（細胞生物學專業(yè)論文）d半乳糖誘導生物體衰老與細胞衰老模型的實驗研究.pdf

四川大學碩士學位論文 d 一半乳糖誘導生物體衰老與細胞衰老模型的實驗 研究 細胞生物學專業(yè) 研究生邢玉芝指導教師胡火珍 摘 研究目的本研究擬通過對自由基的檢測及細胞、生物體的衰老生物學改 變相關性的研究，探討d 一半乳糖( d g a l a t o s e ，d g a l ) 誘導后的自由基損 傷，骨髓間充質干細胞( m e s e n c h y m a ls t e mc e l l s ，m s c s ) 衰老、生物體衰 老三者之間的相互關系，以期能夠揭示在衰老過程中，自由基引起生物體 衰老的細胞學機理，試圖在生物體及細胞水平上建立一個良好的老化模 型，為認識衰老和最終找到推遲衰老的方法提供實驗平臺。 研究方法 1 小鼠衰老模型的建立：取昆明種小鼠4 0 只，稱重，隨機分成2 組，每組2 0 只分對照組、造模組；對照組每天給予生理鹽水0 3m l 頸背部皮下 注射，造模組給予5 d g a l0 3m l 頸背部皮下注射。連續(xù)給藥6 0d 。 2 小鼠衰老指標的檢測：觀察兩組小鼠的體征及行為學變化，檢測大腦 組織內、血清內s o d 及m d a 含量的變化，檢測皮膚s o d 、m d a 及 羥脯氨酸含量變化。 3 m s c s 衰老模型的建立：取2 月齡s d 大鼠m s c s 分離培養(yǎng)至第3 代， 置于含8 9 幾o - g a l 的培養(yǎng)液中再傳至第3 代作為誘導組，而在原培 養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)至第6 代的為對照組。 4 m s c s 衰老指標的檢測：通過光鏡、透射電鏡觀察兩組m s c s 形態(tài)和 結構變化，繪制兩組細胞的生長曲線，進行b 一半乳糖苷酶染色，流 式細胞儀檢測細胞周期分布變化和單細胞凝膠電泳檢測d n a 損傷方 法檢測其衰老后的生物學行為變化，檢測兩組細胞內s o d 及m d a 的 ， 四川大學碩士學位論文 含量變化。 研究結果 1 小鼠衰老：( 1 ) 體征及行為的變化：造模前兩組動物反應良好，毛發(fā) 光滑，飲食正常，行動敏捷。造模組小鼠頸背部皮下注射d g a l 后4 周后部分小鼠體重開始減輕，行動緩慢，反應遲鈍，毛發(fā)干枯發(fā)黃、 缺乏光澤，雙頰脫毛明顯，尾部出現色素斑點沉著并逐漸加重，嗜睡。 ( 2 ) 皮膚改變：造模組較之對照組皮膚彈性降低。m d a 明顯升 高。s o d 、羥脯氨酸含量減少。( 3 ) 對自由基的作用的影響：造模組小 鼠腦組織內、血清內s o d 含量降低及m d a 含量升高。 2 m s c s 衰老：( 1 ) 誘導組m s c s 鏡下呈典型的衰老細胞形態(tài)，增殖速 度減慢；對照組m s c s 形態(tài)均勻，長勢良好。( 2 ) 流式細胞儀檢測表 明加入d - g a l 誘導后9 0 m s c s 停留在g o g l 期，而s 期和g 2 m 期 m s c s 近于消失，并隨誘導時間延長趨勢越明顯；對照組m s c s 各期 比例正常。( 3 ) 誘導組約8 0 呈b 半乳糖苷酶活性陽性染色，對照 組染色為陰性。( 4 ) 單細胞凝膠電泳示誘導組m s c sd n a 有拖尾現 象，對照組m s c s 無d n a 損傷。( 5 ) 對自由基的作用的：誘導組m s c s 內s o d 含量降低、m d a 含量升高 研究結論d ：a l 能夠誘導實驗動物小鼠衰老，對s d 大鼠m s c s 的老化具有 誘導作用，初步推斷8 白最適濃度，為研究衰老的機制及抗衰老提供了 研究提供了一個較為理想的研究平臺 關鍵詞d 半乳糖：自由基；生物體衰老；骨髓問充質干細胞；細胞衰老 4 四川大學碩士學位論文 s t u d i e so na n i 蚣la g i n ga n dc e l ls e n e s c e n c e m o d e li n d u c e db yd g a i 。a c t o s e m a y o r c e i l - b i o l o g y c n a d t l a t es t u d e n t ：x i n gy u z h i s u p e r v i s o r ：p r o f h uh u o - z h e n a b s t r a c t o b j e c t i v e o u rs t u d yf o c u s e do nr e s e a r c ht h ec o r r e l a t i o na m o n gt h e o x i d a t i v ed a m a g e s t e mc e l ls e n e s c e n ea n da n i m a la g i n g b ym e 越u 磚t h e q u a n t i t yo ff r e er a d i c a l ，m o r p h o l o g i c a la n db i o l o g i c a lc h a n g e so fa n i m a la n d c e i lm o d e l w ew a n tt oe x p