（生物化學(xué)與分子生物學(xué)專業(yè)論文）nisin發(fā)酵條件的優(yōu)化及代謝調(diào)控.pdf

中文摘要 中文摘要 乳鏈菌肽 n i s i n 是一種天然食品防腐劑 能夠抑制許多革蘭氏陽性致病菌 的生長 是唯一一種允許商業(yè)化生產(chǎn)的天然食品防腐劑 目前 我國只有少數(shù)企 業(yè)生產(chǎn)n i s i i l 且產(chǎn)量與純度都遠(yuǎn)低于國外同類產(chǎn)品 本論文旨在通過優(yōu)化發(fā)酵條 件和代謝調(diào)控的手段提高n i s i n 的產(chǎn)量 并通過分析了解n i s i i l 代謝過程的調(diào)控機(jī) 制 本研究通過從五種乳酸菌發(fā)酵培養(yǎng)基中選出c m 培養(yǎng)基作為初始發(fā)酵培養(yǎng)進(jìn) 行優(yōu)化 在此基礎(chǔ)上摸索出了n i s i i l 發(fā)酵生產(chǎn)的最適初始p h 值為7 0 最適種量為 3 最佳接種種齡為1 2 h 隨后 本研究從營養(yǎng)調(diào)控 氨基酸代謝調(diào)控和乳酸的反饋調(diào)控三種手段對 n i s i l l 的代謝進(jìn)行了調(diào)控 營養(yǎng)調(diào)控通過單因素的摸索 決定在c m 培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加玉米漿作為補(bǔ) 充氮源 磷酸二氫鉀作為磷源進(jìn)行發(fā)酵 然后利用p l a c k e n b u 冊鋤試驗(yàn)確定影響 n i s i i l 效價的三個主要因素為蔗糖 酵母膏和磷酸二氫鉀的濃度 并使用 b o x b e h n k e n 試驗(yàn)分析方法確定了三個主要因素最佳發(fā)酵濃度分別為3 9 9 l l8 5 9 l 和2 0 5 9 l 優(yōu)化后的培養(yǎng)基發(fā)酵生產(chǎn)n i s i n 的效價為16 8 7 士5 提高了 7 4 0 i i m i 氨基酸的調(diào)控通過分析得出a r g c y s 唧對n i s i l l 的生產(chǎn)有正調(diào)控作用 添 加1 9 l 的這三種氨基酸分別使n i s i n 的效價提高了2 2 4 士5 砌恤l 1 3 q 士5 n m i 1 1 8 士5 i u m l 而1 9 l 的p r o 對n i s 訪的合成有負(fù)調(diào)控作用使n i s i n 效價降低了1 3 8 5 i u m l 三口c d c d 淞腸c 咖在延滯期大量利用游離態(tài)的氨基酸 進(jìn)入對數(shù)生長期 后主要利用分解蛋白質(zhì)產(chǎn)生的氮源 試驗(yàn)證明三口c f d c d c c 淞腸甜括利用的主要靠從周 圍環(huán)境中吸收船 而不依賴自身合成 在n i s i n 代謝過程中精氨酸的消耗量最大 隨a 唱添加量的增加n i s i n 的產(chǎn)量不斷增加 但增加幅度降低 當(dāng)精氨酸添加量高 于8 9 l 時 n i s i n 產(chǎn)量基本不再增長 此時效價增加了4 5 0 i u n 兒 黑龍江大學(xué)碩士學(xué)位論文 最后本試驗(yàn)研究了乳酸的反饋調(diào)控 計算得出發(fā)酵過程中蔗糖代謝轉(zhuǎn)化為乳 酸的轉(zhuǎn)化率為8 3 3 經(jīng)驗(yàn)證 乳酸的抑制作用一方面來自于p h 值的下降 另一 方面來自于乳酸根的累積 通過流加5 mn a o h 控制發(fā)酵液p h 值為7 o 左右時 使n i s i l l 發(fā)酵產(chǎn)量在優(yōu)化的培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上又提高4 2 0 士5 i u m l 而當(dāng)發(fā)酵液中乳 酸根的含量達(dá)到7 時n i s i n 停止生產(chǎn)并由此推斷出乳酸根的積累是補(bǔ)糖發(fā)酵的限 制性因素 經(jīng)過以上培養(yǎng)條件的優(yōu)化和代謝調(diào)控過程之后 n i s i i l 的效價共提高了近 1 4 l o m n 兒 約為未進(jìn)行調(diào)控時的1 5 倍 關(guān)鍵詞 n i s i n 發(fā)酵條件 代謝調(diào)控 a b s t r a c t a b s t r a c t n i s i i li sal i n do fn a t u r a lf o o dp r e s e r v a t i v en l a ti sa l l o 耽dt 0c o m m e r c i a l i z e d p r o d u c t i o n n i s i nc a i li n h a b i tm o s t0 f 恤伊鋤p o s i t i v ep a m o g 商cb a c t e t i a n 盯ea r e 0 1 1 l yaf e wc o m p a n yp r o d u c en i s i ni nc t l i i l ab m t l l eo u t p u ta r l dp u r i 哆a r el o w c r 也a i l f 0 r e i g nc o 嘶e s t h ep u r p l o s co ft l l i sa n i c l ei st 0 刪 億et l l em e t a b o l i cp 帥c e s sa n d r e g u l 撕o nm e c h a 血s mo fn i s i nb y 廿l em e t h o do ff e i m e 觚l t ec o n d i t i o no p t i n l i z a t i o n c mm e d i aw a ss e l e c t e d 鶴o r i g 砌m e 擊u m 五的mf i v el a c t i ca c i d eb a c t e r i a 詫舯e n t i o nm e d i 啪si