，m i n - 1 粒內(nèi)擴(kuò)散速率常數(shù)，n a g g - 1 m i n - o 5 f r e u n d l i c h 等溫方程中非線性系數(shù) s b a - 1 5 的用量，g s b a - 1 5 的平衡吸附量，m g g - 1 s b a 一1 5 的最大吸附量，n a g g - 1 t 時(shí)刻的吸附量，m g - g - 1 s b a 1 5 孔道長(zhǎng)度，m p p l 溶液粘度，g - e r a - i , s - 1 p p l 分子直徑與孔徑之比 v i q c e q d乜e砟r礦r 口6皇如匕如k t 野 m 吼吼= 聲z 北京化工大學(xué)位論文原創(chuàng)性聲明 本人鄭重聲明：所呈交的學(xué)位論文，是本人在導(dǎo)師的指導(dǎo)下， 獨(dú)立進(jìn)行研究工作所取得的成果。除文中已經(jīng)注明引用的內(nèi)容外，本 論文不含任何其他個(gè)人或集體已經(jīng)發(fā)表或撰寫過的作品成果。對(duì)本文 的研究做出重要貢獻(xiàn)的個(gè)人和集體，均已在文中以明確方式標(biāo)明。本 人完全意識(shí)到本聲明的法律結(jié)果由本人承擔(dān)。 作者簽名： 基塑 日期： 迎乙：! i 關(guān)于論文使用授權(quán)的說明 學(xué)位論文作者完全了解北京化工大學(xué)有關(guān)保留和使用學(xué)位論文 的規(guī)定，即：研究生在校攻讀學(xué)位期間論文工作的知識(shí)產(chǎn)權(quán)單位屬北 京化工大學(xué)。學(xué)校有權(quán)保留并向國(guó)家有關(guān)部門或機(jī)構(gòu)送交論文的復(fù)印 件和磁盤，允許學(xué)位論文被查閱和借閱；學(xué)?？梢怨紝W(xué)位論文的全 部或部分內(nèi)容，可以允許采用影印、縮印或其它復(fù)制手段保存、匯編 學(xué)位論文。 非保密論文注釋：本學(xué)位論文不屬于保密范圍，適用本授權(quán)書。 作者簽名：雌坦日期： 蘭塑z ： ! f f 導(dǎo)師簽名： 第一章緒論 1 1 酶的概述 第一章緒論 酶是生物為提高其生化反應(yīng)效率而產(chǎn)生的生物催化劑，其化學(xué)本質(zhì)為蛋白 質(zhì)，少數(shù)酶同時(shí)含有少量的糖和脂肪。在生物體內(nèi)，所有的反應(yīng)均在酶的催化作 用下完成，幾乎所有生物的生物現(xiàn)象都與酶的作用緊密聯(lián)系 1 1 1 酶結(jié)構(gòu)特點(diǎn) 酶蛋白是由2 0 種氨基酸殘基組成的生物大分子【”。2 0 種氨基酸結(jié)構(gòu)類似， 均為l 噸氨基酸，其中僅甘氨酸為非手性氨基酸。氨基酸間通過脫水形成酰胺鍵， 在蛋白質(zhì)化學(xué)中又稱肽鍵。肽鍵將氨基酸連接形成長(zhǎng)鏈聚合物稱為多肽鏈，鏈中 的氨基酸稱為殘基。酶蛋白可以是單鏈，也可以是由幾條鏈組成的寡聚體。酶蛋 白一般為球狀蛋白。 酶蛋白的一級(jí)結(jié)構(gòu)：不同的蛋白質(zhì)具有不同的氨基酸組成和排列順序蛋白 質(zhì)多肽鏈中氨基酸殘基的組成和排列順序稱為蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)。許多酶蛋白的 一級(jí)結(jié)構(gòu)已經(jīng)確定，組成酶蛋白的多肽鏈一般由1 0 0 8 0 0 個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成。 酶蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)：酶的二級(jí)結(jié)構(gòu)單位主要是a 螺旋、p 折迭片、p - 轉(zhuǎn)角和 無規(guī)則卷曲四種。酶蛋白在一級(jí)結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上進(jìn)一步盤旋折迭，又以一定規(guī)則的 氫鍵形成甜螺旋、b 折迭層、p 轉(zhuǎn)角和自由遇轉(zhuǎn)等二級(jí)結(jié)構(gòu)。氫鍵是維持二級(jí)結(jié) 構(gòu)穩(wěn)定的主要作用力。 酶蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)：這些二級(jí)結(jié)構(gòu)單元迸一步盤曲折迭，形成球狀分子，即 三級(jí)結(jié)構(gòu)。穩(wěn)定酶蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)的主要作用力有氫鍵、鹽鍵、疏水鍵、二硫鍵 等，酶蛋白中每條完整的肽鏈被稱為亞基。 