（微生物學(xué)專業(yè)論文）酶法生產(chǎn)β丙氨酸的研究.pdf

浙江工業(yè)大學(xué) 學(xué)位論文原創(chuàng)性聲明 j l 掣唧i 吵噦鬯1 鴛l 掣邋 y 17 7 6 15 8 重聲明 所提交的學(xué)位論文是本人在導(dǎo)師的指導(dǎo)下 獨(dú)立進(jìn)行 取得的研究成果 除文中已經(jīng)加以標(biāo)注引用的內(nèi)容外 本論文 不包含其他個(gè)人或集體已經(jīng)發(fā)表或撰寫(xiě)過(guò)的研究成果 也不含為獲得浙 江工業(yè)大學(xué)或其它教育機(jī)構(gòu)的學(xué)位證書(shū)而使用過(guò)的材料 對(duì)本文的研究作 出重要貢獻(xiàn)的個(gè)人和集體 均己在文中以明確方式標(biāo)明 本人承擔(dān)本聲明 的法律責(zé)任 作者簽名 恢每l 日期 洲 年爹月 占日 學(xué)位論文版權(quán)使用授權(quán)書(shū) 本學(xué)位論文作者完全了解學(xué)校有關(guān)保留 使用學(xué)位論文的規(guī)定 同意 學(xué)校保留并向國(guó)家有關(guān)部門或機(jī)構(gòu)送交論文的復(fù)印件和電子版 允許論文 被查閱和借閱 本人授權(quán)浙江工業(yè)大學(xué)可以將本學(xué)位論文的全部或部分內(nèi) 容編入有關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行檢索 可以采用影印 縮印或掃描等復(fù)制手段保存 和匯編本學(xué)位論文 本學(xué)位論文屬于 1 保密口 在年解密后適用本授權(quán)書(shū) 2 不保密昭 請(qǐng)?jiān)谝陨舷鄳?yīng)方框內(nèi)打 作者簽名 導(dǎo)師簽名 日期 耐 年y 月彤日 日期 妒卜年y 月刃日 抄 一矽7 黔如 洙犯 2 0 1 0 浙江丁業(yè)大學(xué)研究生碩上畢業(yè)論文 s t u d y0 ne n z y m a t i cp r o d u c t l 0 n o f1 3 l a l a n e a bs t r a c t i nt h i sp a p e r t h ep 口豫dg e n eo fec d 療b l 2 1 d e 3 p e t 2 8 b 中日 d e n c o d i n gt h el a s p a n a t e0 一d e c a r b o x y l a s e w a s 鋤p l i f i e df 如mb y p c ra n dc l o n e di n t ot h ee x p i e s s i o np l a s m i dp e t 2 8 c t h er e c o m b i n a n t p l a s m i dw a st h e nt r a n s f o n n e di m oe 圳b l 21 d e 3 a n ds c r e e n e do n t h er e s i s t a n tp l a t ew i t h5 0p g m lk a n 鋤y c i n l a s p a r t a t e0 d e c a r b o x y l a s e c o u l db ee m c i e n t l ye x p r e s s e di ne n g i n e e r e ds t r a i nec d fb l 2 l d e 3 p e t 2 8 c 刪刀db yl a c t o s ei n d u c t i o n t h ev a l u eo fe n z y m a t i ca c t i v i t y w a s9 2 5u l t h ep a n dw a sc o r r e c t l ye x p r e s s e db ys d s p a g ea n a l y s i s b u ti th a dap r o b l e mt h a tt h e 兀 一s u b u n i tw a s n ts e l o c l e a v a g e dc o m p l e t e l y t h es 鋤ew i t ht h es t r a i no f ec d 廳b l 21 d e 3 p e t 2 8 b 陽(yáng)玎d t h eo p t i m a lc o n d i t i o nf o r p r o d u c i n g p a n dw e i ea sf o l l o w s i n c u b a t i o na t3 0 12g ll a c t o s ei n d u c t i o na r e rc u l t u r ef o r3 5h i n c u b a t i o nt i m ew a s2 0h a n dt h eo p t i m u mi n i t i a li n d u c t i o np hv a l u eo f l bm e d i aw a s5 5 u n d e rt h e s ec o n d i t i o n s t h er e c o m b i n a t i o np a n d c h r o m a t o g r 印h yo fn ia f j f i n i 夠t h es p e c i f i ca c t i v i t yw a s 2 0 15u m g 7 1 1 1 e y i e l dw a s6 8 3 4 a n dm ep u r e n e s so fp a n dw a sh i 曲e rt h a n9 5 r e a s e r c ho fe m 拶m a t i cp r o p e r t i e ss h o w e dt h a tm eo p t i m a lt e m p e r a t u r e a n dp hw e r e4 5 a n d8 o t h i sp a n d 張ss t a b l eb e t w e e np h5 o 8 0 m e t a li o nh a dn oe 脆c to na c t i v 時(shí)o fp 獅d t h eh i g h e rt e m p e r a t u r eo f w a t e r b a t hc o u l di m p r o v et h es e l f c l e a v a g er a t e w 亂e rb a t ho