l a i n st h a td - g a l a e t o s ei n d u c i n gs u b a c u wa g i n g m o i l s em o d e li sr e l a t e dt oc a u s et h eo x i d a t i v es t r e s sd a m a g e s ，a n dw a n tt o p r o v i d e sag o o dm o d e lo fa n i m a la g i n ga n ds t e mc e l l s s e n e s c e n e i v e a n d r e f e r e n c e sf o rf l l l - t h e rr e s e a r c hi na g i n g m e t h o d s 1 d - g a li n d u c e da g i n ga n i m a lm o d e l ：t h e3 - w c e k - o l dm i c ew e f ed i v i d e d i n t ot w og r o u p sa tr a n d o m ，t w e n t yi ne a c hg r o u p n o r m a lc o n t r o lg r o u p w a sg i v e ns a l i n e ( 0 3 m 1 ) e v e r yd a y ，d g a lg r o u pw a sg i v e n5 d - g a l a e t o s e ( 0 3 h a ) e v e r yd a y s a l i n ew a t e ra n dd g a l a c t o s ew 讎g i v e n b yi n t r a p e r i t o n e di n j e c t i o n ，a n dt h e yw e f cf e dw i t hf e e ds t u f f s a l i n e w a t e ra n dd g a i a c t o 辯w e mg i v e nf o r8w e e k s a f t e ro n ew e e k 蛐) p p e dt h e i n j e c t i w ec o u e c t e da l lt i s s u e s 2 t h ed e t e c t i o no fa g i n gs i g n s ：w eo b s e r v e dt h ec o n s t i t u t i o n a la n da e t i o a c h a n g e so fe a c hg r o u p 。a n dm e a s u r e dt h ea c t i v i t i e so fs o da n dm d a i n s e r u mts k i na n dt i s s u e sw i t hb i o c h e m i s ym e t h o d s 3 d g a li n d u c e dc e l l u rs e n e s c e n c em o d e l ：m s c si n d e n t i f i e d w e i ef e l li n t o 5 四川大學碩士學位論文 t w ot e a m s ：c o m p a r i s o nw e r et h c3r dg e n e r a t i o ni nd m e m - f 1 2m e d i u m w i t h o u td - g a l a c t o s e ，a n dt h ei n d u c e m e n tw e r ec u l t u r e di nd m e m - f 1 2 m e d i u mc o n t a i n i n g8g ld g a l a t o s ea f t e r3g e n e r a t i o n 4 t h ed e t e c t i o no fs e n e s c e n c i v es i g n s ：o p t i c a la n de l e c t r o n i cm i c r o s c o p e ， 蛔i n gg r o w t hc u r v e ，f l o wc y t o m e t e r ，s i n g a lc e l lg e le l e c t r o p h o r e s i sa n d f l - g a l a c t o s ed y ew e r eu s e dt oi d e n t i f yt h ei n f l u e n c e so fc h a r a c t e r i s t i c m o r p h o l o g i c a la n db i o l o g i c a l m a r k e r s o f m e s e n c h y m a l s t e mc e l l s i n d u c t e db yd m e m f 1 2m e d i u mc o n t a i n i n g8 9 ld - g a l a t o