n s 咖d y 0 1 1 l eb 嬲i so f t h i ss t u d y n i s i l lp r o d u 0 no f 也e b e s ti n j t i a p h 砌u eo f7 0 t h e0 p 血 l 蛐鋤0 u n to fi 1 1 0 c u l a t i o ni s 3 t h eb e s t i n o c m a t i o na g e 細(xì)1 2 hw e r ee x p l o r e d s u b s e q u e n t l y n i s i nm o 乞l b l i s mw a sc o m o l l e db yt l l em e t l l o do fn u t r i t i o n a l m 撕p u l a t i o n 鋤i n oa c i dm e 例b o l i cr e g l l l a t i o n 鋤d1 a c t i ca c i df e e d b a c kr e g u l a t i o n b y n u t r i t i o n a lm 枷p u l a t i o nm e t l l o d m a i z el i q 試dw a ss e l e c ta si l i 仃d g e ns o u r c e 鋤d k h 2 p 0 4a sp h o s p h o n 峪s o u r c et o 佗徹e n t a t i o n 1 1 1 e nb yp l a c k e n b u 咖a nt e s t s t h r e c m a i nf a c t o r sm l p a c to fn i s i l lt i t e ri ss u c r o s e y e a s te x t r a c t 趾dt 1 1 ec o n c e n t r a t i o no f k h 2 p 0 4 b yb o x b e l l l l l e nt e s ta 1 1 a l y s i s 也eb e s tc o n c e i l 們t i o no f 也en e em a i nf a c t o r s f o rf e n n e n t a t i o n e r e3 9 9 l l8 5 9 la n d2 0 5 9 l o p t i 面z a t i o no ft l l em e d j 啪a f i e r f e 肌e m a t i o nn i s i ne 伍c i e n c ya t16 8 7 士5 i u i i l c r e a s e d7 4 0i u n l l 1 1 啪u 曲t 1 1 er e g u l a t i o no f 鋤i n oa c i d s a 唱 c y sa 1 1 d1 卻h a v ep o s i t i v er e g u l a t i o n o nn i s i l l w h e na d d e d1g la 唱 c y s 鋤d1 砷 t l l ep o t e n c yw 嬲i n c r e a s e db y2 2 4 士 5 i u m l 1 3 0 士5 i u 珈 la i l d1 18 士5 砌 札 a n dlg lo fp r on i s i np l a yan e g a t i v er o l e i i lr e g u l a t i o nt 0n i s i np o t e n c y w l l i c hm a k ei tr e d u c eb yl38 士5 i u m i l a l c t o c o c c u s l a c t i si i le 殖e r l s i o no fd e m u l t a g e 疔e eu s eo fal a r g em m l b e ro f 枷n oa c i d s 硫ot 1 1 e 黟o w i i l gn u m b e ro fd e c o m p o s i t i o 瑪t 1 1 ei l i t r o g e ns o u r c eo fd e c o m p o s e dp r o t e i i lw a s m a i l l l yu s e d l a c t o c o c c u sl a c t i s t e s t sp r o v e dt l l a tt l l eu s eo fr e l y i n gm a j i l l yo nt 1 1 e s u r r o u n d i n ge n v i r o 舯e n t 丘d mt l l ea b s o 叩t i o ni 1 1t 1 1 ea 唱 r a t h e rm 鋤s e l f s y n t h e s i z i n g i i i 黑龍江大學(xué)碩士學(xué)位論文 c o n s u i i l l 炬o no fa 哂血1 ew 嬲t h el a r g e s ti i lt 1 1 ep r o c e s so fn i s i nm e t a b 0 1 i s m 謝t l lt h e i i l c r e a s eo f 孤翟j 血n e o u t p u t 鋤o u n to fn i s i ni 1 1 c r e a s e d b u tt h em t eo fm c r e a s ew a s1 0 礬 w 1 1 e nt l l e 鋤 咖o f 盯g i l l i n ew a s8g l p r o d u c t i o no f n i s i l ln ol o n g e ri i l c r e a s e d f i n a l l yf e e d b a c kc o n 昀lo fi a 嘶ca c i d v 嬲s t i l d i e di i lt 1 1 ea n i c l e b yc a l c u l a t h l g c o n v 貧s i o nr a t eo fp r o c e s ss a c c h a r o s e 硫ol a c