f7 0 f o r 1 2h t h ea c t i v i t yo f p a n di n c r e a s e db y3 6 0 ec d 廳b l 21 d e 3 p e t 28 b 一p a n d w a si m m o b i l i z e dw i t h c a l c i u ma l g i n a t e a n dt h eo p t i m u me m b e d i n gc o n d i t i o nw e r ea sf o l l o w s 1o c e l l se n t r 印p e db y3 a l g i n a t e t 1 1 e o p t i m a lg e l l i n ga g e n ta n d s u b s t r a c tw e r ec a c l 2a r l d a s p k a f b e rt h e i m m o b i l i z e dc e l l sw e r e u t i l i z e df o r5b a t c h e si nc o m i n u o u sc o n v e r s i o n t h ei m m o b i l i z e dp a i r t i c l e w a sd is s 0 1 v eg r a d u a l l y k e yw o r d s e n g i n e e r e ds t r a i n f e r m e n t a t i o n p u r i f i c a t i o n c e l l i m m o b i l i z a t i o n p a l a n i n e 第一章綜述 1 1 1b 一丙氨酸簡(jiǎn)介 1 1 2 丙酮酰基依賴型氨基酸脫羧酶 l 1 2 1 組氨酸脫羧酶簡(jiǎn)介 2 1 2 1 1p r r h i s d c a s e 結(jié)構(gòu) 3 1 2 1 2p r v h i s d c a s e 酶學(xué)性質(zhì)的研究 3 1 2 2 精氨酸脫羧酶簡(jiǎn)介 4 1 2 2 1p r v a r g d c 結(jié)構(gòu) 4 1 2 2 2p r v a r g d c 酶學(xué)性質(zhì)的研究 4 1 2 3l 一天冬氨酸a 一脫羧酶 5 1 2 3 1p a n d 結(jié)構(gòu) 5 1 2 3 2p a n d 酶學(xué)性質(zhì)的研究 6 1 3 細(xì)胞同定化 6 1 3 1 固定化材料應(yīng)具備的條件 7 1 3 2 常見(jiàn)吲定化方法 7 1 3 2 1 吸附法 7 1 3 2 2 包埋法 7 1 3 2 3 共價(jià)結(jié)合法 9 1 3 2 4 交聯(lián)法 9 1 3 2 5 復(fù)合載體l 司定化 9 1 3 2 6 無(wú)載體固定化 1 0 1 3 3 固定化對(duì)微生物生理變化的影響 1 1 1 3 3 1 同定化對(duì)微生物生長(zhǎng)速率的影響 1 1 1 3 3 2 固定化對(duì)微生物活性的影響 1 1 1 3 3 3 同定化細(xì)胞對(duì)有毒抑制物質(zhì)的耐受性 1 1 1 4 選題背景和目的 1 2 參考文獻(xiàn) 1 3 第二章ec d jb l 2 l d e 3 p e t 2 8 c 一冊(cè)加工程菌株構(gòu)建 1 6 2 1 前言 1 6 2 2 材料與方法 1 6 2 2 1 菌種與質(zhì)粒 1 6 2 2 2 儀器與d n a 分析軟件 1 7 2 2 3 主要藥品與試劑 1 7 2 2 3 1 菌株構(gòu)建相關(guān)藥品試劑 1 7 2 2 3 2 試劑 1 8 2 2 4 培養(yǎng)基 1 8 2 2 4 1 活化培養(yǎng)基 1 8 2 2 4 2 液體培養(yǎng)基 1 8 2 2 5 引物 1 8 2 3 實(shí)驗(yàn)方法 1 9 2 0 1 0 浙江工業(yè)大學(xué)研究生碩上畢業(yè)論文 2 3 1ec d jb l 2 1 d e 3 p e t 2 8c 一j 配z 忍口菌株構(gòu)建 1 9 2 3 1 1 菌株構(gòu)建實(shí)驗(yàn)流程 1 9 2 3 2p e t 2 8 c 質(zhì)粒的克隆 2 0 2 3 2 1ec d jd h 5a 感受態(tài)細(xì)胞的制備 2 0 2 3 2 2p e t 2 8 c 質(zhì)粒轉(zhuǎn)化 2 0 2 3 3s d s 堿裂解法制備質(zhì)粒p e t 2 8 c 中量制備 2 1 2 3 3 1s d s 堿裂解法制備質(zhì)粒d n a 2 1 2 3 3 2 聚乙二醇沉淀法純化質(zhì)粒p e t 2 8 c 2 1 2 3 4s d s 堿裂解法制備質(zhì)粒p e t 2 8 b 一腳口 小量制備 2 2 2 3 5 瓊脂糖凝膠電泳 2 2 2 3 6 用p c r 技術(shù)擴(kuò)增p a n d 基因 2 2 2 3 6 1p c r 擴(kuò)增體系 2 2 2 3 6 2p c r 擴(kuò)增條件 2 3 2 3 6 3p c r 擴(kuò)增產(chǎn)物的純化 2 3 2 3 7p c r 產(chǎn)物和p e t 2 8 c 質(zhì)粒的艤酶切 2 3 2 3 7 1 酶切體系 2 3 2 3 7 2 切膠同收 2 4 2 3 8 連接與轉(zhuǎn)化 2 4 2 3 8 1 連接體系 2 4 2 3 8 2ec d jd h 5a 感受態(tài)細(xì)胞的制備及轉(zhuǎn)化 2 5 2 3 9 質(zhì)粒p e t 2 8c 聊加鑒定 2 5 2 3 9 1p c r 鑒定 2 5 2 3 9 2 堿基序列測(cè)定 2 6 2 3 1 0ec 口 jb l 2 1 d e 3 p e t 2 8c 一所眺9 菌株構(gòu)建及酶活力鑒定 2 6 2 3 1 0 1 c d jb l 2 1 d e 3 p e t 2 8c 一胛加菌株構(gòu)建 2 6 2 3 1 0 2 酶活力測(cè)定 2 6 2 3 1 0 3 重組菌株的s d s p a g e 檢測(cè) 2 7 2 4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 2 7 2 4 1 重組表達(dá)質(zhì)粒p e t 2 8 c 一腳汐構(gòu)建 2 7 2 4 2 重組質(zhì)粒p