體外診斷試劑生產(chǎn)及質(zhì)量控制技術(shù)指導(dǎo)原則--生物芯片模板.doc

附件6:體外診斷試劑生產(chǎn)及質(zhì)量控制技術(shù)指導(dǎo)原則生物芯片類試劑生產(chǎn)及質(zhì)量控制技術(shù)指導(dǎo)原則前 言本指導(dǎo)原則所定義的生物芯片診斷試劑是指將多個(gè)生物探針(包括DNA片段,寡核苷酸,抗原,抗體,組織,細(xì)胞等)按預(yù)先設(shè)計(jì)的排列方式固定在特制的基質(zhì)(包括玻璃片,尼龍膜,硝酸纖維素膜等)上,用特定的方法提取生物靶分子并進(jìn)行標(biāo)記,然后與固定在基質(zhì)上的生物探針特異性的結(jié)合,再用相應(yīng)的檢測設(shè)備(如激光掃描儀,CCD檢測儀等)和分析方法(包括軟件)進(jìn)行檢測,記錄,分析,實(shí)現(xiàn)對生物靶分子的定性或定量檢測的試劑.根據(jù)芯片制作的主要原料和方法,生物芯片可分為核酸芯片,蛋白芯片,細(xì)胞芯片,組織芯片,芯片實(shí)驗(yàn)室等.本指導(dǎo)原則是針對核酸和蛋白為檢測靶分子生物芯片的生產(chǎn)及質(zhì)量控制技術(shù)指導(dǎo)原則,其它類型靶分子檢測的芯片診斷試劑可參考本指導(dǎo)原則.由于生物芯片技術(shù)還在不斷發(fā)展,國家食品藥品監(jiān)督管理部門可依據(jù)科學(xué)技術(shù)發(fā)展的需要,適時(shí)組織對本指導(dǎo)原則進(jìn)行修訂.一,基本原則(一)生物芯片診斷試劑生產(chǎn)用的物料包括:原料,輔料和包裝材料.各種物料應(yīng)當(dāng)制定相應(yīng)的質(zhì)量指標(biāo),并應(yīng)符合有關(guān)法規(guī)的要求.(二)生物芯片診斷試劑的生產(chǎn)企業(yè)應(yīng)具備相應(yīng)的專業(yè)技術(shù)人員,相適應(yīng)的儀器設(shè)備和生產(chǎn)環(huán)境,獲得醫(yī)療器械生產(chǎn)許可證;應(yīng)當(dāng)按照體外診斷試劑生產(chǎn)實(shí)施細(xì)則(試行)的要求建立相應(yīng)的質(zhì)量管理體系,形成文件和記錄,加以實(shí)施并保持有效運(yùn)行;應(yīng)當(dāng)通過體外診斷試劑生產(chǎn)企業(yè)質(zhì)量管理體系考核評定標(biāo)準(zhǔn)(試行)的考核.(三)生物芯片診斷試劑的研制應(yīng)當(dāng)按照科學(xué),規(guī)范的原則組織研發(fā),各反應(yīng)條件的選擇和確定應(yīng)符合基本的科學(xué)原理.(四)生物芯片診斷試劑生產(chǎn)過程中所用的物料及工藝,應(yīng)充分考慮可能涉及的安全性方面的事宜.二,物料質(zhì)量控制(一)核酸檢測芯片核酸芯片檢測時(shí),從生物樣本中提取的核酸可用熒光標(biāo)記,金標(biāo)記和酶標(biāo)記.檢測方法包括光譜學(xué)方法和化學(xué)顯色.下面為熒光標(biāo)記芯片技術(shù)指導(dǎo)原則,采用金標(biāo)記和酶聯(lián)顯色等的生物芯片診斷試劑可參照核酸芯片和蛋白芯片相關(guān)部分.1,主要生物原料核酸檢測芯片的主要生物原料包括模板DNA,dNTPs,引物,探針,標(biāo)記物等.應(yīng)按照工藝要求對這類生物原料進(jìn)行質(zhì)量檢驗(yàn),以保證其達(dá)到規(guī)定的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn).主要生物原料的供應(yīng)商要求相對固定,不得隨意變更供應(yīng)商.(1)模板DNA重組DNA:經(jīng)測序驗(yàn)證,關(guān)鍵位置沒有錯(cuò)誤.1TE溶解,濃度為1g/l以上,-20保存.(2)dNTPs(dATP/dUTP/dGTP/dCTP/dTTP)HPLC純,PCR級,無DNase,RNase污染.-20以下保存.外購者,由生產(chǎn)廠家提供質(zhì)量保證證明,達(dá)到生產(chǎn)要求.