s e w e m e a s u r e dt h ea c t i v i t i e so fs o da n dm d ao fe a c hg r o u pc e l lw i t h b i o c h e m i s t r ym e t h o d s r e s u l t s 1 a n i m a la g i n g ：t h en o r m a lc o n t r o lh a dm a n ys i g n i f i c a n td i f f e r e n c e sf r o m t h em o d e lg r o u pi nc o n s t i t u t i o n a la n da c t i o n e g ：t h em o d e lg r o u p b e c a m e ，a c t i o ns l a c ka n dl a g g i n g , l e s so ft h ew c i g h t h a i rs c o c ha n dl e s s l u s t e ra n dh a dm o r es l e e p s t h er e s u l t ss h o w e dt h a tm d ac o n t e n t so f n o r m a lc o n t r o lg r o u p ，d e c r e a s e dm o r es i g n i f i c a n t l yt h a nt h a t i nd - g a l g r o u p ，a n dt h ea c t i v i t yo fs o di n c r e a s e dm o r es i g n i f i c a n t l yt h a nt h a ti n d - g a lg r o u p 2 c e l ls e n e s o e n c e ：a f t e rt r e a t m e n tw i t hd - g a l a t o s e ，m e s e n c h y m a ls t e m c e l l sd i s p l a y e dm o r p h o l o g i c a la n db i o l o g i c a lc h a n g e so fc e l ls e n e s c e n c e w i t ht h es e n e s c e n c t i v ec h a r a c t e r i s t i cm o r p h o l o g i c a lm a r k e r s ；8 0p e r c e n t s o fc e l l sa r ex - g a ld y em a s c u l i n e ，s i n g a lc e l lg e le l e c t r o p h o r e s i ss h o w d n ad a m n i f i c a t i o n f l o wc y t o m e t e rs h o w s9 0p e rc e l l ss t a yi ng o ，g 1 ，b u t sa n dg e md i s a p p e r da l m o s t w h i l et h ec o m p a r i s o nh a sn o tt h e s e s e n e s c e n c i v ep h e n o m e n a t h er e s u l t sa l s os h o w e dt h a tm d ac o n t e n t so f n o r m a lc o n t r o lg r o u p ，d e c r e a s e dm o r es i g n i f i c a n t l yt h a nt h a ti nd g n l g r o u p , a n dt h ea c t i v i t yo fs o di n c r e a s e dm o r es i g n i f i c a n t l yt h a nt h a ti n d g a lg r o u p g o n clu sio n sd - - g a l a t o s ec a ni n d u c t e dm i c ea n dm e s e n c h y m a ls t e mc e l l s 6 嬰型奎蘭塑主蘭竺堡苧 s e n e s c e n c e ，a n d8 9 nw a st h eb e s t t h u st h i ss t u d yp r o v i d e sag o o dm o d e lo fr a t a g i n ga n ds t e mc e l l ss e n e s c e n c i v e t h e s es t u d i e sw i l ld om u c ht ot h e m a n u f a c t u r eo ft h ed r u g sa n de v a l u a t i o no fm e a s u r e st or e s i s ta g i n g , k e yw o r d s ：d - g a l a c t o s e ；m e s e n c h y m a ls t e mc e l l s ：c e l ls e n e s c e n c e ； a n i m a la g i n g 7 四川大學碩士學位論文 1 引言 近年來，我國逐步進入老齡化社會“1 ，有效地維護老年人的健康，防 治衰老相關性疾病成為人們普遍關注的社會問題。