e t 2 8c 一刪鑒定 2 8 2 4 2 1p c r 鑒定 2 8 2 4 2 2 堿基序列測(cè)定 2 9 2 4 3 重組菌株ec d jb l 2 1 d e 3 p e t 2 8c 聊口酶活力檢測(cè) 3 0 2 4 4 重組菌株的s d s p a g e 檢測(cè) 3 1 2 5 實(shí)驗(yàn)小結(jié) 3 3 參考文獻(xiàn) 3 3 第三章菌株培養(yǎng)條件的初步研究 3 4 3 1 前言 3 4 3 2 材料與方法 3 4 3 2 1 菌株 3 4 3 2 2 主要儀器設(shè)備 3 4 3 2 3 主要藥品與試劑 3 5 3 2 4 培養(yǎng)基 3 5 2 3 試驗(yàn)方法 3 5 2 0 1 0 浙江工業(yè)丈學(xué)研究生碩七畢業(yè)論文 3 3 1 菌種斜面活化 3 5 3 3 2 菌種接種子培養(yǎng)基 3 5 3 3 3 搖瓶發(fā)酵條件的優(yōu)化 3 6 3 3 3 1 誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)重組菌株產(chǎn)酶活力的影響 3 6 3 3 3 2 不同乳糖濃度對(duì)重組菌株產(chǎn)酶活力的影響 3 6 3 3 3 3 誘導(dǎo)溫度對(duì)重組菌株產(chǎn)酶活力的影響 3 6 3 3 3 4 不同菌齡對(duì)重組菌株產(chǎn)酶活力的影響 3 6 3 3 3 5 誘導(dǎo)初始p h 值對(duì)重組菌株產(chǎn)酶活力的影響 3 7 3 3 4 酶活定義 3 7 3 4 結(jié)果與討論 3 7 3 4 1 誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)重組菌株產(chǎn)酶活力的影響 3 7 3 4 2 不同乳糖濃度對(duì)重組菌株產(chǎn)酶活力的影響 3 8 3 4 3 誘導(dǎo)溫度對(duì)重組菌株產(chǎn)酶活力的影響 3 9 3 4 4 不同菌齡對(duì)重組菌株產(chǎn)酶活力的影響 4 0 3 4 5 誘導(dǎo)初始p h 值對(duì)重組菌株產(chǎn)酶活力的影響 4 1 3 5 實(shí)驗(yàn)小結(jié) 4 2 參考文獻(xiàn) 4 2 第四章p a n d 的分離純化及酶學(xué)性質(zhì)研究 4 3 4 1 前言 4 3 4 2 材料與方法 4 3 4 2 1 菌株 4 3 4 l2 主要儀器設(shè)備 4 3 4 1 3 主要藥品與試劑 4 4 4 1 3 1 主要藥品 4 4 4 1 3 2 試劑 4 4 4 1 4 培養(yǎng)基 4 5 4 1 4 1 活化培養(yǎng)基 4 5 4 1 4 2 種子培養(yǎng)基 4 5 4 1 4 3 發(fā)酵培養(yǎng)基 4 5 4 1 5p a n d 酶活力測(cè)定 4 5 4 2 實(shí)驗(yàn)方法 4 5 4 2 1 菌株培養(yǎng) 4 6 4 2 1 1 菌種斜面活化 4 6 4 2 1 2 菌種接種子培養(yǎng)基 4 6 4 2 1 3 搖瓶發(fā)酵 4 6 4 2 2p a n d 的純化 4 6 4 2 2 1 菌懸液的制備 4 6 4 2 2 2 超盧波破碎條件的選擇 4 6 4 2 2 3p a n d 的硫酸銨鹽析 4 7 4 2 2 4 脫鹽 4 8 4 2 2 5n i 親和層析純化 4 8 4 2 2 6 脫鹽 4 8 4 2 3p a n d 酶學(xué)性質(zhì)的研究 4 8 4 2 3 1 酶的最適反應(yīng)溫度的選擇 4 8 4 2 5s d s p a g e 檢狽8p a n d 4 3 結(jié)果與討論 4 3 1 超聲波破壁條件的研究 4 3 2 硫酸銨飽和度的選擇 4 3 3p a n d 的分離純化 4 3 3 1 硫酸銨分步鹽析 4 3 3 2 脫鹽 4 3 3 3n i 一親和層析 4 3 3 3p a n d 純化 4 3 4 2 酶的最適反應(yīng)p h 的選擇 4 3 4 3 酶的熱穩(wěn)定性 4 3 4 4 酶的p h 耐受性 4 3 4 5 金屬離子對(duì)酶活力的影響 4 3 5 溫度對(duì)p a n d 自剪切的影響 4 4 實(shí)驗(yàn)小結(jié) 參考文獻(xiàn) 第五章ec d jb l 2 1 d e 3 p e t 2 8 b 一塒徹9 細(xì)胞固定化條件的研究 5 1 前言 5 2 材料與方法 5 2 1 菌株 5 1 2 主要儀器設(shè)備 5 2 3 主要藥品與試荊 5 2 4 培養(yǎng)基 5 2 4 1 活化培養(yǎng)基 5 2 4 2 種子培養(yǎng)基 5 2 4 3 發(fā)酵培養(yǎng)基 5 3 實(shí)驗(yàn)方法 5 3 1 菌株培養(yǎng) 5 3 1 1 菌種斜面活化 5 3 1 2 菌種接種子培養(yǎng)基 5 3 1 3 搖瓶發(fā)酵 5 3 1 4 菌體制備 5 3 2 固定化細(xì)胞性能的評(píng)價(jià) 5 3 2 1 同定化顆粒的機(jī)械強(qiáng)度考察 5 3 2 2 同定化顆粒包埋效果的考察 5 3 2 3 固定化顆粒粘附程度的考察 5 3 2 4 固定化操作難易程度的考察 5 3 3 細(xì)胞同定化 5 3 3 1p v a 包埋法 的的的的冊(cè) 的 匏鼴船弱弱m弱盯盯鼴的叭眈 鋁 以阱融斛阻鉗 硒衢 8 2 0 1 0 浙江工業(yè)大學(xué)研究生碩上畢業(yè)論文 5 3 3 2 海藻酸鈉包埋法 6 7 5 3 4 同定化細(xì)胞轉(zhuǎn)化 6 8 5 3 4 1 同定化細(xì)胞分批轉(zhuǎn)化 6 8 5 3 4 2 固定化細(xì)胞連續(xù)轉(zhuǎn)化 6 8 5 3 5 相關(guān)公式計(jì)算 6 8 5 4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 6 9 5 4 1p v a 不同包埋法比較 6 9 5 4 2 海藻酸鈉包埋法 7 0 5 4 2 1 不同成型劑的選擇 7 1 5 4 2 2 海藻酸鈉濃度的選擇 7 2 5 4 2 3 菌體包埋量的選擇 7 3 5 4 2 4 不同天冬氨酸鹽的選擇 7 4 5 4 3 吲定化細(xì)胞連續(xù)轉(zhuǎn)化 7 5 5 5 實(shí)驗(yàn)小結(jié) 7 6 參考文獻(xiàn) 7 7 