(3)引物序列確證;進(jìn)行PCR擴(kuò)增后,克隆測序鑒定驗(yàn)證,建立引物標(biāo)準(zhǔn)品.生產(chǎn)中的引物原材料為凍干粉,PAGE純或HPLC純,外購者,供應(yīng)商應(yīng)提供該產(chǎn)品的質(zhì)檢證明,如PAGE電泳結(jié)果或HPLC分析圖譜;自己合成的引物,需有PAGE電泳結(jié)果或HPLC分析圖譜.用標(biāo)準(zhǔn)DNA模板擴(kuò)增,電泳檢測,譜帶單一,大小正確,與對照引物比較,產(chǎn)物量一致.符合視為合格引物.-20以下保存.(4)探針(用于陣列制備)重組DNA, 凍干粉(或1TE溶解液):每種90g以上,酶切鑒定分析圖譜.PCR產(chǎn)物,凍干粉(或1TE溶解液):每種90g以上,PCR電泳鑒定圖譜.合成寡核苷酸:PAGE純或HPLC純,每種90g以上,提供該產(chǎn)品的PAGE電泳分析圖譜或HPLC分析圖譜.外購者,供應(yīng)商應(yīng)提供質(zhì)量保證證明,達(dá)到生產(chǎn)要求.探針序列的正確性:應(yīng)用克隆鑒定的標(biāo)準(zhǔn)DNA雜交鑒定或進(jìn)行測序鑒定.外購者,供應(yīng)商應(yīng)提供質(zhì)量保證證明,達(dá)到生產(chǎn)要求.純度和濃度檢測:用電泳方法,電泳圖譜沒有雜帶,目標(biāo)條帶的強(qiáng)度與已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)DNA條帶進(jìn)行參比計(jì)算其強(qiáng)度.純度較高的DNA,可用紫外分光光度計(jì)進(jìn)行定量.檢定合格后入庫.避光,-20以下保存.(5)標(biāo)記物含有激發(fā)光波長和發(fā)射光波長介于280680nm的所有熒光分子,HPLC純,供應(yīng)商應(yīng)提供質(zhì)量保證證明.(6)Taq DNA聚合酶SDS-PAGE 檢測,純度95%,具DNA聚合酶活性,無核酸外切酶活性及核酸內(nèi)切酶活性,具熱穩(wěn)定性,941小時(shí)后仍保持50%活性,由供應(yīng)商提供質(zhì)量保證.-20保存.(7)UNG(尿嘧啶糖基化酶)具尿嘧啶糖基化酶活性,無核酸外切酶及核酸內(nèi)切酶活性.1U UNG 37處理3分鐘后,103拷貝以下含U模板被降解后,不能產(chǎn)生擴(kuò)增產(chǎn)物,供應(yīng)商提供質(zhì)量保證.-20保存.(8)RT 酶具有逆轉(zhuǎn)錄活性,供應(yīng)商提供質(zhì)量保證.-20保存.(9)RT-PCR酶具逆轉(zhuǎn)錄酶活性和DNA聚合酶活性,無核酸外切酶活性及核酸內(nèi)切酶活性,具熱穩(wěn)定性,941小時(shí)后仍保持50%活性.-20保存.(10)緩沖液各類酶制品需要的的反應(yīng)緩沖液由廠家隨酶制品提供,供應(yīng)商提供質(zhì)量保證.-20保存.2,主要生物輔料(1)雜交液購買成品者,供應(yīng)商提供質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn),并按要求保存.自制雜交液,按半成品檢定標(biāo)準(zhǔn)要求進(jìn)行檢定.(2)酶類蛋白酶,核酸酶等,供應(yīng)商提供質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn),并按要求保存.(3)核酸提取試劑供應(yīng)商提供質(zhì)量保證,并按要求保存.如果是自制提取液,按半成品檢定要求.(4)魚精DNA供應(yīng)商提供質(zhì)量保證,并按要求保存.(5)封閉用蛋白包括牛血清白蛋白,奶粉等,提供質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn),并按要求保存.3,主要化學(xué)原輔料參照中國生物制品主要原輔材料質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)(2000年版)分析純級別進(jìn)行檢驗(yàn).