因此，研究衰老發(fā)生機 制及延緩衰老圓進程，也成為當今學術界倍受重視的領域。在衰老的研究 中，合適的衰老動物模型對于深入研究衰老機制，篩選、研制抗衰老藥物 具有重要意義。 研究發(fā)現“”連續(xù)給動物注射臚半乳糖能誘導出許多衰老生物學改 變，甚至是衰老的特異性酶的改變。在體內d 半乳糖受半乳糖合成酶的作 用，可氧化產生大量自由基，如0 2 和h2 0 z 等活性氧，從而引起脂質過 氧化作用的鏈式反應，導致細胞膜損傷跚；同時過氧化脂質( 1 e o ) 的分解 終產物如m d a 可與d n a 或r n a 及蛋白質和磷脂的有關物質結合，使細胞 膜成分改變、功能障礙，促進衰老舊； 細胞作為生命活動的基本單位，細胞老化是機體衰老的核心，通過細 胞衰老的研究可了解衰老的某些規(guī)律，以往的研究多是對二倍體成纖維細 胞的研究基礎上進行的。近年來的研究發(fā)現干祖細胞是介導組織修復和 更新的主要細胞群體，在生物體內，干，祖細胞數量和功能隨齡下降，這是生 物體衰老的原因之一目前的研究顯示，m s c 的終末分化有可能跨越胚層界 限，超越傳統(tǒng)意義上的分化為中胚層來源的間質細胞，而向實質細胞轉化， 如分化為心肌細胞、神經細胞等，有著廣泛的l 臨床應用前景。而且體外擴 增實驗發(fā)現m s c s 生長性狀穩(wěn)定，1 、3 、5 代細胞的形態(tài)、生長曲線和貼壁 率無顯著差異；體外擴增容易、接種存活率高、適應能力強及增殖速度快， 所以利用d r 半乳糖誘導m s c s 作為體外實驗模型更具有l(wèi) 臨床研究意義和 穩(wěn)定性。 所以本研究擬通過對自由基的檢測與觀察體內外衰老生物學特性改 變，探討自由基損傷、d 一半乳糖致衰老小鼠模型、d 卜一半乳耱致m s c s 衰老 模型三者的相互關系，以期能夠揭示衰老過程中，自由基引起生物體衰老 的細胞學機理，并試圖在生物體及于細胞水平建立一個良好的老化模型， 為認識衰老和最終找到推遲衰老的方法提供實驗平臺。 b 四川大學碩士學位論文 2 材料與方法 2 1 材料 2 1 1 實驗動物 2 - 3 周昆明小鼠4 0 只，雌雄各半 2 月齡雄性s d 大鼠3 只 均購自四川大學華西校區(qū)實驗動物中心 2 1 2 主要試劑 d m 跚f 1 2 培養(yǎng)基、m t t 、胰酶均購自美國g i b c o 公司， 小牛血清購自成都生物制品有限公司， d m s o 分析純購自成都化學試劑廠， x - g a l ( s i g m a ，美國) ， p e r c o l l 分離液( l0 7 3g m l ，p h a m a e i a ，美國) ， d - 半乳糖購自上海伯奧生物技術有限公司) ， 低熔點瓊脂糖和正常熔點瓊脂糖購自英國o x o i d 公司， 超氧化物歧化酶( s o d ) 測定試劑盒購自南京建成生物工程研究所， 丙二醛( m o a ) 測定試劑盒購自南京建成生物工程研究所 2 1 3 主要實驗溶液和緩沖液的配置 紲照堡差旦巫抗的配置方法： 一般市售青霉素8 0 萬u 瓶，溶于4 m l ，每1 0 0 0 m l 培養(yǎng)液加0 5 m l ，終濃 度為1 0 0u m e ；一般市售鏈霉素1 0 0 萬u 瓶，溶于5 m l ，每1 0 0 0 m l 培養(yǎng) 液加0 5 m l ，終濃度為1 0 0u l n l ! 墼壘拯緩往透 1 0 貯存液組分為；1 0 8 9t r i s 堿，5 5 9 硼酸，4 0 m l0 5 me d t ap h 8 0 ， 加水至1 l 1 工作液濃度為：8 9 m mi r i s 堿，8 9 m m 硼酸，2 i i l me d t a ；使用前將貯存 液稀釋1 0 倍即可 9 四川大學碩士學位論文 湟化乙錠【墜墼2 溶液 1 0 x 貯存液濃度為1 0 m g m l ，在2 0 m l 水中溶解o 2 9e t b r ，混勻后4 避 光保存，由于e t b r 是誘變劑，要小心操作 1 x l 作液濃度為1 p g 肛l ，使用前將貯存液稀釋1 0 倍即可 薹= 鯉! 鎏色違厘醋酸= 里醛固定潼配制 x - g a l 染色液：1 0 0r e t o o l 【，磷酸鈉( p h7 3 ) ，1 3n n o l l 氯化鎂。3m m o l l 鐵氰化鉀，3 砸i l o l l 亞鐵氰化鉀，1m g m lx - g a l ；以上經0 4 5m 的膜過 濾。 固定液：甲醛1 0 l i l l ，冰醋酸3 d ，生理鹽水加至1 0 0 m l 。 