第六章總結(jié)與展望 7 9 致謝 8 l 附錄1 高效液相色譜檢測(cè)b 一丙氨酸 8 2 附錄2 考馬斯亮藍(lán)g 一2 5 0 法測(cè)定蛋白質(zhì)含量 8 4 附錄3s d s p a g e 8 6 2 0 1 0 浙江工業(yè)大學(xué)研究生碩 l 畢業(yè)論文 1 1 b 一丙氨酸簡(jiǎn)介 第一章綜述 p 一丙氨酸 p a l a l l i n e p a 1 a 即3 氨基丙酸 3 一a m i n o p r o p a n o i ca c i d 又稱 為p 氨基丙酸 p 絲析氨酸 p 初油氨基酸 p 一丙氨酸的化學(xué)索引號(hào) c a s 為 1 0 7 9 5 9 分子式為c 3 h 7 n 0 2 相對(duì)分子量為8 9 0 9 4 相對(duì)密度為1 4 3 7 p 一丙氨 酸分子結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖1 1 o h 2 州 太c c h h 2 圖1 1p 丙氨酸分子結(jié)構(gòu) f i g 1 1p a l a n i n es 廿w t u r ef o n n u l a b 丙氨酸純品為白色棱狀結(jié)晶或正交雙錐體結(jié)晶 無(wú)毒 略帶甜味 加熱分 解溫度為1 9 7 1 9 8 熔點(diǎn) m p 為2 0 0 1 9 7 1 9 8 p 一丙氨酸溶于水 微溶于 甲醇和乙醇 不溶于乙醚和丙酮 2 5 水溶液中溶解度為5 5 5g 等電點(diǎn)p i 為 6 9 b 丙氨酸晶體常溫時(shí)穩(wěn)定 但在空氣中易吸潮 需干燥保存 1 塒 p 丙氨酸是自然界中唯一存在的p 型氨基酸 它是一種非蛋白氨基酸 1 9 7 2 年由r o s s 和m o n r o e 在尿嘧啶的降解產(chǎn)物中發(fā)現(xiàn) 1 2 丙酮?；蕾囆桶被崦擊让?在活體細(xì)胞內(nèi) 將氨基酸轉(zhuǎn)化為其他有用的物質(zhì) 氨基酸脫羧酶起到了很重 2 0 1 0 浙江工業(yè)大學(xué)研究生碩上畢業(yè)論文 要的作用 5 磷酸吡哆醛 p l p 是最常見(jiàn)的輔基 然而 有些氨基酸脫羧酶不 需要p l p 作為輔基 而是以丙酮?；鳛榇呋钚曰鶊F(tuán) 這些氨基酸脫羧酶被 稱為丙酮?；蕾囆桶被崦擊让?見(jiàn)表1 1 3 j 幾乎所有的丙酮?；蕾囆桶被崦擊让付加? 種不同大小的亞基 0 亞基 和b 亞基 它們是由相應(yīng)的基因表達(dá) 首先形成無(wú)活性的前體7 c 亞基 在特定 的絲氨酸殘基處自剪切加工 形成n 末端具有丙酮?；膬H 亞基和c 末端為 o h 基團(tuán)的p 亞基 s d s p a g e 電泳時(shí) 由于b 亞基分子量很小 很難檢測(cè)到 尤 其是l 天冬氨酸a 脫羧酶的p 亞基 p 亞基分子量?jī)H為2 8k d a 表1 1丙酮?；蕾囆桶被崦擊让该傅拇x作用 t a b l e1 1m e 鉚 o l i cr 0 i e so fp y r u v o y l d e p e n d e n ta m i n o d e c a r b o x y l a u s e 1 2 1l 組氨酸脫羧酶 l 組氨酸脫羧酶 h i s t i d i n ed e c a r b o x y l a s e s e c 4 1 1 2 2 h i s d c a s e h d c 能 催化l 組氨酸脫羧后得到組胺 革蘭氏陰性菌及哺乳動(dòng)物的h i s d c a s e 都需要 p l p 作為輔基 所有革蘭氏陽(yáng)性菌的h i s d c a s e 都是丙酮?；蕾囆兔?目前 人 們對(duì)三口c 幻6 口c 以螂3 0 a 4 6 1 乃加彤療d c o 淞j l l 口卻廳f 螂 7 1 s 護(hù)幼甜朋 步確羅塒 8 三口c 五d 6 口c f z 岱6 材 砌門p f 3 三p 甜c d 胛d j 五d cd p 2 d s9 2 0 4 9 乃臼j z 釅甩d c d c c 甜s 垅 z 比z 博 1 0 等多種p h i s d c a s e 進(jìn)行了研究 其中 研究最早且最多的菌株是三口c d 6 叩f 脅 3 0 a 2 2 0 1 0 浙江t 業(yè)大學(xué)研究生碩十畢業(yè)論文 1 2 1 1p r v h i s d c a s e 結(jié)構(gòu) 最早在三口c 幻6 鐘f 刀姍3 0 a 發(fā)現(xiàn)丙酮酰基依賴型h i s d c a s e p r v h i s d c a s e 4 卅 在最適p h4 8 時(shí) 以六聚體 a p 6 的形式存在 在p h7 0 和低離子濃度時(shí) c c p e a p 3 可逆型相互轉(zhuǎn)變 在低p h 環(huán)境中 會(huì)構(gòu)想發(fā)生改變 來(lái)穩(wěn)定活性位點(diǎn)的一 個(gè)a 螺旋 x 壤f 線分析 兩個(gè) 0 p 3 結(jié)合不緊密 接觸面積很少 相對(duì)來(lái)說(shuō) 三聚 體 a p 3 中的三個(gè)0 p 亞基對(duì)之間結(jié)合緊密 可抵抗高溫及其他有毒物質(zhì) 還發(fā)現(xiàn) 其它菌株具有p r v h i s d c a s e 見(jiàn)表1 2 表1 2 丙酮?；蕾囆徒M氨酸脫羧酶 r a b l e1 2 p y r u v o y l d e p e n d e n th i s d c a s e 1 2 1 2p r v h is d c a s e 酶學(xué)性質(zhì)的研究 p r v h i s d c a s e 專一性以l 組氨酸作為底物 r e s c e ipa 報(bào)道 p h 對(duì) 三日c 幻6 口c f 刀淞3 0 a 的p n r h i s d c a s e 影響比較大 8 在最適p h4 8 時(shí) 酶與底物有 明顯的結(jié)合趨勢(shì) k m 值為o 3m m 在中性或堿性環(huán)境中 酶活力比較低 甚 至無(wú)活力 p h7 0 時(shí)的k m 值為1 0 0m m k o n a g a y ay 等f(wàn) l o 報(bào)道乃砒穢刀d c c 淞 朋 f 口療c 塒中的p r v h i s d c a s e 的最適p h 為4 5 7 o p h4 8 時(shí)v m a x 為1 6 8 燦1 0 l m i n