t i ca c i dm e t a b o l i s mi i lf e m e n 嘶o n 弱 8 3 3 h l et 0t l l ed e c l i l l eo fp h 鋤dl a c t i ca c i da c c u m u l a t i o n i i b i t i o n0 c c u r e d f e d e d b y5mn a o h b r o t hp h 啷c o n 仃o la r o u l l d7 0 0 n 也eb a s i so fo p t i i n i 蒯o n f e m e n t 嘶0 n p r o d u c t i o no fn i s i i li 1 1t h em e d i u mr a i s e d4 2 0 士5 i i7 西i m e nc o n t e n to f l a c t i ca c i d 咖ti i lf e r i n e n t a t i o n i 嬲7 p r o d u c t i o no fn i s i i l v a s 咖p p e d 鋤di tw a s c o n c l u d e d 也a t 廿l et l l ea c c 啪u l a t i o no fl a c t i ca c i dr o o l tw a st h el i i l l i tf k t o rf o r e q 砌i z h 塢一s u g a rf e 鋤e 1 1 t a t i o i l a r e ro 洶i z a t i o nc o n d i t i o n s i l l c r e 鷦e dn e a d y14lo i u m l a b o u t1 5t 油e sf o rn o n r e g u l 撕o n 鋤dc o n 仃0 1 1 e yw o r d s n i s i i l f e 衄e m a t i o nc o n d i t i o n m o t a b o l i s hr e 剛a t i o n l v 獨(dú)創(chuàng)性聲明 獨(dú)創(chuàng)性聲明 本人聲明所呈交的學(xué)位論文是本人在導(dǎo)師指導(dǎo)下進(jìn)行的研究工作及取得的研 究成果 據(jù)我所知 除了文中特別加以標(biāo)注和致謝的地方外 論文中不包含其他 人已經(jīng)發(fā)表或撰寫過的研究成果 也不包含為獲得墨蕉婆太堂或其他教育機(jī)構(gòu)的 學(xué)位或證書而使用過的材料 學(xué)位論文作者簽名 二聲名況影 簽字日期 x 即亨暈 a 2 黽 學(xué)位論文版權(quán)使用授權(quán)書 本人完全了解墨蕉塹太堂有關(guān)保留 使用學(xué)位論文的規(guī)定 同意學(xué)校保留并 向國家有關(guān)部門或機(jī)構(gòu)送交論文的復(fù)印件和電子版 允許論文被查閱和借閱 本 人授權(quán)墨蕉塹太堂可以將學(xué)位論文的全部或部分內(nèi)容編入有關(guān)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行檢索 可以采用影印 縮印或其他復(fù)制手段保存 匯編本學(xué)位論文 1 靴做儲攤 例聊鶴 穆她 j 7 弋 簽字日期 彩廬多月 一2 日簽字日期 切口8 年6 月f 日 學(xué)位論文作者畢業(yè)后去向 工作單位 通訊地址 電話 郵編 第1 章前言 1 1nisin 的簡介 1 1 1nisin 的發(fā)現(xiàn) 第1 章前言 乳酸鏈球菌素 n i s i n 是從乳品發(fā)酵微生物三口c 幻 淞脅m 譬墨驢腸c 出發(fā)酵產(chǎn) 物提取制備的一類小分子多肽化合物 這種微生物過去稱為勛印肋 卯螂 口c 廊 r o g e r s 和w h i t t i e r 1 9 2 8 最先發(fā)現(xiàn)乳酸鏈球菌的代謝產(chǎn)物能夠抑制部分革蘭氏陽 性菌的生長 蚴 m a t t i c k 和h i r s c h 1 9 4 4 發(fā)現(xiàn)血清學(xué)n 群中的一些乳酸鏈球菌能 產(chǎn)生蛋白類抑菌物質(zhì) 命名為n i l l h i b i t o 巧s u b s t a i l c e 即n 群抑菌物質(zhì) 簡稱為n i s i n 3 1 n i s i l l 才正式命名 1 9 6 9 年 隨著第一批商品在英國面世 f a o o 食品添 加劑聯(lián)合專家委員會批準(zhǔn)n i s i n 作為一種生物型防腐劑應(yīng)用于食品工業(yè) 1 9 8 8 年美 國食品和藥物管理局 f a d 也正式批準(zhǔn)將n i s i n 應(yīng)用于食品中 1 9 9 0 年3 月2 9 日中國衛(wèi)生部在g b 2 7 6 卜8 6 中批準(zhǔn)n i s i n 可用于罐藏食品 植物蛋白食品 乳制 品 肉制品中 4 迄今為止 n i s i l l 已在全世界約6 0 多個國家和地區(qū)被用作防腐 劑 表1 1 n i s i n 在不同國家的使用狀況 t h eu s eo fn i s i ni nd i f i e r e n tc o n t r y f o o d i n 訥赫t i 王暑i n p 帥刪 j 主m 哪k 砌i i 蚴 r 弘睢l 舶 a u s 姚目囊 眥蜮u m c m 瓜 e u f n 硼t e i 嘶 知k 撕 p r o c e s 3 e dc h e c 基e c h 紀(jì)蛹諍牦c e s 棗dd 犍e 姥拉 機(jī)e d 啪鼬 檔 c b e 髓 e f l c 螄i o 喇d 話矗鼻臼蒯垤翻擻i 瞌3 4 蔭 跏姍嘲e d 薯勺咖嘲弦睜e 哺f 妒 p 眥曩剃d 讎 c h 蹙磚 n b 輛l s 僻m i 鼬d l f 垤 o o n o 酗喝黏 l n o h 憎秘 1 v 酗e a 旺o i d l i bbp 帕如d 疆一即鼎脅b 日弛塘 n o l 蛔k 知日 5 0 0 注 來自a p i i n 和b a r r e t t 公司 f r o