酶蛋白的四級(jí)結(jié)構(gòu)：如果酶蛋白有四級(jí)結(jié)構(gòu)，則必具有二條或更多條肽鏈。 現(xiàn)有已知的酶，除少數(shù)單體酶外，大多數(shù)酶是由多個(gè)亞基組成的寡聚體球狀分 子表面以疏水作用力、范德華力、鹽鍵及氫鍵等非共價(jià)鍵互相聯(lián)結(jié)起來，而成為 完整的酶分子。 酶的活性中心：酶的活性中心是指酶蛋白分子中與催化有關(guān)的特定區(qū)域，它 能與底物結(jié)合并發(fā)揮催化作用。酶的活性中心一般位于酶分子的表面，具有特定 的空間結(jié)構(gòu)，其中包括底物結(jié)合部位和催化部位活性中心的空間結(jié)構(gòu)是由整個(gè) 酶蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)所決定的，破壞了酶蛋白的整個(gè)結(jié)構(gòu)，必然破壞酶的活性中心，從 而使酶喪失催化活性。因此酶蛋白活性中心以外的其余部分不僅有維持結(jié)構(gòu)的作 北京化工大學(xué)碩士學(xué)位論文 用，同時(shí)還有保護(hù)微環(huán)境的作用。酶分子的親水性強(qiáng)弱，整個(gè)分子的電性、電荷 分布，以及活性中心周圍的環(huán)境都由整個(gè)酶蛋白的結(jié)構(gòu)決定，這對(duì)于酶的催化特 性具有重要意義。酶活性中心的一些化學(xué)基團(tuán)是酶發(fā)揮催化作用所必需的基團(tuán)， 故稱為必需基團(tuán)。對(duì)于單體酶而言，一個(gè)分子中只有一個(gè)活性部位：含輔基的酶， 輔基分子常常結(jié)合在這一區(qū)域，參與構(gòu)成活性部位的一部分。 酶構(gòu)象的柔順性：酶構(gòu)象的柔順性是指酶在溶液中具有較為柔順的結(jié)構(gòu)，能 以多種構(gòu)象狀態(tài)存在，在底物誘導(dǎo)下，構(gòu)象改變?yōu)檫m宜于結(jié)合底物的狀態(tài)。酶在 結(jié)晶狀態(tài)時(shí)具有較大的剛性，但是有一些酶在晶狀時(shí)也表現(xiàn)緩慢的催化活性。 1 1 2 酶催化特性 由于酶在常溫常壓的溫和條件下具有高效的催化作用，并具有很高的專一 性，許多難以進(jìn)行的有機(jī)化學(xué)反應(yīng)在酶催化下都能順利進(jìn)行，且可以避免或減少 副反應(yīng)，因而酶在工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)實(shí)踐中蘊(yùn)藏著巨大的潛力。世界范圍內(nèi)，每年食品、 去垢劑、精細(xì)化工和診斷用酶的銷售額達(dá)七億美元，以酶為催化劑的新工業(yè)過程 數(shù)量和酶的市場(chǎng)需求量將持續(xù)增加。 作為生物催化劑的酶，它具有與一般無機(jī)物或低分子有機(jī)催化劑的共性：降 低反應(yīng)的活化能，加快反應(yīng)速率，不改變反應(yīng)的方向和化學(xué)平衡關(guān)系，反應(yīng)結(jié)束 時(shí)本身不消耗。但除此之外，酶作為生物催化劑還具有以下特性 2 1 ：( 1 ) 有較高 的催化效率；( 2 ) 很強(qiáng)的催化專一性；( 3 ) 具有溫和的反應(yīng)條件；( 4 ) 酶催化是可 調(diào)控的：如抑制劑調(diào)節(jié)、共價(jià)修飾調(diào)節(jié)、回饋調(diào)節(jié)、酶原啟動(dòng)及激素控制等。 1 1 ，3 酶催化反應(yīng)機(jī)制 酶催化反應(yīng)的機(jī)制有兩種學(xué)說口】，最早提出的是鎖鑰學(xué)說，在此基礎(chǔ)上發(fā)展 了誘導(dǎo)學(xué)說。 ( 1 ) 鎖鑰學(xué)說：酶發(fā)生催化作用首先必須與底物接近，酶與底物形狀互補(bǔ)， 然后通過兩者間相互作用，形成各種非共價(jià)鍵或共價(jià)鍵，組成酶與底物的復(fù)合物。 酶和底物間的嚴(yán)格互補(bǔ)關(guān)系被比喻為鎖與鑰匙的關(guān)系，稱為鎖鑰學(xué)說( 見圖1 1 ) 。 但是還有一些問題是這些學(xué)說所不能解釋的：如果酶的活性中心是“鎖與鑰匙學(xué) 說”中的鎖，那么，這種結(jié)構(gòu)不可能既適合于可逆反應(yīng)的底物，又適合于可逆反 應(yīng)的產(chǎn)物。麗且，也不能解釋酶的專一性中的所有現(xiàn)象。 ( 2 ) 誘導(dǎo)學(xué)說：現(xiàn)代科學(xué)研究發(fā)現(xiàn)酶與底物結(jié)合時(shí)，伴隨著酶分子構(gòu)象的改 變，使酶分子中起催化作用的氨基酸殘基處于適當(dāng)?shù)奈恢茫瑯拥孜锓肿拥臉?gòu)象 也發(fā)生相應(yīng)的變化。