m g k m 值為0 7 4i n m o l 對(duì)溫度不敏感 4 0 水浴2 0m i n 酶活力只 損失2 7 0 水浴2 0m i n 酶活力損失3 5 8 0 水浴2 0m i n 后無(wú)酶活力 如n a b h 4 d 環(huán)絲氨酸 肼 苯肼等可與羰基反應(yīng)得試劑均對(duì)丙酮酰基依賴 型酶有抑制作用 其中羥胺抑制作用最有效 3 2 0 1 0 浙江n t 業(yè)大學(xué)研究生碩上畢業(yè)論文 據(jù)報(bào)道咪唑 組胺等對(duì)p r v h i s d c a l s e 具有競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用 6 l0 1 胍基 尿酸 f l l 對(duì)氯汞苯甲酸 k c n 對(duì)其也有抑制作用 1 5mk c l 或n a c l 溶液可抑制 p r v h i s d c a s e5 0 的酶活力 羽 1 2 2 精氨酸脫羧酶 精氨酸脫羧酶 a 唱i i l i n ed e c a r b o x y l a s e e c 4 1 1 1 9 a 瑪d c 可催化l 精氨 酸產(chǎn)生精胺 用于多胺合成 在細(xì)胞增值和分化中起重要作用 目前 人們對(duì) c 辦z a 穆y 卻辦f 腸p 玎e m d 玎f 口p 1 2 1 庇f i i i 口玎o c d c c z l s a 玎砼a s c 向f 彳 1 3 15 1 丁鋤p r 聊d c d c c s 勛如勛 伽瑚心1 6 1 等菌株的丙酮?；蕾囆途彼崦擊让?p n a 略d c 進(jìn)行研究 1 2 2 1p r v a r g d c 結(jié)構(gòu) p n 挑d c 研究的相對(duì)比較遲 g r a j l 鋤de 等 1 3 人于2 0 0 2 年在壇歷口 z d c c 螂 如 2 儺c 乃f f 菌株中首次發(fā)現(xiàn) p r v a 唱d c 以3 或6 個(gè)0 p 亞基對(duì)形式存在 與 p r v h i s d c a s e 相似 具體亞基結(jié)構(gòu)見(jiàn)表1 3 表1 3 丙酮酰基依賴型精氨酸脫羧酶 t a b l e1 3 p y l l l v o y l d e p e n d e n ta 唱i n j n ed e c a r b o x y l a s e 1 2 2 2p r v a r g d c 酶學(xué)性質(zhì)的研究 p n 一心d c 特異性催化精氨酸和刀豆氨酸 精氨酸類似物 生成精胺和 丫 g u a n i d i n o x p r o p y l 鋤i n e g i l e st n 報(bào)道 1 2 cp p m d 行幻p 中的p a 唱d c 在p h 3 4 時(shí) 酶活力最高 p h1 5 以上時(shí)酶活快速增加 但是在中性及堿性條件下活 性降低 與p r v h i s d c a s e 相似 m 豇玎玎n s c 晟f f p r v 心g d c 具有耐熱性f 1 3 1 2 l 溫浴2 0m i n 還有5 0 活性 4 o o 適 2 m m o 甲基羥胺和硝基芐基胲可以降低cp 挖p 材掰o z 砌p 的p n 一a 瑪d c 酶活力分別 為6 9 和7 5 2m ml a r g i n i n 鋤i d e 可抑制3 3 的酶活力 1 2 5m m l a 瑪i n i n 鋤i d e 及精氨酸甲酯可完全抑制m 歸 z z 儺c j l z 訓(xùn)p a 略d c 酶活力 1 2 3l 一天冬氨酸q 一脫羧酶 l 一天冬氨酸a 一脫羧酶 l a s p a r t a t e 僅一d e c 拍o x y l a s e e c 4 1 1 1 l a s p d c p a n d 又稱l 天冬氨酸1 脫羧酶 該酶以l 一天冬氨酸作為底物 脫去伐 羧基 后產(chǎn)生d 丙氨酸 d a l a n i n e b a l a 所有菌株的l 天冬氨酸a 脫羧酶都是以 丙酮?；鶠榇呋钚曰鶊F(tuán) 尚未發(fā)現(xiàn)以p l p 作為輔基的p a n d 目前人們對(duì) e 強(qiáng)c 辦p 紀(jì)j l z 面c d f 1 7 2 2 1 c r o y 咒e 6 口c 紀(jì) f m 材f 口 咒f c 甜聊 2 3 1 a 4 燼d 6 口c p f 甜 刀 砌6 p 陀甜炳括 2 4 1 脅耽d 6 口c 研乃 f d f 2 5 1 等多種菌株的p a n d 酶進(jìn)行了研究 1 2 3 1p a n d 結(jié)構(gòu) p 棚是一種四聚體酶 r 刪e e 2 等提出大腸桿菌首先形成四個(gè)分子量為 1 3 8m a 的無(wú)活性酶原單體7 c 亞基 由1 2 6 個(gè)氨基酸組成 其中一個(gè)兀 亞基經(jīng) 過(guò)重排形成酯基 另外三個(gè)7 亞基g l y 2 4 一s e r 2 5 位置進(jìn)行自剪切 形成c 末端含 有羥基的p 一亞基 2 8k d a 和n 末端含有丙酮?；? 亞基 1 1k d a 不同菌株 p a l l d 區(qū)別見(jiàn)表1 4 s 2 0 1 0 浙江 t 業(yè)大學(xué)研究生碩十畢業(yè)論文 表l 4 丙酮?；蕾囆蚻 天冬氨酸廿脫羧酶 t 拍l e1 4 p y r u v o y l d e p e n d e n tl 一弱p a r t a t ea d e c a r b o x y l a s e 菌株 亞基結(jié)構(gòu) m r 1 0 3 n a t i v e0 p ec d f 1 7 1 口p 4 5 9 1 1 2 8 c 砌聊記甜m 2 3 a p 4 5 71 1 52 7 zf w 6 p 勵(lì)s 括 2 4 1 0 p 4 6 41 3 2 2 7 1 2 3 2p a n d 酶學(xué)性質(zhì)的研究 p a j l d 的最適溫度和最適p h 值隨菌種而異 w i l l i 鋤s o n 等 2 1 1 報(bào)道ec d fp a l l d 的最適p h 為6 5 7 5 之間 p h5 3 和8 6 酶活力只有一半 最適溫度為5 5 2 6 和7 8 酶活力減半 而c 甜砌聊紀(jì)甜m 和彪砌6 p 陽(yáng)材 o s 婦a z 玎d 的最適溫度 是3 7 2 3 2 4 1 c r o n a n 深入研究發(fā)現(xiàn)e fp a n d 的最佳p h 值是7 