ma p l i na n db a r r e t tc o m p a n y 黑龍江大學(xué)碩士學(xué)位論文 1 1 2nisin 的結(jié)構(gòu) 成熟的n i s i n 分子由3 4 個氨基酸殘基組成 分子式為c 1 4 3 h 2 2 8 n 4 2 0 3 7 s 7 1 5 j 分子 量為3 5 1 0 其n i s i n 分子結(jié)構(gòu)中包含5 種稀有氨基酸即a b a 氨基丁酸 d h a 脫氫丙氨酸 d h b b 一甲基脫氫丙氨酸 a l a s 一刖墉 羊毛硫氨酸 和 a l a s a b a b 一甲基羊毛硫氨酸 它們通過硫醚鍵形成五個內(nèi)環(huán) 除了這五個 環(huán)外 在臺聯(lián)的c 端和n 端的頂端區(qū)都有一定的彎曲性 分子高級立體結(jié)構(gòu)中a b c 環(huán)在一邊 d 和e 環(huán)在另一邊 形成 絞鏈區(qū) 其活性分子常為二聚體或 四聚體 二聚體分子量為7 0 0 0 四聚體分子量為1 4 0 0 0 n i s i n 的前體肽由5 7 個氨 基酸組成 其中n 端2 3 個殘基構(gòu)成信號肽 信號肽在在細(xì)胞表面被太沒水解去除 后 釋放除成熟的 有生物活性的n i s i l l 經(jīng)過幾十年的研究 人們己發(fā)現(xiàn)n i s i n 分子有6 種類型 它們分別是a b c d e f 其中以n i s 姒和n i s i i 億兩種 類型的研究最為活躍 兩者的差異僅在于氨基酸順序上第2 7 位氨基酸的種類不同 州s i i 認(rèn)是組氨酸 瑚s 而n i s i n z 是天門冬酰胺 a s n n i s i n z 是n s i n a 的天然 變異體 它與n i s i i 認(rèn)有相同的抗菌活性 但比n i s 姒有更好的擴(kuò)散性 在p h 值 高于6 的溶液中有更好的溶解度 5 7 1 圖l l 乳酸菌素的結(jié)構(gòu)嗍 f i g l ls t 瑚c t u r eo f n i s i n m n 脫氫丙氨酸 d b 一甲基脫氫丙氨酸 a l a 母a i a 羊毛硫氨酸 a i a 母a b a b 一甲基羊毛硫氨酸 1 1 3nisin 形成的分子機(jī)制 乳鏈菌肽生物合成十分復(fù)雜 涉及1 1 個基因 9 1 以證s z n i s b 試s t i l i s c 2 第1 章前言 1 1 i s i 1 1 i s p i l i s r i l i s k i l i s f i l i s e 和n i s g 的順序成簇排列在乳鏈菌肽 蔗糖轉(zhuǎn)座子左端約1 4 k b 的d n a 片段上 圖1 2 其中i l i s z 是編碼乳鏈菌肽前 體的結(jié)構(gòu)基因 1 1 i s i i l i s f l l i s e 和i l i s g 與菌體自身免疫有關(guān) n i s r 和n i s k 是 雙組分調(diào)節(jié)基因 其余是與乳鏈菌肽成熟有關(guān)的基因 依據(jù)n i s i i l 生物合成基因的 遺傳分析的結(jié)果 勾畫出了n i s i n 生物合成的模型 l l i s p 將前導(dǎo)序列切除 釋放有 活性的n i s i l l 分子 圖1 3 n i s i n 的生物合成 首先由胞外的信號激活位于膜上 的組氨酸激酶 由i l i s k 編碼 i l i s k 基因自身磷酸化作用之后 轉(zhuǎn)移磷酸基到相 關(guān)的調(diào)節(jié)因子 1 1 i s r n i s r 將前肽分子調(diào)節(jié)到位于膜上的修飾復(fù)合蛋白質(zhì) n i s b 和i l i s c 進(jìn)行修飾 修飾肽與轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白 n i s t 相結(jié)合 將修飾肽通過膜的轉(zhuǎn)運(yùn) 附在膜外表面的1 1 i s p 將前導(dǎo)序列切除 釋放有活性的n i s i n 分子 i l 仉1 4 喃 箍西曩卜l 螂i 赫 m 岫t k 啪 一 娃硇鼓 一 虞柚畸 7 坼枷4 粥嗷搿橢貓2 4 j2 由認(rèn) 膏冀疊 膏魚魔鼉自 蕾囊愛 圖1 2n i s 矗基因簇的結(jié)構(gòu)示意圖1 1 習(xí) f i 9 1 2s c h e m a n c 他p 懈蚰t a 6 0 no f t h eo r g a i 翻t i 仰o ft h en i s i ng e n ed u s t 盯 一一 一一v i 工蹬1 3 等引 之目蹬l 一二 r v 酉 p r e p c p l i d c r 圖l 3n i s i n 的生物合成模型1 1 5 l f i g l 3b i o s y n t h 髂i sm o d e lo fn i s i 黑龍江大學(xué)碩士學(xué)位論文 1 1 4nisin 的性質(zhì) 1 1 4 1nisin 抑菌性 n i s i n 主要抑制大部分g 菌 特別是細(xì)菌的芽孢 n i s i n 能抑制葡萄球菌屬 鏈 球菌屬 小球菌屬和乳桿菌屬的某些菌種 抑制大部分梭菌屬和芽孢桿菌屬的芽孢 1 6 1 例如能有效抑制肉毒梭狀芽孢桿菌 金黃色葡萄球菌 溶血性鏈球菌 枯草 芽孢桿菌 嗜熱脂肪芽孢桿菌等引起的食品腐敗 早期的研究認(rèn)為 n i s i i l 一般對 霉菌 酵母菌和g 一菌是無效的 但近期的研究表明 在一定條件下 如冷凍 加 熱 降低p h 和e d t a 處理 一些曠菌 如沙門氏菌 大腸桿菌 假單胞菌等 對n i s i i l 敏感 表l 2 n i s i n 的抑菌譜0 1 7 l t a m e 1 2a n 6 b a c t e r i a is p 鉀t r u mo fn i s i n 試驗(yàn)菌株 i d i c a t o rs t r a i n s n i s i n 抑菌圈直徑 m m d i a m e t e ro fi n b i b i t i o nz o n e b a