因此，k o s h l a n d 提出酶分子與底物分子結(jié)合時(shí)是一個(gè)動(dòng)態(tài)的 誘導(dǎo)楔合過程，各自構(gòu)象的改變有利于酶與底物的結(jié)合，有利于酶發(fā)生催化作用， 2 第一章緒論 這種學(xué)說被稱為誘導(dǎo)學(xué)說( 見圖1 - 2 ) 。事實(shí)上通過旋光測(cè)定，了解到許多酶在它 們的催化循環(huán)中確有構(gòu)象的變化，特別是x 射線衍射分析發(fā)現(xiàn)未結(jié)合底物的自 由羧肽酶與結(jié)合了甘氨酰酪氨酸底物的羧肽酶，在構(gòu)象上有很大的區(qū)別；溶菌酶 的x 射線衍射分析了也得到類似的結(jié)果，這些都是支持“誘導(dǎo)學(xué)說”假說的有力 證明。 圖i - 1 酶與底物的“鎖與鑰匙關(guān)系” 學(xué)說示意圈 f i 驢他1 - 1s c h e m a t i ci l l u s c s t m f i o no f k e y - l o c k h y p o m 醯 1 1 4 脂肪酶概述 圖i 2 酶與底物的“誘導(dǎo)楔合” 假說示意圖 l 嗨u r e1 - 2s c h e m a t i ci l l u s e s w 商o no f i n d u c e d - w e d g eh y p o t h e s i s 酶的種類很多，根據(jù)酶催化的反應(yīng)類型，1 9 6 1 年國(guó)際生物化學(xué)聯(lián)合會(huì)酶學(xué) 委員會(huì)將酶分為六大類：氧化還原酶( o x i d o r e d u c t a s c , e c1 x 置x ) ，轉(zhuǎn)移酶 ( u 鋤s f e r a s e ，e c2 x x x ) ，水解酶( h y d r o l a s e ，e c3 x 蔗x ) ，裂合酶( 1 y a s e ，e c4 x x x ) ， 異構(gòu)酶( i s o m 船a s e ，e c5 x ?！? 【) 和連接酶0 i g a s e ，e c6 x x a ) 在眾多的酶中，氧化還原酶、水解酶在光學(xué)活性藥物合成中的應(yīng)用尤其突出。 脂肪酶是水解酶，在生物催化反應(yīng)中，有3 0 以上的研究涉及到脂肪酶卜7 1 ，這 類酶在手性技術(shù)中正發(fā)揮著越來越重要的作用。由于酶催化反應(yīng)的高效性、高立 體選擇性及溫和的反應(yīng)條件使得酶催化拆分法可用于某些用一般方法難以拆分 的手性化合物。以脂肪酶為手性拆分催化劑，具有價(jià)格低廉、不需輔酶、拆分反 應(yīng)操作簡(jiǎn)便、拆分效率和立體選擇性高等特點(diǎn)，已成功地用于光學(xué)活性藥物及其 合成子的制備。所以在本論文的研究中，首先選擇了脂肪酶作為研究對(duì)象 1 1 4 1 脂肪酶結(jié)構(gòu)特點(diǎn) 大多數(shù)脂肪酶是單體酶，它們通常由一條肽鏈組成，一般不需要輔因子盡 管各種不同來源的脂肪酶在結(jié)構(gòu)上有不同特點(diǎn)，但基本結(jié)構(gòu)及活性中心結(jié)構(gòu)是相 似的嘲 3 p 穆 北京化工大學(xué)碩士學(xué)位論文 o 氨基酸 圖1 3 氨基酸的結(jié)構(gòu) f i g u r e1 - 3c o n f i g u r a t i o no f a m i n oa c i d 不變部分 可變部分 組成脂肪酶的2 0 種基本氨基酸分別是甘氨酸( g l y c i n e ) 、丙氨酸( a l a n i n e ) 、 纈氨酸( i n e ) 、亮氨酸( l e u c i n e ) 、異亮氨酸( u e u c i n e ) 、脯氨酸( p r o l i n c ) 、 甲硫氨酸( m e t h i o n i n e ) 、半胱氨酸( c y s t e i n e ) 、苯丙氨酸( p h e n y l a l a n i n e ) 、酪 氨酸( t y r o s i n e ) 、色氨酸( t r y t o p h a n ) 、精氨酸( a r g i n i n e ) 、賴氨酸( l y s i n e ) 、 組氨酸( h i s t i d i n e ) 、天冬氨酸( a s p a r t a t e ) 、谷氨酸( g l u t a m a t e ) 、絲氨酸( s e r i n e ) 、 蘇氨酸( t h r e o n i n e ) 、天冬酰胺 ( a s p a r a g i n e ) 、谷酰胺( g l u t a m i n e ) ，除甘氨 酸和脯氨酸外，其它均具有一樣的結(jié)構(gòu)通式( 圖1 3 ) 。 