2 i 4 主要儀器設備 細胞培養(yǎng)箱( m c o1 5 a c ) 為s a n y o z 司產品 倒置顯微鏡為重慶光學儀器廠產品 酶聯免疫酶標儀惠普公司 u v - 7 5 0 4 紫外可見分光光度計上海欣茂儀器有限公司 恒溫水浴箱深圳天南海北實業(yè)有限公司 普通離心機上海手術器械廠 勻漿器上海醫(yī)療器械廠 2 2 技術路線 2 2 1d 一半乳糖致昆明小鼠衰老的模型的構建及檢測 實驗動物分組一造模一自由基檢測生物體衰老生物學特征 2 2 2d - 半乳糖i 變m s c s 擬衰老模型的構建及檢測 細胞的分離培養(yǎng)一造模一自由基檢澍細胞衰老生物學特征觀察 2 3 實驗方法 2 3 1d 一半乳糖誘導昆明小鼠衰老模型的構建1 5 7 期 2 3 1 1 實驗動物分組及給藥 四川大學碩士學位論文 取昆明種小9 4 0 只，稱重，隨機分成2 組，每組2 0 只分空白對照組、造模 組。 空白對照組每天給予生理鹽水0 3m l 頸背部皮下注射，造模組給予5 d - 半乳糖0 3m l 頸背部皮下注射。連續(xù)給藥6 0 d 。 自由取食，飲用自來水。室溫保持在( 2 0 1 ) ，自然光照下飼養(yǎng)。 2 3 1 2 衰老指標檢測 2 3 1 2 1 血清s o d 及m d a 的測定 于末次注射藥物2h 后，從眶下及心臟采血2 0 m l 。 血液立即離心( 3 5 0 0 r m i n ) 1 0m i n ，吸取上清液作s o d 及m d a 含 量檢測 ( s o d 檢測試劑盒、m d a 檢測試劑盒) 。 紫外分光光度儀測定造模組和對照組小鼠血清的吸光度值。 2 3 1 2 2 大腦s o d 活性測定 采血后迅速斷頭，取出雙側皮層，用冰冷生理鹽水漂洗，除去血液， 濾紙吸干，稱重，放入小燒杯，冰浴。 生理鹽水：組織按9 ：1 的比例，先加總量的2 ，3 生理鹽水于小燒杯、剪碎、 倒入勻漿器，另1 3 生理鹽水沖洗小燒杯后倒入勻漿器，手工勻漿。 取勻漿液，普通離心機3 0 0 0 r l m i n 離心1 5m i l l 。 取1 0 的組織勻漿上清再用生理鹽水按l ：9 稀釋成l 組織勻漿。 采用黃嘌呤氧化酶法( s o d 檢測試劑盒) ，予波長5 5 0 r i m 處分別測定造模 組和對照組小鼠大腦組織勻漿液的吸光度值。 2 3 1 2 3 大腦m d a 含量測定 小鼠大腦組織蛋白勻漿和定量方法同上 采用1 1 3 a 比色法( m d a 檢測試劑盒) ，于波長5 3 2 n m 處分別測定造模組和 對照組小鼠大腦組織勻漿液的吸光度值。 2 3 1 2 4 皮膚衰老的觀察 四川大學碩士學位論文 取背部皮膚，去除皮下脂肪及結締組織分兩部分， 第一部分取皮膚組織塊1 0 0m g 經預冷的生理鹽水漂洗。擬作皮膚組織 勻漿用，測定勻漿中超氧化物歧化酶( s o d ) 、過氧化脂質代謝產物丙二醛 d 囝a ) 第二部分取皮膚組織后，l ：i 丙酮一乙醚脫脂。切碎晾干，精密稱取2 0 0 m e ，作羥脯氨酸含量的測定。 2 3 2d - 半乳糖誘導m s c s 擬衰老模型的構建” 2 3 2 1m s c s 的體外分離培養(yǎng) s d 大鼠斷頸處死后無菌操作，取雙側殷骨和脛骨，剔除周圍肌肉組織， 剪去兩骺端； 抽取5m l 無血清冷d m e m f 1 2 培養(yǎng)基( 含青霉素、鏈霉素各1 0 0u m 1 ) 沖洗骨髓腔，吹打制成單細胞懸液，注入含有5m lp e r c o l l 分離液離 心管中，離心半徑8c m ，20 0 0r m i n 離心2 0m i n ； 收集離心液界面上乳白色云霧狀的細胞層，先后以p b s 和d m e m 漂洗； 用含1 5 d 、牛血清d m e m f 1 2 培養(yǎng)基重懸細胞； 計數3 5 1 0 5 個m l 后即接種于培養(yǎng)瓶中，置于3 7 、5 c 0 ：飽和濕 度的細胞培養(yǎng)箱中進行原代培養(yǎng)； 分別于2 4 、7 2h 半換液，以后每3 天全量換液1 次。倒置相差顯微鏡 下觀察細胞培養(yǎng)全過程； 1 3d 后細胞長滿瓶底8 0 時進行傳代培養(yǎng)，以i ) 1 0 。個m l 終濃度傳 代，取傳至第6 代細胞為對照組。 2 3 2 2m n 檢測細胞活力 取第三代m s c s 按lx1 0 5 個m l 接種于9 6 孔板，在3 7 5 c o ：的飽和 水汽二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。 培養(yǎng)接近融合狀態(tài)時，換含不同濃度d - g a l 為0 、4 、8 、1 2 、1 6g l l1 0 0 斗l 培養(yǎng)液， 等體積p b s 作空白對照組，每組做5 個平行樣品， 1 2 四川大學碩士學位論文 7 2h 后吸去培養(yǎng)液，p b s 洗滌2 次，每孔加入m t u r ( 5m g m 1 ) 2 0 i ll ， 繼續(xù)培養(yǎng)4h ，棄上清，加入1 5 0pld m s o 振蕩1 0m i n ， 用酶聯免疫檢測儀測定5 7 0 舢的吸光度( 彳) 值 根據細胞存活率= 實驗組細胞一空白對照對照組細胞一空白對照1 0 0 計算細胞活力。 2 3 2 3m s c s 衰老模型的建立 取第三代m s c s 改換在含8g ld - g a l d m i ! m - f 1 2 培養(yǎng)液培養(yǎng)， 繼續(xù)培養(yǎng)再傳至第3 代，即為d - g a l 誘導的大鼠m s c s 衰老模型，作為誘 導組。 