c i i l u ss u b t i l i sd b l 0 4 b a c 1 1 u sp u m i l u sa s l 9 4 0 b a c i l l u ss l r a r o t h e m o p h 釘u sc u 2l m i c r o c o c c u sf l a v u sn i c b 816 6 c o d r n e b a 咖耐啪g l u t 鋤i c u n 出9 l a c t o b a c i l l u sp l a n t a 兀 1 1 1a s1 5 5 5 7 l a c t o c o c c u sc a s e ia s1 5 3 9 l a c t o c o c c u sl a c t i sm gl614 i a c t o c o c c u sl a c t i sa t c c l l 4 5 4 l a c t o c o c c u sl a c t i s7 9 6 2 e s c h e r i c h i ac o l id h 5a s a h n o n e l l ae n t e r i l d i sl t 2 s a c c h a r o m y c e sc c r e v i s i a ea s 2l8 2 g e o t r i c h u mc a n d i d u ma s2 10 8 0 抑茵直徑d i a m e t e r o f i n b i b i t i o n 趵n e m m 1 0 o 1 5 o 1 5 1 2 0 0 卅 2 0 o 沒有抑茸作用 什 卅 一 卅 什 卅 第1 蘋前言 n i s i n 對g 菌營養(yǎng)細(xì)胞和芽孢有不同的抗菌機(jī)理 對營養(yǎng)細(xì)胞的抗菌機(jī)理的看 法有兩種 一種觀點(diǎn)認(rèn)為 n i s i l l 吸附于細(xì)胞膜上 可以抑制細(xì)胞壁中肽聚糖的生 物合成 使細(xì)胞膜和磷脂化合物的合成受阻 導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)外泄 引起細(xì)胞裂 解 另一觀點(diǎn)認(rèn)為n i s i n 的抗菌機(jī)理與d h a 和d h b 密切相關(guān) 1 8 1 因?yàn)閚 i s i l l 中的 d h a 和d 皿能夠與敏感菌株細(xì)胞膜中某些酶的巰基發(fā)生作用 釋放細(xì)胞質(zhì) 造 成敏感細(xì)胞裂解 n i s i n 對芽孢的作用是在其萌發(fā)前期及膨脹期破壞其膜 以抑制 其發(fā)芽過程 1 1 4 2n i s i n 的溶解性與穩(wěn)定性 n i s i n 是一種白色易流動的粉末 使用時需溶于水或液體中 n i s i i l 的溶解度主 要取決于溶液的p h 值 在p h 值較低的情況下 溶解性較好 其溶解度隨p h 值的 降低而升高 p h 5 0 時溶解度為4 0 9 6 p h 為2 5 時溶解度為1 2 1 9 1 n i s i n 在中 性和堿性條件下幾乎不溶解 所以在應(yīng)用時 一般先用0 0 2 m 鹽酸溶解 再加入 到食品中 n i s 證的穩(wěn)定性主要取決于溫度 p h 值 基質(zhì)等因素 n i s i n 在酸性條件下呈 現(xiàn)最大的穩(wěn)定性 隨著p h 的升高其穩(wěn)定性大大降低 在p h 為2 o 或更低的稀鹽 酸中 經(jīng)1 1 5 6 高壓滅菌 仍能穩(wěn)定存在 在p h 為5 時 其活力損失4 0 在p h 為9 8 時其活力損失超過9 0 在一定溫度范圍內(nèi) 隨著溫度的升高 它的活性喪 失增加 當(dāng)n i s i i l 加入到食品中 則受到介質(zhì)的保護(hù) 一些大分子食物如牛奶 肉 湯等可使其穩(wěn)定性大大增強(qiáng) 另外 n i s i n 的穩(wěn)定性還與熱處理時間 食品保藏的 溫度及時間等有關(guān) 2 0 1 1 4 3n is i n 的安全性 n i s i n 對蛋白酶特別敏感 在消化道中很快被旺一胰凝乳蛋白酶分解 它對人體 基本無毒性 也不與醫(yī)用抗生素產(chǎn)生交叉抗藥性 能在腸道中無害的降解 對n i s i n 的毒性 致癌性 存活性 再生性 血液化學(xué) 腎功能 應(yīng)激反應(yīng)以及動物器官 病毒學(xué)等生物學(xué)研究證明 n i s i n 是安全的 2 1 9 9 4 年 f a o 陽o 規(guī)定其最大 耐受值為3 3 0 0 0 i l j 瓜g 半致死計量為7 9 l g 黑龍江大學(xué)碩士學(xué)位論文 1 1 4 4nisin 的作用模式 n i s 血抑菌作用機(jī)理尚未完全清楚 唯一可以肯定的是n i s i n 的作用位點(diǎn)是敏 感菌株的細(xì)胞膜 目前最為合理的學(xué)說是 孔道形成模型 該學(xué)說認(rèn)為n i s h l 孔道的形成有 桶板 和 楔入 兩種模式 兩種模式都認(rèn)為n i s i n 最初通過一定 程度的經(jīng)典相互作用于靶細(xì)胞膜結(jié)合 質(zhì)子動勢的成分增強(qiáng)插入作用 桶板模式 或作為引起插入作用的沒接 楔入模式 在兩種模式中多個n i s i l l 分子排列在孔 道的周圍 n i s i l l 的疏水的側(cè)面朝向脂質(zhì)雙層膜 n i s i l l 的親水側(cè)面軍朝向孔道的內(nèi) 腔 桶板 模式認(rèn)為n i s i n 屬于通過 桶一板 機(jī)制起作用的細(xì)胞通道形成蛋白 n i s i n 通過與膜磷脂的靜電作用在膜表面聚集 n i s i i l 的出現(xiàn)引起該區(qū)域磷脂局部移 位 導(dǎo)致細(xì)胞膜明顯變薄 n i s i l l 分子以電勢依賴方式插入脂質(zhì)膜 通過多個分子 與膜作用聚集而形成孔道 有直接證據(jù)表明n i s i l l 的c 末端插入脂質(zhì)雙層膜的疏 水核心 這與n i s i n 物理化學(xué)性質(zhì)的推論吻合 