1 1 4 2 脂肪酶界面活化原理 脂肪酶的特點(diǎn)是在不溶性的硫水底物反應(yīng)中活性比較高，這一特點(diǎn)對(duì)發(fā)生在 含不溶性底物和水相界面上的反應(yīng)機(jī)理具有至關(guān)重要的作用。脂肪酶被它的非極 性底物活化，這一現(xiàn)象稱作脂肪酶的界面活化 9 - 。 脂肪酶的界面活化現(xiàn)象是1 9 3 6 年由h o l w e r d a 等最早觀察到的，接著在1 9 4 5 年s c h o n j a e y d e r 和v o l q v a r t z 也發(fā)現(xiàn)了這一現(xiàn)象。多年來人們一直在討論關(guān)于界面活 化的基本結(jié)構(gòu)背景。d e s n u e l l e 等推測(cè)脂肪酶分子吸附在界面以后發(fā)生了構(gòu)象變 化。b r o c k e r h o f 瘌j a n s c n 則提出了所謂的底物理論，這一理論強(qiáng)調(diào)了油水界面上 底物的狀態(tài)和濃度的重要作用。1 9 9 0 年，兩種脂肪酶的三維結(jié)構(gòu)被首次描述，確 認(rèn)了早期理論的合理性，從而解釋了脂肪酶的界面活化現(xiàn)象。如人胰脂肪酶 ( 玨 l ) 的表面有一個(gè)螺旋結(jié)構(gòu)，也就是通常所說的蓋子覆蓋了酶的活性中心， 使得活性中心無法暴露于溶劑中，而這個(gè)螺旋結(jié)構(gòu)只有在油水界面才會(huì)發(fā)生構(gòu) 象變化。后來脂肪酶結(jié)構(gòu)的進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，除了個(gè)別的幾種脂肪酶，其它所有 為人知的脂肪酶都有一個(gè)螺旋結(jié)構(gòu)的多肽區(qū)域覆蓋在酶分子的活性中心。這個(gè)區(qū) 域被稱為“蓋子”( “l(fā) i d ) 。蓋子上有一個(gè)色氨酸殘基的側(cè)鏈插入活性部位，此蓋 子是雙親性的，內(nèi)表面由于存在色氨酸而體現(xiàn)為疏水性，能和活性中心周圍的疏 水性殘基相互作用，蓋子暴露在外的部分則是親水性的，通過氫鍵與外面的一些 水分子發(fā)生作用。只有當(dāng)脂肪酶接觸到水油界面時(shí)，這個(gè)短的0 【螺旋片斷( 蓋 子) 才會(huì)折回，此蓋子向后翻卷進(jìn)入一個(gè)親水性的溝，暴露出酶的活性中心和蓋 子的疏水性表面，產(chǎn)生了一個(gè)大的疏水性區(qū)域，這時(shí)的酶處于活化狀態(tài)，對(duì)底物 4 第一章緒論 進(jìn)行催化反應(yīng)。當(dāng)缺少這樣的界面時(shí)，酶的活性部位被蓋子保護(hù)起來，阻止了底 物同酶催化活性中心的接觸。因此對(duì)于脂肪酶的水解反應(yīng)，水油界面的形成是 關(guān)鍵。g r o c h u l s k i 等發(fā)現(xiàn)c r u g o s a 脂肪酶在低的離子強(qiáng)度的溶劑中，酶分子的空 間構(gòu)象以開放的形式存在。脂肪酶對(duì)水溶性的底物表現(xiàn)出比較低的酶活力，因?yàn)?這時(shí)蓋子蓋住了他們的活性中心。當(dāng)水不溶性底物與脂肪酶分子接觸時(shí)，酶分子 發(fā)生了構(gòu)象變化，在這種作用的誘導(dǎo)下，蓋子不再覆蓋在活性中心處，脂肪酶呈 現(xiàn)一種半敞開的結(jié)構(gòu)( o p e ns t a t u t e - e ) ，從而使得底物更易接近催化中心，發(fā)生 界面活化作用，酶活性提高 但自從發(fā)現(xiàn)假單胞菌脂肪酶( p s c u d o m o n a s a c r u g i n o s a ) 雖然有螺旋結(jié)構(gòu)的蓋 子，卻不會(huì)發(fā)生界面活化，人們意識(shí)到賽面活化遠(yuǎn)比想象的復(fù)雜。此弗，葡萄狀 球菌脂肪酶( s t a p h y l o c o c c u s 螄c u s ) 也只對(duì)一部份不溶性底物活化。目前，關(guān) 于界面活化機(jī)理還在進(jìn)一步研究中 圖l 一4 脂肪酶的界面活化示意圖 r i 弘r e1 - 4o p e na n dc l o s e d n f o r m a t i o n so f t h el i p m 1 1 4 3 脂肪酶的應(yīng)用 脂肪酶原指甘油酯水解酶。