主要的檢測指標(biāo)包括:溶液外觀,一般鹽類檢測,溶液pH值檢測,溶解情況檢測,干燥失重的檢測,熾灼殘?jiān)?主要化學(xué)原材料的供應(yīng)商要求相對固定,不得隨意發(fā)生變更.化學(xué)原材料在購入時(shí),原材料的生產(chǎn)商必須提供該批次化學(xué)原材料的質(zhì)量質(zhì)量保證材料和質(zhì)量檢驗(yàn)報(bào)告,其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)達(dá)到生產(chǎn)所需的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn).(1)無機(jī)類主要包括氯化鈉,氫氧化鈉,純化水等.(2)有機(jī)類主要包括有丙酮,乙醇,枸櫞酸,吐溫20,乙二胺四乙酸二鈉,氨基吡啉等.(3)特殊化學(xué)原料聚乙二醇,多聚賴氨酸,丙烯酰胺,甲叉雙丙烯酰胺,N,N,N,N-四甲基二乙胺(TEMED),溴化乙錠(EB),染色劑等.4,其他物料(1)載玻片外觀:明亮處用肉眼觀察無缺刻,無劃傷等.規(guī)格按設(shè)計(jì)要求.激光掃描儀掃描(波長為芯片檢測波長):包被層基本均勻.(2)試管,吸頭,試劑瓶等一次性使用,由生產(chǎn)廠家提供質(zhì)量保證,達(dá)到設(shè)計(jì)要求.(3)其他:說明書,包裝外盒等參照國家食品藥品監(jiān)督管理局頒布的體外診斷試劑說明書編寫指導(dǎo)原則和醫(yī)療器械說明書,標(biāo)簽和包裝標(biāo)識管理規(guī)定執(zhí)行.(二)蛋白檢測芯片1,主要生物原料與生產(chǎn)的產(chǎn)品質(zhì)量最密切相關(guān)的生物原料包括各種活性抗原,重組抗原,單克隆杭體,多克隆抗體以及多肽類生物原科.這類原料可用于點(diǎn)膜,標(biāo)記相關(guān)酶,納米金,光學(xué)基團(tuán)及中和反應(yīng)用抗原或抗體等.使用前應(yīng)按工藝要求對這類生物原料進(jìn)行質(zhì)量檢驗(yàn),以保證其達(dá)到規(guī)定的質(zhì)量要求.主要生物原料若為企業(yè)自己生產(chǎn),其工藝必須相對穩(wěn)定;若購買,其供應(yīng)商要求相對固定,不能隨意變更供應(yīng)商,如果主要原料(包括工藝)或其供應(yīng)商有變更,必須進(jìn)行原料驗(yàn)證,并進(jìn)行補(bǔ)充申報(bào).主要生物原料的常規(guī)檢驗(yàn)項(xiàng)目一般包括:(1)外觀肉眼觀察,大部分生物原料為澄清透明的液體,不含異物,渾濁或搖不散的沉淀;或者為白色粉末,不含有其他顏色的雜質(zhì);特殊生物原料應(yīng)具備相應(yīng)外觀標(biāo)準(zhǔn).(2)純度和分子量主要通過SDS-PAGE電泳和電泳結(jié)果掃描儀進(jìn)行檢測,也可用其他適宜的方法,如高效液相法等.作為免疫診斷試劑用生物原材料,用銀染法染色后,純度一般都要大于90%;用考瑪氏亮藍(lán)染色后;純度一般都要大于95%.SDS凝膠電泳法測定分子量.(3)蛋白濃度蛋白濃度可通過Lowry法,280nm光吸收法,雙縮脲方法等進(jìn)行檢測;(4)效價(jià)效價(jià)的測定一般根據(jù)蛋白含量測定結(jié)果通過倍比稀釋法進(jìn)行.效價(jià)應(yīng)達(dá)到設(shè)計(jì)規(guī)定的要求.(5)功能性實(shí)驗(yàn)功能性實(shí)驗(yàn)是指生物原料用于試劑盒試劑實(shí)際生產(chǎn)中的情況,一般考查該原料使用后的試劑靈敏度,特異性和穩(wěn)定性.2,主要生物輔料生物輔料指的是在生產(chǎn)過程中作為蛋白保護(hù)劑用途的一類生物原料,主要包括小牛血清,山羊血清,牛血清白蛋白和酪蛋白等.