2 3 2 4 細胞周期分析 將對照組改換于含8g ld - g a l d m e m - f 1 2 培養(yǎng)液中培養(yǎng)， 分別用0 2 5 胰酶消化對照組及培養(yǎng)i 、2 、3 及4d 的m s c s ，每個樣本收 集約l 1 0 個m s c s ，p b s 洗2 次后懸浮于o 5m lp b s 中，充分吹散混勻。 將細胞懸液加k sm l7 0 冷乙醇中，4 c 固定過夜。 離心半徑8c m , l2 0 0r r a i n 離一b l om i n ，棄乙醇，冷p b s 洗2 次后懸浮于 0 5m l p b s h b ，加入碘化丙啶im l ( 終濃度為5 0m g m 1 ) 室溫避光反應3 0m i n 流式細胞儀檢測。 2 3 2 5 繪制細胞生長曲線 取對照組和誘導組m s c s ，分別以1 1 0 個m l 細胞懸液接種于2 4 孔培 養(yǎng)板： 當單層細胞生長達8 0 融合時，每2 4h 消化收集細胞，制成細胞懸液。苔 盼藍染色計數，每組計數3 孔，計算均值： 共記數7d ，實驗重復3 次。 2 3 2 6x g a l 染色 將對照組和誘導組m s c s 分別接種于6 孔扳，調整細胞密度為2 5 1 0 個 四川大學碩士學位論文 m l ； 待長成單層后，吸凈培養(yǎng)液，加入lm l 醋酸甲醛固定液： 室溫固定3 0r a i n ； 吸凈固定液，p b s 洗滌3 次，每次3m i n ； 吸凈p b s ，每孔加入lm lx - g a l 染色液； 3 7 孵育4 6h ，保鮮膜封住6 孔板防止蒸發(fā)； 直至大部分m s c s 變藍，普通光學顯微鏡下觀察。 2 3 2 7 單細胞凝膠電泳觀察【l l l 用細玻璃條在普通載玻片上自制約1 5 1 5 c m 2 的微電泳槽； 鋪膠：1 層為正常熔點的瓊脂糖凝膠層，作為底層；2 層分別為對照組和 誘導組m s c s 懸液與低熔點的瓊脂糖凝膠混合后的凝膠層；3 層為低熔點的 瓊脂糖凝膠覆蓋層； 裂解：將微電泳槽置于新鮮配制的中性裂解液中，4 冰箱中裂解1 5 h ： 解旋：取出微電泳槽，用雙蒸水漂洗去掉多余的鹽分，置于提前加入0 5 t b e 電泳液的水平電泳儀中解旋2 0 r a i n ； 電泳：在2 0 v ，2 0 0 m a 電泳條件下電泳2 0 m i r a 染色和觀察：2 地g m l 溴化乙錠( e b ) 染色。雙蒸水漂洗，去掉多余染液， 在熒光顯微鏡下觀察，并用數碼相機攝取圖像。 2 3 2 8 透射電鏡觀察 分別取兩組m s c s 培養(yǎng)液4m l 以離心半徑8c m , 12 0 0r m i n 離，h i 0m i n ： 棄上清，加入0 3 戊二醛固定液，4 c 靜置3 0m i n ： 再以離心半徑3 c m , 1 20 0 0r m i n 離一0 1 5m i n ： 棄上清，加入3 戊二醛固定液，固定6 0m i n ； 經脫水、包埋、超薄切片后透射電鏡下觀察。 2 3 2 9 自由基測定 采用黃嘌呤氧化酶法( s o d 檢測試劑盒) ，于波長5 5 0 1 l m 處分別測定各實 1 4 四川大學硬士學位論文 驗組和對照組m s c s 內的吸光度值； 采用t b a 比色法( m d a 檢測試劑盒) ，于波長5 3 2 n m 處分別測定各實驗組 和對照組m s c s 內的吸光度值。 2 3 3 統(tǒng)計學方法 采用s p s s l 0 0 軟件統(tǒng)計進行統(tǒng)計學分析，數據以均數標準差表示。組問 比較t 檢驗，以，值 0 0 5 為有統(tǒng)計學意義。 3 結果 3 1d 一半乳糖誘導生物體衰老模型的實驗結果 3 1 1d - 半乳糖對造模組小鼠的體征及行為學變化 造模前兩組動物反應良好，毛發(fā)光滑，飲食正常，行動敏捷。造模組 小鼠頸背皮下注射d 一半乳糖后1 月余部分小鼠體重開始減輕，行動緩慢， 反應遲鈍，毛發(fā)于枯發(fā)黃、缺乏光澤，雙頰脫毛明顯，尾部出現色素斑點 沉著并逐漸加重，嗜睡。對照組無明顯變化。 3 1 2d - 半乳糖對造模組小鼠血清及大腦組織自由基含量變化 造模組與空白對照組比，大腦及血清中m d a 明顯升高，而s o d 含量降低 ( p o 0 5 ) ，提示造模成功。( 見表1 ) 衰l 大腦組織及血清中s o d 和m d a 的含量變化 注：與對照組比較。p o 0 5 腳o 3 1 3d 一半乳糖對造模組小鼠皮膚組織中抗氧化指標的影響 造模組與對照組比。皮膚d p m d a 明顯升高( p 0 0 5 ) 。s o d 、羥脯氨酸 四川大學碩士學位論文 含量減少( p 0 0 5 ) ，提示造模成功。( 見表2 ) 衰2 皮膚組織中s o d m d a 及羥脯氨酸含量的含量變化 注：與對照組比較，p o 0 5 , , i - - - 2 0 3 2d 一半乳糖誘導m s c s 擬衰老模型制作 3 2 1m s c s 體外分離培養(yǎng) 原代培養(yǎng)的m s c s 于2 4h 后開始貼壁，細胞伸展成梭形、橢圓形或多角 形；4 8h 有細胞集落形成，貼壁細胞增多；4d 呈典型的成纖維細胞形態(tài)； 1 0d 細胞集落不斷擴大而融合成單層( 圖1 ) 。