5 在p h6 8 和8 0 溶 液中的反應(yīng)速率約為p h7 5 的6 0 c h o p m 等 馴發(fā)現(xiàn)肱 材6 p 彤甜 括中p a l l d 的 最佳p h 值是7 o 除了一些親核試劑外 p 羥基 d l 天冬氨酸 磺基丙氨酸 草酰乙酸 琥珀 酸 l 一谷氨酸 d 絲氨酸等l 天門冬氨酸的結(jié)構(gòu)類似物都是該酶的競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑 而l 天門冬氨酸的立體異構(gòu)體d 天門冬氨酸既不是底物也不是酶活力抑制劑 一些金屬陽(yáng)離子也抑制其酶活力 如1 0m m c u c l 2 可以抑制8 8 的酶活力 2 0 0 m mk c l 可以抑制6 3 的酶活力 2 6 1 1 3 細(xì)胞固定化 細(xì)胞固定化技術(shù)是指利用物理或化學(xué)手段將游離細(xì)胞定位于限定的空間區(qū) 域并使其保持活性和可以反復(fù)使用的一種基礎(chǔ)技術(shù) 它是在固定化酶技術(shù)的基礎(chǔ) 上發(fā)展起來(lái)的 6 2 0 1 0 浙江工業(yè)大學(xué)研究生碩上畢業(yè)論文 1 3 1 固定化材料應(yīng)具備的條件 理想的微生物固定化載體應(yīng)具備以下條件 機(jī)械強(qiáng)度高 壽命長(zhǎng) 價(jià)格低廉 性質(zhì)穩(wěn)定 具備一定的容量 不易被生物降解且固定化過(guò)程簡(jiǎn)單 常溫下易于成 形 固定化過(guò)程及固定化后對(duì)微生物無(wú)毒 生化及熱力學(xué)穩(wěn)定性好 基質(zhì)通透性 好 沉淀分離性好 具有惰性 不能干擾生物分子的功能 2 7 1 1 3 2 常見(jiàn)固定化方法 目前經(jīng)常采用的生物固定化方法主要有吸附法 包埋法 交聯(lián)法和共價(jià)結(jié)合 法 各種固定化方法和載體都各有特點(diǎn) 微生物細(xì)胞的固定化方法以包埋法和吸 附法最為常用 1 3 2 1 吸附法 吸附法是將微生物細(xì)胞附著于固體載體上 微生物細(xì)胞與載體之間不起化學(xué) 反應(yīng) 并且具有操作簡(jiǎn)單 固定化條件溫和 細(xì)胞活性損失小 載體可以反復(fù)使 用等優(yōu)點(diǎn) 所以被廣泛應(yīng)用和深入研究 常用的吸附載體有 木屑 焦炭 塑料 硅膠 煤渣 硅藻土 石英砂 纖 維素 活性炭等 h i d e k iy 及c 1 1 r i s t o vp 等人以多孔陶瓷為吸附載體對(duì)細(xì)胞進(jìn)行 固定化 2 8 之9 1 陳文謀p 0 1 等人分別以多孔陶瓷和浮石為載體吸附法固定重組大腸 桿菌 西c 辦p 廠f c 砌 fjm1 0 9 2 p lf 3 表達(dá)p 葡聚糖酶 獲得了良好的效果 1 3 2 2 包埋法 包埋法是將微生物封閉在天然高分子多糖類或合成高分子凝膠的網(wǎng)絡(luò)中 從 而使微生物固定化 其特點(diǎn)是可以將固定化微生物制成各種形狀 球狀 塊狀 圓柱狀 膜狀 布狀 管狀等 但包埋法制得的固定化微生物對(duì)傳質(zhì)有一定的 影響 根據(jù)包埋顆粒的形成 包埋法主要可分懸滴法和切塊法 懸滴法是指利用注 射或滴壓裝置 將包埋劑和細(xì)胞的混和液滴入交聯(lián)劑中 形成小球 切塊法是將 一定量的包埋劑加熱溶于水 加入一定量的菌體懸浮液 混勻 倒入培養(yǎng)皿中 7 2 0 1 0 浙江工業(yè)人學(xué)研究生碩士畢業(yè)論文 冷卻 硬化處理 洗滌和切塊 備用 1 3 2 2 1 常見(jiàn)包埋材料 常用的包埋固定化材料有聚乙烯醇 p v a 海藻酸鈉 卡拉膠 瓊脂 明膠 聚乙烯乙二醇 p e g 光硬化樹(shù)脂等 固定載體中應(yīng)用最廣泛的是海藻酸鈣 易于成形 無(wú)毒 成本低廉 操作簡(jiǎn)單 但機(jī)械強(qiáng)度差 使用壽命短 且對(duì)單價(jià)陽(yáng)離子及p 0 4 3 一敏感 3 l 聚乙烯醇 p v a 是一種新型的微生物包埋固定化材料 具有機(jī)械強(qiáng)度高 抗微 生物分解性能強(qiáng) 對(duì)微生物無(wú)毒 化學(xué)穩(wěn)定性好 價(jià)格低廉等優(yōu)點(diǎn) 是一種具有 實(shí)用潛力的包埋材料 近年來(lái)應(yīng)用較為廣泛 然而將此法應(yīng)用于微生物固定化需 要考慮兩個(gè)方面的問(wèn)題 1 p v a 粘度高 操作麻煩 且p v a 包埋顆粒易于粘在 一起 發(fā)生附聚現(xiàn)象 固定化顆粒呈團(tuán)狀 增加傳質(zhì)阻力 另一方面 若使用 p v a 硼酸包埋法固定化細(xì)胞 飽和硼酸溶液酸性強(qiáng) 約p h 4 降低固定化細(xì)胞 活性 目前 除了p v a 硼酸交聯(lián)法固定化細(xì)胞外 報(bào)道了一些新的方法 如p v a 冷凍法 降低菌體的附聚現(xiàn)象 但是低溫成型過(guò)程中細(xì)胞活性降低 3 2 卡拉膠固定化細(xì)胞制成條狀 具有制備快 表面光滑致密 不容易發(fā)生菌體泄 漏 且酶活力損失少等優(yōu)點(diǎn) 但價(jià)格較貴 不宜工業(yè)化生產(chǎn) 3 3 1 其他 其它的一些天然高分子化合物 如瓊脂 明膠等 雖強(qiáng)度得到改善 但價(jià)格 偏高 將上述包埋材料總結(jié)于下表 8 2 0 l o 浙江工業(yè)大學(xué)研究生碩十畢業(yè)論文 強(qiáng)度 傳質(zhì)性能 耐生物分解性 對(duì)生物毒性 固定難易 價(jià)格 較好 較好 較好 無(wú) 易 較貴 好 好 好 適中 易 便宜 較差 差 差 無(wú) 易 較貴 差 差 無(wú) 無(wú) 易 便宜 好 較差 好 小 較難 貴 1 3 2 3 共價(jià)結(jié)合法 共價(jià)結(jié)合法是微生物細(xì)胞表面上的官能基團(tuán) 如氨基 羧基 巰基 羥基和 咪唑基等 和固相支持物表面的反應(yīng)基團(tuán)之間形成共價(jià)鍵連接 從而成為固定化 細(xì)胞 該方法細(xì)胞與載體之間的連接鍵很牢固 細(xì)胞不易發(fā)生脫落 但反應(yīng)條件 激烈 操作復(fù)雜 1 3 2 4 交聯(lián)法 交聯(lián)法是利用含有兩個(gè)以上官能基團(tuán)的試劑直接與微生物細(xì)胞表面的反應(yīng) 