這些生物原料均應(yīng)按照中國生物制品主要原輔材料質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)(2000年版)所規(guī)定的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)要求進(jìn)行檢驗(yàn),達(dá)到相應(yīng)的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)后方應(yīng)用于生產(chǎn).生物輔料的供應(yīng)商同樣要求相對固定,不得隨意變更供應(yīng)商.對于小牛血清或山羊血清,牛血清白蛋白以及酪蛋白等,還應(yīng)進(jìn)行功能性實(shí)驗(yàn),即以其為原料配制10%濃度的稀釋液作為樣品,進(jìn)行酶聯(lián)免疫測定,均不得出現(xiàn)非特異性反應(yīng).對于標(biāo)記用酶,應(yīng)在產(chǎn)品的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中明示所使用的標(biāo)記用酶的名稱(如辣根過氧化物酶,堿性磷酸酶等),同時(shí)應(yīng)根據(jù)不同生產(chǎn)廠家的檢定方法和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行檢驗(yàn),酶的純度RZ值(OD403nm/OD280nm)應(yīng)大于3.0.3,化學(xué)原輔料參照中國生物制品主要原輔材料質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)(2000年版)分析純級別進(jìn)行檢驗(yàn).主要的檢測指標(biāo)包括:溶液外觀,一般鹽類檢測,溶液pH值檢測,溶解情況檢測,干燥失重的檢測,熾灼殘?jiān)?主要化學(xué)原材料的供應(yīng)商要求相對固定,不得隨意發(fā)生變更.化學(xué)原材料在購入時(shí),原材料的生產(chǎn)商必須提供該批次化學(xué)原材料的質(zhì)量質(zhì)量保證材料和質(zhì)量檢驗(yàn)報(bào)告,其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)達(dá)到生產(chǎn)所需的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn).(1)無機(jī)類主要包括氯化鈉,氫氧化鈉,純化水等.(2)有機(jī)類主要包括有丙酮,乙醇,枸櫞酸,吐溫20,乙二胺四乙酸二鈉,氨基吡啉等.(3)特殊化學(xué)原料DAB(聯(lián)苯二胺),染色劑等.4,其他物料(1)基質(zhì)以硝酸纖維素膜為例:孔徑符合設(shè)計(jì)要求(0.45m,0.22m等),均一性(厚度及毛細(xì)遷移速度20%),尺寸(與標(biāo)識吻合)(2)瓶子和干燥劑由生產(chǎn)廠家提供質(zhì)量保證,達(dá)到規(guī)定要求.(3)其他:說明書,包裝外盒等應(yīng)參照國家食品藥品監(jiān)督管理局頒布的體外診斷試劑說明書編寫指導(dǎo)原則和醫(yī)療器械說明書,標(biāo)簽和包裝標(biāo)識管理規(guī)定執(zhí)行.三,試劑盒各組分的生產(chǎn)生物芯片主要包括DNA芯片,蛋白芯片,組織芯片,細(xì)胞芯片以及芯片實(shí)驗(yàn)室等.生物芯片診斷試劑產(chǎn)品基本可分成二個(gè)部分,一部分是芯片,另一部分檢測用工作液.如果有配套的檢測儀器,還需對儀器及處理軟件的應(yīng)用加以說明.(一)芯片的生產(chǎn)芯片生產(chǎn)的基本過程包括探針的獲取方法,純化,點(diǎn)樣,固定.1,探針獲取不同的芯片,主要是探針不同,生物芯片的探針主要包括以下幾類,其它探針可參考制定相應(yīng)的技術(shù)及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn).(1)DNA探針的獲取探針的形式有PCR產(chǎn)物,克隆DNA,人工合成DNA片段等;要求有生產(chǎn)程序和質(zhì)量指標(biāo)及檢測方法,要進(jìn)行純化,有固定的純化程序.