傳代m s c s 生長較原代快，7 d 即鋪滿培養(yǎng)瓶底，傳代細胞保持原代細胞的形態(tài)特征，隨代數增加m s c s 得到純化，梭形細胞占9 0 以上( 圖2 ) 。誘導組m s c s 形態(tài)及排列不規(guī)則， 體積較大，胞漿區(qū)域增大，漿核的比例增加，胞漿中可見較多顆粒或空泡 ( 圖3 ) 。 圖1 原代培養(yǎng)的m s c si 0d 1 0 0圖1 原代培養(yǎng)的m s c s1 3dx1 0 0 1 6 四川大學碩士學位論文 圖2 傳至第5 代的m s c s 1 0 0 圖3 誘導組m s c 8x 2 0 0 3 2 2 肼檢測細胞活力 0 、4 、8 、1 2 和1 6g l 各組吸光度( a ) 值分別為：0 2 4 1 、0 2 3 0 、0 2 0 1 、 0 1 3 6 、0 0 9 2 ，空白對照組為0 0 3 9 ；各組存活率分別為：9 6 7 0 o 0 4 、 8 4 4 0 0 0 2 、4 7 8 0 0 0 4 、2 6 4 0 0 0 3 及2 1 2 0 0 0 2 ，組間比較差異有統(tǒng)計學意義( p 0 0 5 ) 。根據存活率選用8 9 r , d - g a l 建立m s c s 的衰老模型。 表3m t t 檢測各組吸光度a 值結果l n = 5 ，x - + 8 ) 竺! 生望墾室皂塾曼! 芝! 芝! 芝! ! 蘭! ! ! ! 光度值0 0 3 9 0 2 4 10 2 3 00 2 010 。1 3 6 0 0 9 2 與對照組比較p 值 y o u n g a c t i v es t e mc e l l 夠a p e p c t i cs t e mc e l lj * o j da c t i v es t e mc e l l 圖1 伴隨著生物體衰老，干細胞的功能潛能下降年輕的千細胞總體細胞很少具有凋亡細咆 的特點，它由大量的靜止細胞和活動細胞組成，這些細胞具有很強的自我更新能力和分化潛能 這些年輕的干細胞分化為淋巴和髓樣系統(tǒng)( a ) 由于細胞損傷的積累，衰老的干細胞總體會表現出 很高的捅亡率，在這些千細胞內只有少量的靜止細胞，而且活動的干細胞的分化能力也是受到 限制的( ”當機體育遺血的需求老的干細胞總體，它們的凋亡宰增加。靜止期的細胞也不能成 功的完成激活的過程，導致靜止期干細胞的不足活動的干細胞分化受到限制，分化的細胞數目 也是減少的，這就導致機體的修復變得緩慢( c ) 比如研究者們認為“，骨髓間充質干細胞并不具有永生性“干”細 胞的特征，表現出最終的壽命。骨髓間充質干細胞能夠終生存在，隨著年 齡地增加，細胞的數量和增值，分化能力下降。所以這類細胞是要衰老的， 四川大學碩士學位論文 只是衰老進程緩慢例 5 細胞衰老的研究模型 在衰老的研究中，合適的衰老動物模型對于深入研究衰老機制，篩選、 研制抗衰老藥物具有重要意義。國內外學者設計衰老動物模型有很多 種，c h r i s t o p h e r 等人在1 9 7 9 年首先提出了半乳糖性白內障發(fā)生機理，是新 陳代謝異常在晶體方面產生的病理變化。隨后，國內學者利用大劑量d _ 半乳糖造成動物的糖代謝障礙，進而影響蛋白質代謝和脂類代謝，致使動 物不僅出現老年性白內障，而且還出現晶體病變以外的其它組織、細胞一 系列退行性變化，也符合人類自然衰老時所出現的癥狀d 半乳糖所致的 體外衰老模型是我國學者基于衰老的代謝學說而復制成功的，該模型是在 一定的時間內給動物連續(xù)注射d _ 半乳耱，使其細胞內半乳糖濃度增高，在 醛糖還原酶催化下，還原成半乳糖醇，后者不能被細胞進一步代謝而堆積 在細胞內，影響正常滲透壓，導致細胞腫脹，功能障礙，代謝紊亂，最終 機體衰老嘲 自由基引起的細胞損傷主要表現在細胞膜和內膜系統(tǒng)中生物膜的主 要成分是極性脂質和膜蛋白質。由于極性脂質中的不飽和脂肪酸具有易與 f r 結合的分子結構，脂質極易發(fā)生過氧化反應呻1 。線粒體是細胞的氧化中 心和功能基地，為細胞提供細胞的生物合成、運輸活動、信息傳遞等生理 活動所需的能量。線粒體損傷、酶功能的不足可使a d p 轉化為a t p 的過程受 限，造成能量的生成不足，嚴重影響細胞的各種生命活動，降低細胞的活 力線粒體除了進行氧化反應以外，還有攝取和積聚c a 2 , 調節(jié)胞漿內游離 c a 2 + 濃度的作用呻1 。線粒體的損傷和a t p 供應不足等因素可使鈣泵失活， 大量釋放細胞內結合鈣，鈣離子增加，加重細胞內鈣的超載。細胞內鈣超載 可引起一系列該依賴性酶的失控。如一氧化氮合成酶，進一步加劇自由基 反應，抑制細胞的能量代謝”1 ，加重細胞的損傷，引起細胞的衰老。這一 造模機理己在體內外實驗中被廣泛應用，并得到了證實 由上面的細胞類型介紹。可知干細胞是具有增殖、自我更新，多分化 潛能的一類特殊細胞，在個體發(fā)育中，起著維持成體組織器官的完整性方 四川大學碩士學位論文 面起著關鍵的作用。干細胞的功能和數量是維持人體器官生長和新陳代謝 的源泉動力，也是機體修復衰老退行性病變最重要，是決定生命衰老的關 鍵因素。