也有研究認(rèn)為主要是n i s i n 分子的 c 末端插入脂相 而c 末端部分是造成n i s i n 與目標(biāo)膜結(jié)合的原因 楔入 模式認(rèn)為n i s i n 擔(dān)當(dāng)陰離子載體 1 0 n o p h o r e 孔道的形成是山于與 n i s i l l 分子相結(jié)合的脂質(zhì)雙層膜的局部擾動引起的 然后n i s i n 通過p 姍的成分被 引入膜內(nèi) 形成多n i s i l l 分子的楔形孔 n i s i l l 分子相對于脂質(zhì)頭部基團(tuán)的方位小 變 因而n i s i n 不與膜的疏水核心相連接 而是n i s i i l 的疏水殘基淺淺地插入脂質(zhì) 體雙層膜的外葉 在 楔一孔 模式中 帶正電的n i s i n 分子與目標(biāo)細(xì)胞膜上陰性 磷脂間最初的靜電相互作用 膜結(jié)合和孔道形成所需的相互作用等仍末研究清楚 1 2nisin 的應(yīng)用 n i s i n 不但在乳制品 灌裝食品 酒精飲料中大量應(yīng)用 在肉制品中的應(yīng)用也 日趨廣泛 引起肉制品腐敗的細(xì)菌相當(dāng)多 而且這些細(xì)菌多屬于耐熱性病原菌 普通的加熱方式難以將他們殺死 殘余的細(xì)菌常引起肉制品的腐敗 造成肉制品 腐敗的大多數(shù)細(xì)菌 n i s i n 皆能有效抑制 故可用于肉類 魚類制品的防腐保鮮 延長食品的貨架期 與其他鹽 鰲合劑 防腐劑復(fù)配效果更佳 3 l j 6 第l 章前言 1 2 1 在肉制品中的應(yīng)用 傳統(tǒng)的火腿 熏肉和香腸產(chǎn)生中 普遍使用亞硝酸鹽 硝酸鹽等發(fā)色劑來產(chǎn) 生典型的腌制紅色和腌制風(fēng)味 并抑制肉毒梭狀芽孢桿菌的生長 但這些添加劑 同時對人體具有潛在的致癌危險 n i s i i l 能有效控制肉制品中微生物的生長 尤其 是抑制產(chǎn)生毒素的肉毒梭狀芽孢桿菌的活性 并且n i s i i l 本身呈酸性 能降低周圍 介質(zhì)的p h 值 因而能降低殘留的亞硝酸鹽的含量 減少亞硝胺的形成惻 n i s i i l 可作為一種有效的替代物 減少火腿中發(fā)色劑的用量 另外 在加工過程中 過 分的熱處理會明顯改變?nèi)庵破返馁|(zhì)地及外觀 加入n i s i n 后僅需4 5 的熱處理即可 延長其貯存期 孔保華等 1 9 9 7 將n i s i n 添加于紅腸中可顯著降低細(xì)菌總數(shù) 并 延長產(chǎn)品保存期 3 2 1 袁秋萍 1 9 9 8 等研究表明 在香腸中n i s 洫添加量為0 3 9 k g 絕大多數(shù)的革蘭氏陽性菌受到抑制 而且產(chǎn)品色 香 味不受影響 豬肉絲中添加 o 4 8 9 k gn i 血 可取代山梨酸鉀作防腐劑 并能提高產(chǎn)品質(zhì)量 羅欣等將n i 妣 首次用于牛肉冷卻肉的保鮮p 3 1 還連棟 2 0 0 0 等將n i s 訪用于扒雞的生產(chǎn) 1 7 1 研 究表明 添加n i s i n 可降低殺菌溫度 保質(zhì)期達(dá)半年以上 并且使扒雞的口感得到 改善 1 2 2 在乳制品中的應(yīng)用 乳制品營養(yǎng)豐富 極易腐敗變質(zhì) 經(jīng)巴氏滅菌和冷藏可延長保存期 但其中 肉毒梭狀芽孢桿菌仍能存活 并產(chǎn)生一定毒素 n i s i n 可用于巴氏滅菌牛奶 添加 量為3 0 5 0 m g k g 通常在3 5 下產(chǎn)品貨架期可延長一倍 罐裝煉乳中添加8 0 1 0o f i l g k g 的n i s i i l 能減少10 i i l i n 滅菌時間 u h t 奶中添加2o i i l g k g 的n i s i n 能完 全抑制滅菌乳中嗜熱細(xì)菌芽孢的生長 3 4 1 郭清泉等通過試驗(yàn)證明 添加4 0 i u l l 的n i s i i l 于酸奶中 將酸奶的后酸化推遲了3 天 且菌數(shù)保持在1 0 7 個仙以上 而且感官質(zhì)量良好 3 5 黑龍江大學(xué)碩士學(xué)位論文 1 2 3 在罐頭制品中的應(yīng)用 n i s i n 在酸性條件下易溶 穩(wěn)定 抑菌活力也高 可用于高酸性 p h 4 6 罐頭 的保鮮 如西紅柿罐頭中 添加n i s i n 可防止因耐酸的g 菌群如巴氏梭菌 浸淋 芽孢桿菌引起的腐敗 添加量一般為1 0 0 2 0 0 i u g 在低酸性 p h 4 6 罐頭如馬 鈴薯 蘑菇 水果罐頭中 即使經(jīng)高熱處理 仍有一些嗜熱菌的芽孢幸存 以致 引起罐頭的腐敗 并且高熱處理對食品的感官質(zhì)量有一定影響 添加適量的n i s i l l 不僅可以有效地抑制芽孢的生長 還可減少罐頭的熱處理時間 保持其新鮮度 并延長保存期 錢平等采用沸水殺菌和添加n i s i n 相結(jié)合的方法 對蔬菜罐頭進(jìn)行 殺菌 結(jié)果表明 經(jīng)過處理的罐頭感官特性大為改善 且在室溫下貯藏期達(dá)到兩 年f 3 6 1 2 4 在醬菜中的應(yīng)用 瓶裝醬菜是可供長期貯存的方便食品 瓶裝醬菜一般采用巴氏滅菌 殘存的 細(xì)菌主要為梭狀芽孢菌及少數(shù)耐熱的g 菌 傳統(tǒng)的抑制雜菌的方法主要依賴于產(chǎn) 品的高滲透壓 高鹽 高糖 低氧環(huán)境及添加化學(xué)防腐劑 目前 各類醬菜中 含鹽量偏高 約在1 0 2 0 之間 但高鹽食品易誘發(fā)高血壓等疾病 加入1 0 0 m g k g n i s i n 可抑制雜菌生長 并使鹽的濃度下降為7 9 由于一些國家在食品中不準(zhǔn) 使用苯甲酸鈉 所以n i s i n 用于瓶裝醬菜出口 具有現(xiàn)實(shí)意義 1 2 5 在酒精飲料中的應(yīng)用 腐敗乳酸菌對n i s i i l 敏感 但酵母幾乎不受其影響 因此 n i s i n 可與酵母一 起在生產(chǎn)啤酒 果酒 烈性乙醇等酒精飲料時加入 用來抑制g 菌 啤酒生產(chǎn)中 易受乳桿菌和啤酒片球菌的污染 發(fā)生混濁 變酸 發(fā)粘等現(xiàn)象 