以其來源廣、催化功能多以及催化底物廣泛( 酯、 酸、醇、酸酐、酰胺等都可以成為它的底物) 的優(yōu)勢(shì)使其成為生物技術(shù)及有機(jī)合 成方面應(yīng)用最廣泛的一類酶，廣泛應(yīng)用于油脂、食品、香料、化妝品、醫(yī)藥、農(nóng) 藥等有機(jī)合成領(lǐng)域中 ( 1 ) 水解反應(yīng)【1 7 】 北京化工大學(xué)碩士學(xué)位論文 水解反應(yīng)是指脂肪酶催化脂肪或酯水解為其組分脂肪酸和甘油或醇。利用脂 肪酶水解油脂的能力可獲得重要的輕化工原料脂肪酸和甘油。用于這種目的的脂 肪酶包括來自c a n d i d am g o s a ，p s e u d o m o n a s hu o r e s c en 和蓖麻種子( c a s t o rb e a n ) 等的脂肪酶。水解的底物包括各種植物油如大豆油、蓖麻油、橄欖油等和動(dòng)物油 如牛脂、羊脂和魚油及其酯類。如由蓖麻油( c a s t o ro i l ) 水解生產(chǎn)蓖麻酸，由于脫 水、內(nèi)酯化等副反應(yīng)它不能用傳統(tǒng)的蒸氣裂解方法由蓖麻油生產(chǎn)，用來自蓖麻種 子的脂肪酶水解蓖麻油，則可避免這些弊端，該工藝已實(shí)現(xiàn)商業(yè)化生產(chǎn)。除墨組 分中加入2 0 0 u 的p s e u d o m o n 船脂肪酶可使油脂水解，紙的白度從5 6 提高到5 8 。 ( 2 ) 合成反應(yīng) 目前，關(guān)于脂肪酶的催化合成反應(yīng)方面的應(yīng)用的注意力主要集中在不對(duì)稱合 成和酯交換。 不對(duì)稱合成是綠色化學(xué)的重要組成部分【博1 。目前，用于拆分外消旋化合物 的酶多數(shù)是水解酶，而且絕大多數(shù)為脂肪酶。手性化合物在人們生活中具有重要 作用，目前絕大多數(shù)化學(xué)合成藥物都是以外消旋混合物形式生產(chǎn)銷售。實(shí)際上， 其藥物作用包括酶的抑制、膜的傳遞、受體結(jié)合等，均和藥物的立體構(gòu)型有關(guān)。 此外，只含單一對(duì)映體的各類手性物質(zhì)勢(shì)必極大地減少其對(duì)環(huán)境的污染，這也是 環(huán)保方面所提出的重要課題。因此，光學(xué)活性化合物的制備已成為眾人注目的焦 點(diǎn)，世界各國(guó)許多著名大學(xué)和研究機(jī)構(gòu)紛紛致力于該領(lǐng)域的研究。與傳統(tǒng)的化學(xué) 方法相比，酶催化拆分外消旋化合物具有反應(yīng)條件溫和、節(jié)省能源、專一往強(qiáng)、 副反應(yīng)少、產(chǎn)品純度高、反應(yīng)步驟簡(jiǎn)單、不需手性源、產(chǎn)品成本低等優(yōu)點(diǎn)。與微 生物法相比，酶法反應(yīng)時(shí)間短、條件易控制、產(chǎn)品純度高。隨著非水分質(zhì)酶學(xué)的 發(fā)展，為解決外消旋化合物的拆分，特別是外消旋醇的拆分這一難題帶來了希望。 o l i v e r 等用假絲酵母脂肪酶( c a n d i d a a n t a r c t i c a ) 手性合成了( s ) d a p o x e t i n e ，產(chǎn)率近 1 0 0 。 利用l ，3 一定向脂肪酶催化油脂進(jìn)行定向酯交換的特性，有實(shí)際意義的應(yīng)用是 利用廉價(jià)油脂經(jīng)過改性而生產(chǎn)珍貴油脂，目前在油脂工業(yè)上研究最多也最有研究 價(jià)值的類可可脂和生物柴油的生產(chǎn)。近年來，隨著石油資源的逐漸枯竭和公眾環(huán) 保意識(shí)的增強(qiáng)，可再生的綠色環(huán)保型燃料一生物柴油，受到了許多國(guó)家的重視。 生物柴油，即動(dòng)植物油脂與低碳醇進(jìn)行醋交換反應(yīng)所生成的脂肪酸低碳醇醋，具 有良好的燃料特性、含硫量低，可替代礦物柴油作為內(nèi)燃機(jī)的燃料。生物柴油主 要是在催化劑作用下通過醋交換反應(yīng)來制備。反應(yīng)使用的催化劑可以是酸、堿或 酶。相較酸堿催化劑，酶法合成生物柴油具有反應(yīng)條件溫和、醇用量小、后處理 簡(jiǎn)單、無污染物排放等優(yōu)點(diǎn)，而且原料油中的自由脂肪酸能完全轉(zhuǎn)化成甲醋。尤 6 第一章緒論 其是采用固定化酶，反應(yīng)結(jié)束后酶易回收，可多次循環(huán)利用，大大降低了生產(chǎn)成 本，顯示出良好的應(yīng)用前景n o u r e d d i n 等用溶膠凝膠固定化假單胞菌脂肪酶 ( p s c u d o m o n a sc , e p a e i a ) 將大豆油改性為生物柴油，l 小時(shí)可得6 7 的產(chǎn)率 1 1 5 酶制劑中存在的問題 酶的催化優(yōu)點(diǎn)大大促進(jìn)了人們對(duì)酶技術(shù)的研究和開發(fā)，使酶在各個(gè)領(lǐng)域中的 應(yīng)用越來越廣但是，由于酶是生物體根據(jù)自身需要而產(chǎn)生的，它們?cè)趯?shí)際應(yīng)用 中還有很大限制。