(2)抗原的生產(chǎn)抗原的獲得方法包括細(xì)胞培養(yǎng),從生物材料中分離提取,基因工程表達(dá)以及合成肽等.基因工程表達(dá)產(chǎn)物又分為純抗原蛋白,融合蛋白等.(3)抗體抗體分單克隆抗體和多克隆抗體.抗體制備包括細(xì)胞培養(yǎng),動物腹水,基因工程表達(dá)等方式.(4)細(xì)胞和組織包括細(xì)胞或組織類型,固定方法.組織材料還包括固定,包埋,切片等.(5)芯片實(shí)驗(yàn)室,包括各種管道泵的制作等.2,陣列的排列設(shè)計(jì)陣列的排列包括依次排列,隨機(jī)排列,對角線排列等,設(shè)計(jì)時(shí)需考慮重復(fù)次數(shù)等.3,點(diǎn)陣的制作使用儀器的要確定型號,程序;手工制作的也要有標(biāo)準(zhǔn)操作程序.4,固定:包括固定方式,固定的條件等.應(yīng)對芯片生產(chǎn)的過程進(jìn)行相應(yīng)的質(zhì)量控制,如點(diǎn)樣和固定過程的監(jiān)控,點(diǎn)樣均一性檢驗(yàn)等.(二)工作液配制1,芯片生產(chǎn)所需試劑,包括細(xì)胞培養(yǎng)基,探針制備試劑,陣列制作和固定試劑等.2,樣品處理試劑,芯片檢測靶分子分為核酸和蛋白質(zhì).檢測核酸的樣品處理試劑包括臨床取樣,DNA提取或RNA提取試劑,逆轉(zhuǎn)錄試劑,PCR擴(kuò)增試劑,核酸標(biāo)記試劑等;檢測蛋白的處理試劑包括取樣試劑,蛋白稀釋液以及特殊試劑等.3,反應(yīng)液:檢測核酸時(shí)的反應(yīng)液包括預(yù)雜交液,雜交液,洗脫液等;檢測蛋白時(shí),包括封閉液,抗原/抗體反應(yīng)液,洗脫液,顯色液,顯色終止液等.(三)數(shù)據(jù)判讀1,判斷標(biāo)準(zhǔn)及依據(jù),包括Cut off值的確定依據(jù). 2,數(shù)據(jù)判讀方式:人工還是軟件判讀.3,如果是軟件判讀,應(yīng)提供軟件判斷的科學(xué)依據(jù)(包括生物學(xué)原理,數(shù)據(jù)獲取原理和判斷實(shí)驗(yàn)是否成立的依據(jù))以及實(shí)驗(yàn)測試的原始報(bào)告(或數(shù)據(jù)),并需要說明:(1)軟件的來源:購買或自己編制,是否獲得注冊等.(2)軟件的用途:包括對數(shù)據(jù)的分析,存儲,解讀,含義等.(3)軟件的使用:基本的使用程序.四,半成品質(zhì)量控制(一)抽樣檢驗(yàn)人員按批號抽取檢定需要數(shù)量的半成品,作好標(biāo)記,待檢.(二)質(zhì)控品 可用克隆并測序鑒定的DNA或經(jīng)特異性鑒定的抗原(或抗體).質(zhì)控品的基質(zhì)應(yīng)盡可能與被測物基質(zhì)相一致.(三)檢定要求1,芯片檢定(1)靈敏度:最低檢測限達(dá)到規(guī)定要求.(2)特異性:應(yīng)達(dá)到規(guī)定要求.若進(jìn)行全陰,全陽和交叉反應(yīng)檢測,全陰性檢測應(yīng)在沒有靶分子存在時(shí),所有檢測位點(diǎn)沒有檢測信號;全陽性檢測應(yīng)在加入足夠量的靶分子,所有檢測位點(diǎn)均有檢測信號;交叉反應(yīng)檢測時(shí),用某一位點(diǎn)的靶分子檢測,應(yīng)只有該位點(diǎn)有檢測信號,其它位點(diǎn)不能有檢測信號.(3)精密性(均一性):用比最低檢測限高一個(gè)數(shù)量級的質(zhì)控品,重復(fù)檢測10次,判定結(jié)果一致.考慮到芯片的多位點(diǎn)檢測,因此要進(jìn)行全位點(diǎn)和單個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行檢測.半成品檢定可以用克隆DNA和鑒定的抗原和抗體作質(zhì)控品.2,工作液的檢定(1)物理檢測:外觀顏色正常,沒有雜質(zhì).(2)質(zhì)量檢定:用被檢定的工作液檢測標(biāo)準(zhǔn)樣,檢測結(jié)果達(dá)到預(yù)定要求.五,成品質(zhì)量控制(一)生產(chǎn)批量申