o g d e n 等 1 9 8 5 用平板打孔法檢測得出 啤酒常見腐敗菌幾乎均能被1 0 0 i u i i l ln i s i n 所抑制 3 7 捌 添加n i s i n 的啤酒 可以降低巴氏滅菌的時間和溫度 并能延長啤酒 尤其是非巴 氏滅菌和瓶裝啤酒的貨架期 對照不加n i s i n 的啤酒 存放期延長了一倍的時間 第1 章前言 r a d l e r 1 9 8 1 曾把n i s i i l 應(yīng)用于白酒釀造中 有效地阻礙了腸膜狀明串珠菌 啤 酒片球菌和乳酸桿菌的生長 防止了雜菌的污染 3 9 1 1 2 6 在其它方面應(yīng)用 n i s i n 也可用于焙烤食品中 以防止蠟狀芽孢桿菌生長 用n i s i n 作防腐劑 在制作烤餅的面團(tuán)中 添加不同濃度的n i s i n 作試驗(yàn) 結(jié)果顯示 n i s i i l 添加量為 6 2 5 p g g 即可有效地抑制蠟狀芽孢桿菌的生長 n i s i i l 還可用于對n i s i l l 不敏感的 微生物發(fā)酵過程中 以防止革蘭氏陽性菌的污染 如單細(xì)胞蛋白 有機(jī)酸 氨基 酸和維生素等工業(yè)發(fā)酵過程h 近年來 新的研究發(fā)現(xiàn)證實(shí)n i s i n 和萬古霉素有 相同的作用位點(diǎn) 特別是以n i s i n 為主要形式的羊毛硫細(xì)菌素家族在治療老鼠葡萄 球菌引起的傳染性疾病和人類的痤瘡上所取得的成功 致使n i s i n 在醫(yī)藥方面的作 用又重新引起了人們的關(guān)注 4 2 1 3nisin 的國內(nèi)外需求 從產(chǎn)銷規(guī)模看 1 9 8 8 年全球食品添加劑市場的總產(chǎn)值為1 5 0 億美元 2 0 0 0 年 增加到1 6 0 億美元 到2 0 0 3 年 食品添加劑全球銷售額達(dá)2 0 0 億美元 與1 9 8 8 年相比 增長了3 3 3 3 在我國 2 0 0 0 2 0 0 4 年間 國內(nèi)食品工業(yè)迅速發(fā)展 工業(yè)產(chǎn)值年平均增長率在 2 3 左右 食品工業(yè)的快速發(fā)展 造就了食品防腐添加劑行業(yè)的高速發(fā)展 目前食 品防腐添加劑已經(jīng)進(jìn)入到糧油 肉禽 果蔬加工各領(lǐng)域 包括飲料 調(diào)料 釀造 甜食 面食 乳品 營養(yǎng)保健品等各工業(yè)部門 并進(jìn)入了尋常百姓的一日三餐 2 0 0 0 2 0 0 4 年間國內(nèi)食品添加劑銷售額平均增長速度為1 7 1 9 9 8 年國內(nèi)食品添加 劑產(chǎn)量只有1 3 7 4 萬噸 2 0 0 4 年飆升至3 3 4 萬噸 國內(nèi)銷售額也從1 9 9 9 年的1 7 0 億元增長到2 0 0 4 年的3 3 5 億元 2 0 0 5 年已經(jīng)達(dá)到3 8 0 億元的規(guī)模 而隨著國內(nèi)農(nóng) 產(chǎn)品深加工的需要 并綜合考慮我國食品工業(yè)的發(fā)展速度 新技術(shù)的推動以及消 費(fèi)者對綠色有機(jī)食品消費(fèi)增加的消費(fèi)趨勢等眾多因素的影響 我國食品防腐添加 劑在未來的很長一段時間都還將呈現(xiàn)出快速增長的勢頭 黑龍江大學(xué)碩士學(xué)位論文 1 4nisin 發(fā)酵生產(chǎn)的研究現(xiàn)狀 1 4 1nisin 代謝的動力學(xué)模型 n i s i n 的生產(chǎn)是和生長密切相關(guān) 它通常發(fā)生在整個生長階段 從新陳代謝的 角度看 n i s i n 通常被認(rèn)為是基礎(chǔ)代謝物 也就是說 產(chǎn)率僅依賴生長率 但即使 n i s i n 的生產(chǎn)和生長相聯(lián)系 由于許多影響其生產(chǎn)和吸附的因子之間的相互作用 細(xì)胞達(dá)到最大生物量時并不一定會使n i s i l l 有最大產(chǎn)量 這可通過細(xì)菌素積累模型 方程式1 進(jìn)行說明 y p a y b x 1 式中 y p 和y x 分別指細(xì)菌素的產(chǎn)率和菌體的生長率 a 和b 是需要在試驗(yàn)中確定的參數(shù) 將 1 式變形 即得 y p a y x b 2 生物代謝可以分為3 類 基礎(chǔ)代謝 當(dāng)b 0 時 細(xì)菌素產(chǎn)率僅由菌體生長率所決定 二級代謝 當(dāng)a o 時 細(xì)菌素產(chǎn)率僅由菌體數(shù)量所決定 綜合代謝 當(dāng)b o a o 時 細(xì)菌素產(chǎn)率由菌體生長率和數(shù)量共同決定 4 3 1 對于某些細(xì)菌素而言 產(chǎn)率和細(xì)胞的生長率確實(shí)是呈近似的線性關(guān)系的 也 就是說 它們是近似符合基礎(chǔ)代謝的 但是 人們觀察到 不論是連續(xù)生產(chǎn)還是分批 間歇發(fā)酵 n i s i n 的產(chǎn)率和細(xì)胞的生長的非線性關(guān)系非常明顯 分批發(fā)酵中 菌體 指數(shù)生長階段后期 n i s i n 的合成增加 顯然和細(xì)胞生長不一致 由于m s 基因在 指數(shù)生長初期就有表達(dá) 因此n i s i n 產(chǎn)量在生長后期的增長 是基于碳源對n i s i i l 前體修飾基因的表達(dá)與活性調(diào)節(jié) 第1 章前言 1 4 2 培養(yǎng)條件對 sin 發(fā)酵的影響 研究發(fā)現(xiàn)除n i s i n 產(chǎn)生菌性能 培養(yǎng)基成分 碳源 氮源 磷源和陽離子 發(fā)酵條件 時間 p h 溫度 攪拌 通風(fēng) 發(fā)酵類型 分批發(fā)酵 連續(xù)發(fā)酵 等許多因素對n i s i n 的生成量均有影響f 4 4 1 楊博等曾以乳酸乳酸球菌 a c 手d c d c c 船j a c 芒如s 帕印 j a c 芒婦 y 一7 2 為研 究材料 令y 一7 2 的發(fā)酵培養(yǎng)基在不同的溫度下進(jìn)行發(fā)酵 