其原因有1 1 ，7 ：( 1 ) 由于有些酶的提取純化繁瑣，所以它們的價(jià) 格十分昂貴；( 2 ) 反應(yīng)后的酶無法回收再利用，只能采取分批法生產(chǎn)手段，不能 實(shí)現(xiàn)連續(xù)化操作，且由于產(chǎn)物中酶的殘留，造成提純工藝復(fù)雜，降低了產(chǎn)品的性 能：( 3 ) 大量的氧化還原酶、轉(zhuǎn)氨酶等需要等計(jì)量反應(yīng)物的輔因子存在才能表現(xiàn) 催化活性，從而限制了它們?cè)谠S多有機(jī)合成反應(yīng)中的應(yīng)用；( 4 ) 酶通常在水溶液 中實(shí)施其催化活性，對(duì)于大多數(shù)有機(jī)化學(xué)反應(yīng)來說，使用的溶劑是非水溶性的有 機(jī)溶劑；( 5 ) 酶對(duì)環(huán)境極敏感，易變性與失活。體現(xiàn)在 缸在催化反應(yīng)過程中，游離酶是水溶性的催化劑，容易發(fā)生微生物的降解 或聚集而失活； b 酶的穩(wěn)定性一般較差，極端的p h 值、較高的溫度和高鹽濃度的反應(yīng)體系 都可能使酶鈍化，失去部分甚至大部分催化活性，有些酶即使在較合適 的條件下使用，也會(huì)很快失去活性； c 酶的化學(xué)本質(zhì)是蛋白質(zhì)，因而具有蛋白質(zhì)的所有性質(zhì)。其中容易變性的 性質(zhì)，使得酶在應(yīng)用時(shí)，常因變性而活力下降，甚至完全失去活力，即 失活。酶的變性多數(shù)為不可逆。引起交性的原因有物理因素及化學(xué)因素。 物理因素包括熱、紫外線、x 射線、聲波等；化學(xué)因素包括酸、堿、表 面活性劑、重金屬鹽等化學(xué)藥品的影響。因而產(chǎn)生了諸如熱變性、酸堿 變性、氧化變性等。引起酶的構(gòu)象改變，而降低或失去活性。 所以目前盡管已發(fā)現(xiàn)了上千種酶，但真正在工業(yè)生產(chǎn)上能夠得到實(shí)際應(yīng)用的 不足1 0 0 種。 怎樣才能獲得理想的生物催化荊? 如果能設(shè)計(jì)一種方法，將酶束縛于特殊的 相，使它與整體相( 或整體液體) 分隔開，但仍能進(jìn)行底物和效應(yīng)物( 啟動(dòng)劑或 抑制劑) 的分子交換。這種固定化的酶可以像一般化學(xué)反應(yīng)的固定化催化劑一樣， 既具有酶的催化物性，又具有一般化學(xué)催化劑能回收、反復(fù)使用等優(yōu)點(diǎn)，并且生 產(chǎn)工藝可以連續(xù)化、自動(dòng)化。2 0 世紀(jì)5 0 年代發(fā)展起來的固定化技術(shù)正是基于這 一目的發(fā)展起來的。 7 北京化工大學(xué)碩士學(xué)位論文 1 2 固定化酶概述 酶作為一種生物催化劑，一經(jīng)發(fā)現(xiàn)就被人們廣泛應(yīng)用于在釀造、食品、醫(yī)藥 等領(lǐng)域。由于酶可以在常溫、常壓等溫和條件下高效地催化反應(yīng)，一些難以進(jìn)行 的化學(xué)反應(yīng)在酶的催化下能順利地完成。酶的開發(fā)利用在2 0 世紀(jì)初得到了巨大的 發(fā)展，但由于酶的穩(wěn)定性低，使用后難以回收，在實(shí)際應(yīng)用中也就帶來了很多問 題，從而限制了酶制劑產(chǎn)品的使用和開發(fā)。1 9 1 6 年n e l s o n 和g r i f m 2 0 1 發(fā)現(xiàn)了酶的 固定化現(xiàn)象后，科學(xué)家就開始了固定化酶的研究工作。1 9 6 9 年【2 l 】日本一家制藥 公司第一次將固定化的酞化氨基酸水解酶用來從混合氨基酸中生產(chǎn)l 一氨基酸，開 辟了固定化酶工業(yè)化應(yīng)用的新紀(jì)元。 1 2 1 固定化酶概念 固定化酶最初是將水溶性酶與不溶性載體結(jié)合起來，成為不溶于水的酶的衍 生物，所以曾叫過“水不溶酶”( w a t e r i n s o l u b l ee n z y m e ) 和“固相酶”( s o l i d p h a s e e n z y i i l e ) 。但是后來發(fā)現(xiàn)，也可以將酶包埋在凝膠內(nèi)或置于超濾裝置中，高分子 底物與酶在超濾膜一邊，而反應(yīng)產(chǎn)物可以透過膜逸出，在這種情況下，酶本身仍 處于溶解狀態(tài)，只不過被固定在一個(gè)有限的空間內(nèi)不能自由流動(dòng)。因此，用水不 溶酶或固相酶的名稱就不恰當(dāng)了。