近年來的研究發(fā)現干細胞的壽命是有一定限度的，當其增殖的群 體達到一定限度時，便進入一個不可逆的生長阻滯階段，他們認為這就稱 為干細胞衰老，m s c s 等成體干細胞也不例外干細胞的衰老表現在細胞數 量上減少，質量( 增殖、自我更新能力，分化潛能) 降低。而質量上的變 化更重要，這涉及自我更新潛能，發(fā)育分化潛能以及與細胞外信號之間的 相互作用等。體外培養(yǎng)條件下的干細胞仍可以繼續(xù)分裂增殖，所以在細胞 水平上。通過外界刺激干細胞導致的衰老作衰老模型，便具有增殖穩(wěn)定性、 指標檢鍘明確性，所以干細胞是較好的細胞衰老模型。 6 細胞衰老的機理 隨著老年醫(yī)學引入分子生物學與細胞生物學理論與技術，衰老機理的 研究開始從整體水平發(fā)展到了分子水平脅。捌近半個世紀以來，已經提出 了一系列衰老學說，印大中等隨剮總結重要的衰老學說主要有：整體水平的 衰老學說、器官水平的衰老學說、細胞水平的衰老學說和分子水平的衰老 學說等。 其中細胞水平的衰老學說有：細胞膜衰老學說、體細胞突變衰老學說、 線粒體損傷衰老學說慨“、溶酶體( 脂褐素) 衰老學說、細胞分裂極限學說 ( 程控學說) 口釘；分子水平的衰老學說有：端粒縮短學說洶。制、基因修飾衰 老學說m “1 、d n a 修復缺陷衰老學說慨”、自由基衰老學說啪“研、氧化 衰老學說洶1 ，非酶糖基化衰老學說【州、羰基毒化衰老學說“”和微量元素 衰老學說等等。近幾十年來，先后提出過多種假說，試圖來解釋衰老的本 質和機理，有不少的學說和假說已被普遍公認和接受。未來人們對衰老的 分子機制的研究將進一步深入。我們下面就目前的研究介紹如下： 6 1 錯誤成災學說 1 9 7 3 9 0 r g e l e 提了細胞大分子合成錯誤成災說f 4 2 1 意思是說，細 胞里的核酸和蛋白質在生物合成中如果由于某些原因而發(fā)生差錯，這差 四川大爭碩士學位論文 錯會得到累積而迅速擴大，引起代謝功能大幅度降低，造成衰老。對這 個假說可以進一步說明如下：在細胞里核酸造出蛋白質( 酶) ，因為蛋白 質是用核酸分子傲樣板合成的；蛋白質造出核酸，因為核酸的合成需要 酶，例如聚合酶的協(xié)助。酶是蛋白質，所以核酸和蛋白質在合成中形成 一種循環(huán)，相互聯系，相互協(xié)作，相互制約如果在一次循環(huán)中，出現 一個錯誤，這錯誤會在下一次循環(huán)中得到擴大。這樣，錯誤在幾次循環(huán) 中會很快擴大而成災，使細胞功能大大降低，造成衰老。最近，在人工 培養(yǎng)的人的成纖維細胞工作的基礎上，從上述細胞中提取d n a 聚合酶， 利用這種酶進行d n a 復制實驗，結果發(fā)現上述成纖維細胞經過4 0 次到5 6 次的繼續(xù)培養(yǎng)，其d n a 聚合酶的活性顯著地降低了，大約降低到只有正 常細胞的1 5 活性。從此以后，這些細胞就迅速衰老而死亡了。 研究者還做了另一個實驗，他們從年老的( 即經過很多次繼代培養(yǎng) 的) 和年輕的( 只經過若干次繼代培養(yǎng)的) 上述成纖維細胞分別提i 黜d n a 聚合酶，用人工合成d n a 參j 子作樣板，進行離體d n a 復制實驗，得到一 些有趣的結果，人工合成的d n a 分子有意搞成只含堿基腺嘌呤( a ) 和胸腺 嘧啶c i ) ，而不含有胞嘧啶( c ) 和鳥嘌呤( g ) ，按照核酸分子堿基配對的原理， 在d n a 合成中，a 只能和t 配對，t 只能和a 配對因此在上述離體實驗中， 如果d n a 聚合酶能忠實執(zhí)行任務，那么所含成的d n a 分子中就不能含有c 或g 的堿基如果所提出的d n a 聚合酶在幫助合成d n a 分子中，用了一個 c 或一個g 去合成d n a ，就算是一次錯誤。實驗結果發(fā)現，從經過5 6 次繼 代培養(yǎng)的上述衰老細胞中提取出來的d n a 聚合酶，在合成d n a 分子中， 比從年輕細胞中取出來的d n a 聚合酶要多犯好幾次錯誤。這表示衰老細 胞中的d n a 聚合酶大概在成分上有一些改變，不能忠實地進行工作，累 積的錯誤多。 6 2 外部干擾學說 此說認為細胞衰老既不是細胞內出現差錯，也不是由蛋白質異常引 起，而是由外源性干擾造成的1 例如，自由基受外源性干擾，就會引起 衰老。自由基是失去電子的分子。在體內，它是由空氣污染、輻射以及正 四川大學碩士學位論文 常代謝過程中產生的它們對許多生物功能非常重要，認為沒有自由基 的生物就不能生存自由基與其它分子作用得到電子，其中一些隨機作用， 對細胞和機體組織十分有害。這些效應的積累便導致了人體的衰老自由 基是衰老的根源。衰老的原因9 9 是由此造成的自由基造成的變化或作 用的積累不斷增加，引起了衰老，這種自由基可能專門破壞細胞合成和修 復d n a 的能力，尤其是在線粒體內。 6 3 發(fā)育程序衰老學說 某一物種的衰老表征的共同性表明，衰老受到潛在的基因控制。一個 典型的與衰老相關的基因途徑的例子來自于線蟲。線蟲孵化后，幼蟲經過4 個階段直接發(fā)育為成蟲，或者進入一個稱為持久態(tài)( d a u e r ) 的休眠狀態(tài)。處 于這種狀態(tài)的幼蟲在環(huán)境適宜的情況下可繼續(xù)發(fā)育為成蟲。持久態(tài)的幼蟲 能生存6 個月之久，而正常發(fā)育的成蟲壽命僅有數周。參與這種發(fā)育決定的 許多基因已被克隆。根據持久態(tài)形成基因( d a u e