基團(tuán)發(fā)生反應(yīng) 形成共價(jià)鍵 使其彼此交聯(lián)形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的固定化細(xì)胞 該方法 細(xì)胞不易脫落 穩(wěn)定性好 但對(duì)細(xì)胞活性影響較大 因此應(yīng)用受到一定的限制 常用的交聯(lián)劑有很多 主要有戊二醛 聚乙烯亞胺等 3 4 1 1 3 2 5 復(fù)合載體固定化 單一的固定化材料都有其優(yōu)缺點(diǎn) 因此越來(lái)越多的將多種固定化材料復(fù)合使 用研究 以達(dá)到固定化材料的優(yōu)化 王建龍 鐘婭鈴等用海藻酸鈉和p v a 復(fù)合載體固定化進(jìn)行了改進(jìn) 但海藻 酸鈉不適于含p 0 4 3 一緩沖液的反應(yīng)體系 陸健等人用家蠶絲素制成絲素溶液 加 入大腸桿菌細(xì)胞混勻凝固后 再用戊二醛固交聯(lián) 制成固定化大腸桿菌細(xì)胞的絲 9 2 0 1 0 浙江工業(yè)大學(xué)研究生碩上畢業(yè)論文 素凝膠 用于轉(zhuǎn)化延胡索酸 取得了良好的效果 3 5 朱新榮等以海藻酸鈉 瓊脂 為復(fù)合載體 用包埋法對(duì)啤酒酵母細(xì)胞固定化1 3 6 j 陳功等 3 1 1 在p v a 材料中添加少量的陰離子交換樹(shù)脂 在膠片深凍過(guò)程中 由于p v a 和樹(shù)脂的熱膨脹系數(shù)不同 形成了一系列以樹(shù)脂為中心的孔洞 于是 樹(shù)脂將酵母細(xì)胞牢牢的固定在樹(shù)脂周圍的空洞中 同時(shí)酵母細(xì)胞又有足夠的空間 增值 利于發(fā)酵 此固定化細(xì)胞方法具有增殖細(xì)胞 又不易脫落的優(yōu)點(diǎn) 在實(shí)際 應(yīng)用中將具有很大的優(yōu)越性 周桂等 2 8 1 首次用玉米芯顆粒吸附 海藻酸鈉復(fù)合材料包埋固定化黑曲霉孢 子 吸附載體玉米芯顆粒取自玉米棒中芯的柔軟部位 以保證制作的玉米芯顆粒 多孔 柔軟 吸附性強(qiáng) 機(jī)械強(qiáng)度好等優(yōu)點(diǎn) 為細(xì)胞的固定提供了良好的網(wǎng)架空 間 1 3 2 6 無(wú)載體固定化 某些微生物細(xì)胞具有自絮凝 s e l f f l o c c u l a t i n g 現(xiàn)象 可以在不加任何固定化 材料的情況下形成顆粒 3 3 1 利用這種細(xì)胞自絮凝形成的顆粒作為一種固定化細(xì) 胞的方法 是固定化細(xì)胞技術(shù)中全新的概念 與各種載體固定化細(xì)胞技術(shù)相比 這種無(wú)載體固定化細(xì)胞技術(shù)具有非常突出的優(yōu)點(diǎn) 主要體現(xiàn)在 細(xì)胞的固定化方法非常簡(jiǎn)單 一般在搖瓶培養(yǎng)一段時(shí)間段就可以自己形成 絮凝顆粒 培養(yǎng)液澄清透明 不產(chǎn)生細(xì)胞固定化過(guò)程的附加成本將絮凝細(xì)胞顆粒 可以在生物反應(yīng)器中逐級(jí)擴(kuò)大培養(yǎng) 自絮凝細(xì)胞顆粒內(nèi)部結(jié)構(gòu)呈松散型 傳質(zhì)阻力很小 而且其顆粒內(nèi)部表面 不斷自我更新 顆粒整體活性好 不使用細(xì)胞生長(zhǎng)和代謝產(chǎn)物生物合成所需營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)以外的其它任何化學(xué) 物質(zhì) 細(xì)胞的生理和生態(tài)環(huán)境不受外來(lái)物質(zhì)的干擾 對(duì)目標(biāo)產(chǎn)物的順利合成有利 在生物反應(yīng)器中一定的生理 生態(tài) 物理 化學(xué)和流體力學(xué)條件下 小顆 粒的絮凝和大顆粒的解離可以呈動(dòng)態(tài)平衡 不存在載體固定化細(xì)胞的強(qiáng)度問(wèn)題 1 0 2 0 1 0 浙江t 業(yè)人學(xué)研究生碩十畢業(yè)論文 1 3 3固定化對(duì)微生物生理變化的影響 1 3 3 1 固定化對(duì)微生物生長(zhǎng)速率的影響 在固定化細(xì)胞系統(tǒng)的代謝參數(shù)中 微生物生長(zhǎng)速率是研究最多的參數(shù)之一 對(duì)于固定化細(xì)胞生長(zhǎng)速率的降低 最可能的解釋是由于固定化細(xì)胞的傳質(zhì)限制 引起的 o m a r 3 4 認(rèn)為 固定化細(xì)胞在培養(yǎng)過(guò)程中 營(yíng)養(yǎng)物和氧氣會(huì)形成濃度梯 度 在固定化顆粒內(nèi)部 由于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的耗盡及氧含量低 導(dǎo)致微生物會(huì)停止生 長(zhǎng) 另一方面 固定化載體可阻止顆粒外激烈的環(huán)境 保護(hù)菌體 促進(jìn)微生物生 長(zhǎng) 例如 將而切d c 腸旃甜聊的 f 擾m 包埋于塑料載體中 可以使微生物免受高 剪切力的作用 3 5 1 據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道 用于微生物固定化的高分子載體 如1 c 卡拉膠 可 為酵母細(xì)胞提供保護(hù)作用 維持細(xì)胞內(nèi)p h 值穩(wěn)定 防止酸化 使固定化微生物 濃度高于懸浮生長(zhǎng)值 1 3 3 2 固定化對(duì)微生物活性的影響 由于酵母細(xì)胞在工業(yè)應(yīng)用上的重要性 因此 大量的研究集中在固定化對(duì)酵 母細(xì)胞代謝活性的影響上 許多研究結(jié)果表明固定化可以激活酵母細(xì)胞的次級(jí)代 謝功能 如產(chǎn)酶 抗生素等 a n g e l o v a 等的研究報(bào)道表明 將彳印p 餾川淞嘲妒 細(xì) 胞固定在海藻酸鈣凝膠內(nèi) 可以促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)過(guò)氧化物歧化酶的合成 改變細(xì)胞分 泌的果膠水解酶的種判3 7 1 1 3 3 3 固定化細(xì)胞對(duì)有毒抑制物質(zhì)的耐受性 在固定化酵母發(fā)酵乙醇的過(guò)程中 固定化細(xì)胞對(duì)乙醇的耐受性得到了較多的 研究 很多研究結(jié)果表明 