在1 9 7 1 年第一屆國(guó)際酶工程會(huì)議上，正式建 議采用“固定化酶”( i m m o b i l i z e de n z y m e ) 的名稱。它是通過物理或化學(xué)的方法 使溶液酶轉(zhuǎn)變?yōu)樵谝欢ǖ目臻g內(nèi)其運(yùn)動(dòng)受到完全約束、或受到局部約束的一種不 溶于水，但仍能進(jìn)行其特有的催化反應(yīng)、并可回收及重復(fù)使用的酶。它能以固相 狀態(tài)作用于底物進(jìn)行催化反應(yīng)。 1 2 2 固定化酶的優(yōu)點(diǎn) 固定化酶在保持其高效、專一及溫和的酶催化反應(yīng)特性的同時(shí)，具有以下優(yōu) 點(diǎn) 2 2 1 ： ( 1 ) 在催化反應(yīng)以后很容易從反應(yīng)系統(tǒng)中分離出來，不僅固定化酶可以反復(fù) 使用，使酶的使用效率得到提高，使用成本降低，尤其適合于使用貴重酶。 ( 2 ) 固定化酶極易與反應(yīng)體系分離，可獲得不被酶污染的、純度較高的產(chǎn)物， 簡(jiǎn)化了提純工藝，提高了產(chǎn)量和產(chǎn)品質(zhì)量。 ( 3 ) 在大多數(shù)情況下，酶在固定化后穩(wěn)定性得到較大提高，可較長(zhǎng)期地使用 或貯藏。 ( 4 ) 固定化酶有一定的形狀和一定的機(jī)械強(qiáng)度，可以攪拌或裝柱的方式作用 于底物溶液，使反應(yīng)過程能夠管道化、連續(xù)化和自動(dòng)化。 8 第一章緒論 ( 5 ) 酶的催化反應(yīng)過程更易控制如使用填充式反應(yīng)器時(shí)，一旦底物不與酶 接觸，即可使酶反應(yīng)終止。 ( 6 ) 比可溶酶更適于多酶體系的使用，不僅可利用多酶體系中的協(xié)同效應(yīng)使 酶催化反應(yīng)速度大大提高，而且還可以控制反應(yīng)按一定順序進(jìn)行 輔酶固定化和輔酶再生技術(shù)，使固定化酶和能量再生技術(shù)或氧化還原體 系合并使用，從而擴(kuò)大其應(yīng)用范圍。 因此固定化酶在生產(chǎn)中的應(yīng)用日漸增多，為酶催化的應(yīng)用開辟了新的途徑。 固定化酶在醫(yī)藥和食品等工業(yè)部門有著很大的實(shí)用價(jià)值。如用固定化氨基酸酰化 酶生產(chǎn)l 氨基酸、固定化青霉素酰胺酶水解青霉素g 生產(chǎn)6 - 氨基青霉烷酸、固 定化葡萄稽異構(gòu)酶生產(chǎn)高果糖漿、固定化稽化酶生產(chǎn)葡萄糖等。 固定化酶的研究不僅具有重要的實(shí)際意義，而且還具有理論意義。酶促反應(yīng) 機(jī)理的研究，是闡明生物體內(nèi)各種復(fù)雜代謝過程及其調(diào)控的基礎(chǔ)。研究固定化酶 有助于了解細(xì)胞的結(jié)構(gòu)與功能。細(xì)胞內(nèi)與呼吸鏈、蛋白質(zhì)合成、主動(dòng)運(yùn)輸及神經(jīng) 傳導(dǎo)等重要物理功能有關(guān)的酶都是天然的固定化酶，它們或者是在凝膠的環(huán)境 中、或者是吸附在界面上，或者是在線粒體一類的細(xì)胞器上發(fā)生作用。麗至今為 止的絕大多數(shù)的研究，都是將酶從天然支持物( 如膜) 上分離下來，使它處于一 種與天然細(xì)胞內(nèi)不完全相同的狀態(tài)下進(jìn)行的，所以不易得到完全符合于機(jī)體的認(rèn) 識(shí)理想的方法是將酶結(jié)合到細(xì)胞中的凝膠物質(zhì)或天然酶等固相載體上。再來研 究細(xì)胞的多酶體系，固定化酶為之提供了一種良好的模型。 基于以上原因，固定化酶技術(shù)的研究頗受關(guān)注，其應(yīng)用也日益廣泛。 1 2 3 固定化酶的方法 根據(jù)專述和綜述粗略統(tǒng)計(jì)，目前已經(jīng)進(jìn)行固定化的酶不下1 0 0 種，我國(guó)研究 者也對(duì)3 0 余種酶進(jìn)行過固定化研究迄今為止，研究和應(yīng)用的酶固定方法可歸 納為吸附法，共價(jià)偶聯(lián)法，交聯(lián)法，和包埋法四大類剛： 吸附法：這是通過載體表面和酶分子表面間的次級(jí)鍵相互作用而達(dá)到固定目 的的方法。根據(jù)吸附劑的特點(diǎn)又分為兩種：物理吸附和離子交換吸附。 物理吸附是通過氫鍵、疏水鍵和艫電子親和力等物理作用力將酶固定于不 溶性載體的方法。常用的載體有：高蛉土、皂土、硅膠、氧化鋁、磷酸鈣膠、微 孔玻璃等無機(jī)吸附劑，纖維素、膠原，賽珞以及火棉等有機(jī)吸附劑無機(jī)吸附劑 的吸附容量一般很低 離子交換吸附法是指在適宜的p h 值和離子強(qiáng)度條件下，利用酶的側(cè)鏈解離 基團(tuán)和離子交換基間的相互作用而達(dá)到酶固定化的方法。