以發(fā)酵液o d 值不再增 加為發(fā)酵終了的標(biāo)志 測發(fā)酵液的效價 約在3 0 時發(fā)酵液效價和菌體產(chǎn)生量均 達(dá)最大值 高于此溫度 菌體生長量急速下降 發(fā)酵液效價也隨之下降 原因可 能是因?yàn)樵诟邷貢r菌體產(chǎn)酸快從而抑制了菌體生長 乳鏈菌肽的合成也受到了抑 制f 4 5 溫度達(dá)到4 5 時菌體于此溫度發(fā)酵速度慢且發(fā)酵不能生長 乳酸鏈球菌是同型發(fā)酵菌種 在其生長過程中會產(chǎn)生大量的乳酸導(dǎo)致p h 值的 大幅下降 雖然較低的p h 值有利于n i s i n 的合成和從菌體上解離 但高的p h 值 有利于茵體的生長 因此在發(fā)酵過程中控制p h 值在 個合理的范圍內(nèi)能過得到最 高的產(chǎn)量 另外 p h 值對n i s i n 的效價也有影響 侯革飛等研究表明n i s i n 的活性與p h 值成反比 但這很可能是由于n i s i n 在水中的溶解度受p h 值的影響引起的 蚓 h i r o s h is h i m i z i l 等將婦f o c o 搬加出和腳e m 叼 c 船撐搬搿婦以凇共同培養(yǎng) 通過 尉z 緲廠d 眇甜的代謝控制發(fā)酵p h 值 與流加堿控制p h 值比較得到了更高的n i s i i l 產(chǎn)量1 3 7 1 m l c 加等人提出了一個假設(shè) 即真正決定n i s i n 產(chǎn)量的是p h 值的下降 梯度 p h 這個梯度越陡 對生產(chǎn)越有利 生產(chǎn)可以通過將最后穩(wěn)定的酸性p h 反復(fù) 堿化至初始p h 中間的間隔時間大概是6 小時 而使n i s i n 產(chǎn)量翻倍 這個假設(shè)在其 用菌株i im l b l 1 3 進(jìn)行的相關(guān)的對比試驗(yàn)中得到了比較吻合的結(jié)果 但這個結(jié)論 是否對其它菌株也有效 還需要進(jìn)一步的研究 在決定最優(yōu)的p h 問題上 大多數(shù)認(rèn) 為p h 應(yīng)在5 8 6 o 之間對于恒定p h 值生產(chǎn)n i s h l 是合適的 這通常低于最佳生長 p h 但是這個p h 值范圍不能推廣到所有其他細(xì)菌素的生產(chǎn) 比如有幾種細(xì)菌素的 生產(chǎn)只有在低p h 5 o 處才最佳 這也是隨菌株或菌種而定的 而在m l c a b 0 的反 黑龍江大學(xué)碩士學(xué)位論文 復(fù)堿化的生產(chǎn)方法中 起始p h 為6 5 7 5 時 n i s i n 的生物合成達(dá)為最大 4 7 1 張秀明等在對上口c 幻 c c 姍 口c 廊n 3 0 2 進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)時 最佳的接種量為3 最佳發(fā)酵時間為2 1 h 但由于菌種間的差異 但由于菌種的差異 不同菌種的代時 和接種量對產(chǎn)量的影響是不同的 1 5 微生物的代謝調(diào)控 微生物的代謝可分為初級和次級代謝 為了在生長勢頭減緩后能維持一定的 碳流 以便一旦條件有利于生長時可以隨時恢復(fù)生長 細(xì)胞將碳流流向次級代謝 產(chǎn)物的合成 這樣做也有利于細(xì)胞維持其生命活動的要素 如關(guān)鍵蛋白質(zhì)的周轉(zhuǎn) 的修補(bǔ)和的維護(hù)等 初級代謝與細(xì)胞生存相關(guān) 涉及到產(chǎn)能代謝和耗能代謝 次 級代謝是細(xì)胞為了避免在初級代謝過程中某種中間代謝產(chǎn)物積累所造成的不利作 用而產(chǎn)生的一類有利于細(xì)胞生存的代謝類型 初級代謝產(chǎn)物如糖衍生物 核苷酸 和脂肪酸等單體以及由它們組成的大分子物質(zhì)如多糖 核酸和脂類等通常都是細(xì) 胞生存不可缺少的物質(zhì)次級代謝產(chǎn)物不是細(xì)胞生存所必需的物質(zhì) 它們通常被細(xì) 胞分泌至胞外 并在同其它生物的生存競爭中起著重要作用 初級代謝是次級代 謝的基礎(chǔ) 它為次級代謝產(chǎn)物合成提供所需要的能量和前體物質(zhì) 4 引 次級代謝是 初級代謝在特定條件下的發(fā)展 是為了避免初級代謝過程中某種中間體或產(chǎn)物過 量積累對細(xì)胞產(chǎn)生毒害作用或是為了提高細(xì)胞相對于其它競爭物種的生存優(yōu)勢 代謝過程調(diào)控目的是增加限速步驟的代謝通量 通過研究產(chǎn)物的代謝途徑 能得知或預(yù)知產(chǎn)物生物合成過程 然后運(yùn)用遺傳操作方法或改變培養(yǎng)環(huán)境使流向 產(chǎn)物合成的代謝流增加 從而使產(chǎn)物的產(chǎn)率大幅度提高 同時減少分叉代謝途徑 的代謝通量即可以提高目標(biāo)代謝途徑的碳流量 細(xì)胞的代謝通量除了直接由胞內(nèi) 酶決定之外 還間接受到了轉(zhuǎn)錄與轉(zhuǎn)譯的控制 具體表現(xiàn)在五個不同的水平上轉(zhuǎn) 錄水平控制降解翻譯水平蛋白質(zhì)激活或失活異構(gòu)酶調(diào)節(jié) 胞內(nèi)遺傳物質(zhì)或培養(yǎng)環(huán) 境因子的變化將導(dǎo)致酶活力或酶量的變化 代謝物濃度也隨之改變 這進(jìn)一步影 響到調(diào)節(jié)蛋白 致使在轉(zhuǎn)錄水平及蛋白組水平發(fā)生級聯(lián)效應(yīng) 通常認(rèn)為目標(biāo)產(chǎn)物 的產(chǎn)率偏低是由于相關(guān)酶系或酶級聯(lián)反應(yīng)限制了產(chǎn)物的合成能力 盡管與特定產(chǎn) 1 2 一 第l 章前言 物合成途徑相匹配的全部酶活性控制著產(chǎn)物的合成速率 但產(chǎn)物的最終產(chǎn)量卻是 各種中間代謝物分支點(diǎn)處流量分配的綜合結(jié)果 細(xì)胞內(nèi)同時進(jìn)行的數(shù)千個生化反 應(yīng)構(gòu)成了錯綜復(fù)雜的細(xì)胞代謝網(wǎng)