固定化細(xì)胞對(duì)乙醇這一抑制性產(chǎn)物的抗性增加 并且 認(rèn)為這種變化是由于固定化改變了微生物細(xì)胞的滲透性 固定化細(xì)胞系統(tǒng) 除應(yīng)用于乙醇發(fā)酵外 應(yīng)用于有毒污染物和難降解有機(jī)物 的生物降解也具有明顯的優(yōu)越性 例如 利用固定化細(xì)胞進(jìn)行酚和氯酚的生物降 解 人們發(fā)現(xiàn)固定化載體 如聚胺酯泡沫 k 卡拉膠 殼聚糖可以對(duì)污染物產(chǎn)生 可逆吸附 在纖維床固定化生化反應(yīng)器中固定化微生物可以耐受更高濃度的工業(yè) 劑長(zhǎng) 內(nèi)外 生產(chǎn) 過(guò)程復(fù)雜 生產(chǎn)工藝需高溫 高壓 能耗大 原料中含有強(qiáng)酸強(qiáng)堿 液氮 對(duì)設(shè) 備要求苛刻 生產(chǎn)過(guò)程中產(chǎn)生了大量的含腈 三廢 對(duì)人和環(huán)境危害非常嚴(yán)重 隨著p 丙氨酸衍生物的不斷開(kāi)發(fā) d 丙氨酸的生產(chǎn)顯得尤為重要 積極尋求綠色 型的生產(chǎn)方法是具有十分明顯的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益的 從p 丙氨酸的代謝途經(jīng)可見(jiàn) 用天門冬氨酸作底物 可以一步生產(chǎn)p 丙氨 酸 國(guó)外已有對(duì)p a n d 結(jié)構(gòu) 形成機(jī)制 最適酶活力條件等相關(guān)資料的報(bào)道 并 且對(duì)于酶的實(shí)驗(yàn)室規(guī)模的初步分離純化研究也有報(bào)道 國(guó)內(nèi)目前還是空白 野生型菌株的l 天冬氨酸a 脫羧酶酶原 亞基由1 2 6 個(gè)氨基酸組成 本實(shí) 驗(yàn)已構(gòu)建工程菌株ec d fb l 2 1 d e 3 p e t 2 8b 節(jié)口 z d 以ec d 療d h 5 a 中p 口 z d 基因的起始密碼子開(kāi)始至p e t 2 8b 質(zhì)粒中覷 z 講i i 酶切位點(diǎn)后的第一個(gè)終止密 碼子止 應(yīng)該共編碼1 3 9 個(gè)氨基酸 包含6 個(gè)h i s 標(biāo)簽 但是由于在設(shè)計(jì)引物時(shí) 出現(xiàn)差錯(cuò) 正相引物加以dp l 5 a a c g g a t c c h 忪t g a t t c g c a c g a t g c t g 3 肋垅h i 酶切位點(diǎn)后 起始密碼子前多了個(gè)堿基t 方框標(biāo)記 導(dǎo)致開(kāi)放讀碼框 出現(xiàn)與預(yù)期不同的結(jié)果 在表達(dá)的1 3 9 個(gè)氨基酸之前多表達(dá)了3 4 個(gè)氨基酸 猜 測(cè)這可能是菌株酶活力較低的主要原因 質(zhì)粒p e t 2 8c 在 z m h i 酶切位點(diǎn)前比質(zhì)粒p e t 2 8b 少一個(gè)堿基g 本 實(shí)驗(yàn)用質(zhì)粒p e t 2 8c 代替p e t 2 8b 構(gòu)建工程菌株ec d fb l 2 l d e 3 p e t 2 8 c 妒加 彌補(bǔ)引物中多出一個(gè)堿基的不足 可以正確表達(dá)1 3 9 個(gè)氨基酸 優(yōu) 化培養(yǎng)條件及p a i l d 的酶學(xué)性質(zhì)的研究 提高酶活力 通過(guò)對(duì)細(xì)胞固定化提高細(xì) 胞使用率 為酶法工業(yè)化生產(chǎn)提供參考 利用微生物酶來(lái)催化合成d 丙氨酸 這 在國(guó)內(nèi)外還未見(jiàn)報(bào)道 研究這種綠色型的生產(chǎn)方法將會(huì)具有廣闊的前景 2 0 1 0 浙江t 業(yè)大學(xué)研究生碩十畢業(yè)論文 參考文獻(xiàn) l 許關(guān)煜主編 醫(yī)藥中間體手冊(cè) 上冊(cè) m 北京 化學(xué)工業(yè)出版社 2 0 0 0 2 金維高 醫(yī)藥中間體生產(chǎn)實(shí)用技術(shù)手冊(cè) m 北京 化學(xué)工業(yè)出版社 2 0 0 l 3 p a u ld e s m o n des p y t l l v o l d e p e n d e n te m m e j a n n u r e v b i o c h e m 1 9 9 0 5 9 2 9 5 9 4 v 鋤d e r s l i c e 只c o p e l a n dwc r o b e r t u sjd c 1 0 n i n g 鋤dn u c l e o t i d es e q u e n c eo fw i l dt r p e 鋤d am u t a n th i s t i d i n ed e c a r b o x y l a s e 仔0 m 三口咖6 講淞3 沈 j j o u m a lo f b i o i o g i c a lc h e m i s 仃y 1 9 8 6 2 6 l 1 5 1 8 6 1 5 1 9 l 5 s c h e l pe w o r l e ys m o n z i n g o p f 口 p h i n d u c e ds t m c t 啪lc h a n g e sr e g u l a t eh i s t i d i n e d e c a r b o x y l a s ea c t i v 時(shí)i n 三 f d 6 叩講淞j 弛 j j m 0 1 b i 0 1 2 0 01 3 0 6 7 2 7 7 3 2 6 c h a n ggw s n e l lee h i s t i n ed e c a r b o x y l 雒e 幻6 礎(chǔ)砒據(jù)3 婦 j m e t h o d se n 巧m 0 1 19 7 l 17 6 6 3 6 6 7 7 s a t o m im f u m s h i t am o i l a w ah a n a l y s i so fa3 0k b pp l a s m i de n c o d i n gh i s t i d i n e d e c a r b o x y l a s eg e n ei n 死f 懈p 以d c o c c 螂 i z 口鯽砌f 淞i s o l a t e df r o mf i s hs a u c e j f