最常用的交換劑有c m - 纖維素、d e a e 纖維素、d e a e 葡聚糖凝膠等；其它離子交換劑還有各種合成的 9 北京化工大學(xué)碩士學(xué)位論文 樹脂如d o w ex 5 0 、a m b e r l i t ex e 9 7 等。離子交換劑的吸附容量一般大于物理 吸附劑。 吸附法制備固定化酶的優(yōu)點(diǎn)【2 4 】：( 1 ) 操作簡(jiǎn)單( 2 ) 可以充分選擇不同電荷和 不同形狀的載體( 3 ) 吸附過程可能同時(shí)達(dá)到純化和固定化( 4 ) 這類固定化酶在 使用過程中逐漸失活后可以重新活化( 5 ) 固定化酶失活后，這類載體可以再生， 例如多孔硅膠可以用熱處理或用強(qiáng)堿洗脫蛋白質(zhì)，d e a e s e p h a d e x 可用n a o h 處理再生。 吸附法的不利之處：( 1 ) 最適酶量的選擇是經(jīng)驗(yàn)性的( 2 ) p h 值、離子強(qiáng)度、 溫度和時(shí)間的選擇對(duì)每一種酶和每一種載體也是個(gè)別決定的( 3 ) 吸附程度和固 定化酶的活力不一定是平行的( 4 ) 酶和載體之間結(jié)合力不強(qiáng)會(huì)導(dǎo)致催化活力的 喪失和沾污反應(yīng)產(chǎn)物。因此對(duì)特定的酶和底物，要找到一種理想的吸附劑并不是 十分容易的。 共價(jià)偶聯(lián)法：這是借助共價(jià)鍵將酶的活性非必需側(cè)鏈基團(tuán)和載體的功能基 團(tuán)進(jìn)行偶聯(lián)制備固定化酶的方法。酶分子中的功能基團(tuán)如n 端、賴氨酸- n h 2 、 一c o o h 、一s h 、一o h ( 包括酚羥基) 等都可能涉及到共價(jià)結(jié)合。多孔玻璃是常用 共價(jià)法的無機(jī)載體，其表面羥基通過硅烷基化連上功能基團(tuán)氨基，然后用戊二醛 將酶分子與載體相連接。天然有機(jī)聚合物纖維素、瓊脂糖、淀粉、甲殼等表面相 鄰羥基可用溴化氰活化形成亞氨基碳酸酯，然后在p h 值7 8 的條件下亞氨基碳 酸酯與酶分子中氨基連接；載體表面羥基也可連接活化基團(tuán)環(huán)氧基后再與酶連 接；若載體表面是羥基可以進(jìn)行酰氯化，然后再與酶結(jié)合。 共價(jià)結(jié)合法是固定化酶研究中最活躍的一大類方法。共價(jià)法優(yōu)點(diǎn)是酶與載體 之間的連接鍵很牢固，使用過程中不會(huì)發(fā)生酶的脫落，穩(wěn)定性較好。缺點(diǎn)是載體 的活化或者固定化操作比較復(fù)雜，反應(yīng)條件也比較劇烈。所以往往需要嚴(yán)格控制 條件才能獲得活力較高的固定化酶。 交聯(lián)法：即利用雙功能或多功能試劑在酶分子間、酶分子與惰性蛋白間或 酶分子與載體間進(jìn)行交聯(lián)反應(yīng)( c r o s s l i n k i n g ) ，以共價(jià)鍵制備固定化酶的方法。 常用的交聯(lián)劑有戊二醛、已二酰亞氨酸二甲酯、辛二酰亞氨酸二甲酯、異硫氰酸 酯等。交聯(lián)法操作簡(jiǎn)單，但交聯(lián)反應(yīng)往往比較激烈，許多酶易在固定化過程中失 效，酶回收率不高。但是這種方法的原理被用于交聯(lián)酶晶體中，酶處于晶體狀態(tài) 再交聯(lián)將不會(huì)影響酶和活性，同時(shí)會(huì)增強(qiáng)酶的穩(wěn)定性，并能提高其抵抗蛋白酶水 解的能力。 交聯(lián)酶晶體1 1 1 ：( c r o s s - l i n k e de n z y m ec r y s t a l s ，c l e c ) 的報(bào)導(dǎo)給人們提供了一 種新的選擇，交聯(lián)酶晶體實(shí)際上是固定化酶的延續(xù)和發(fā)展。酶固定化制劑中酶含 量?jī)H占5 ( 重量百分比) ，就相同的單位重量來說，c l e c 的酶活性比固定化酶 第一章緒論 的活性高得多目前，大約有1 5 種酶可制成c l e c 形式，其中5 種c l e c 催化 劑已進(jìn)行商品化生產(chǎn)，并已達(dá)到公斤級(jí)生產(chǎn)規(guī)模。最近的研究工作表明交聯(lián)酶晶 體催化劑能提高酶在有機(jī)溶劑中的穩(wěn)定性、可耐受極端反應(yīng)條件。c l e c 具有酶 催化的一般特性，又具有非均相化學(xué)催化劑的高穩(wěn)定性和易回收的優(yōu)點(diǎn)，交聯(lián)酶 晶體催化劑在有機(jī)合成中有美好的應(yīng)用前景 包埋法：這是將聚合物的單體和酶溶液混合后，再借助聚合促進(jìn)劑( 包括交 聯(lián)劑) 的作用進(jìn)行聚合，將酶包埋于聚合物中以達(dá)到