免疫學實驗報告.doc

免疫實驗抗血清制備及抗體效價檢測摘要：用具有抗原性的物質牛血清白蛋白（BSA)注入到健康動物例如鼠、兔的機體后，將引起免疫應答，并會形成漿細胞，分泌抗體。抗體主要存在于血清中，經多次免疫，使血清中的抗體量達到要求濃度，然后采集動物血液，再從血液中分離析出血清，從而獲得抗血清?？寡?，是指含有免疫蛋白的血清?？贵w效價指抗體的物理狀態(tài)及其在體內滯留時間，以其與抗原反應的多少來表示其免疫效果。此次實驗主要是進行小鼠的牛血清白蛋白（BSA)抗血清的制備過程，并通過酶免疫吸附試驗（ELISA）對其進行抗體效價檢測。關鍵字：牛血清白蛋白（BSA) 抗血清 抗體效價 免疫實驗過程：本次實驗一共分為三個分實驗：實驗一：免疫實驗二：抽血、放血，分離抗血清 實驗三：ELISA測定抗體效價實驗一：免疫一、抗血清制備的原理用具有抗原性的物質注入到健康動物的機體后，將引起免疫應答，并會形成漿細胞，分泌抗體?？贵w主要存在于血清中，經多次免疫，使血清中的抗體量達到要求濃度，然后采集動物血液，再從血液中分離析出血清，從而獲得抗血清。二、目的制備高效價的抗血清三、實驗儀器、材料和試劑實驗儀器：1mL 注射器，酒精棉球，剪刀材料：家兔，小鼠試劑：35苦味酸溶液或8090苦味酸，牛血清白蛋白（BSA)三、方法和步驟1、動物編號左前腿上部為1，左腰部為2，左后腿為3，頭部為4，背部為5，尾基部為6，右側從前至后依次為7、8、9。紅色表示十位數(shù),用黃色表示個位數(shù)。免疫前用金屬編號牌固定兔耳，或用染料涂沫在動物的背部，作出明確的標記。2、動物抓取及注射按如下圖所示抓取目標動物 家兔為300600 g/次（400），每次不超過2mL；小鼠為10100 g /次（10-20，2040 g / ml），每次不超過0.5mL。小鼠腹腔注射以左手抓住動物，使腹部向上，右手將注射針頭于左（或右）下腹部刺入皮下，使針頭向前推0.51.0cm，再以45度角穿過腹肌，固定針頭，緩緩注入藥液，為避免傷及內臟，可使動物處于頭低位，使內臟移向上腹。兔子可以分別嘗試皮下（腳掌）、皮內、耳靜脈、肌肉注射實驗二：抽血、放血，分離抗血清一、采血小鼠采血（一）、尾部采血：需血量少時可用此方法。將小鼠放在在有開孔的離心管內，顯露尾部，將尾端剪去約 5mm，從尾根部向尾端部按摩，血即從斷端流出。（二）、小鼠睚眥采血：將毛細管折斷，使其斷口鋒利。采血時，左手拇指和食指抓住鼠兩耳之間的皮膚使鼠固定，并用中指配合，輕輕壓迫頸部兩側，阻礙靜脈回流，使眼球充分外突，提示眼眶后靜脈叢充血。用毛細管的斷口，右手拇指、食指和中指握住毛細管，將其尖端插入內眼角與眼球之間，輕輕向眼底方向刺入約 23mm，手指旋轉捻動毛細管以刺破靜脈叢，鼠血順毛細管流入 1.5mL 無菌離心管中，收集鼠血。采血結束后，拔出取血管，放松左手，出血即停止。用本法短期內可重復采血。小鼠一次可采血 0.20.3 ml，大鼠一次可采 0.50.1ml。家兔的采血（一）、耳靜脈抽血：將家兔置于兔固定箱內，對家兔進行耳靜脈抽血，此法用于小量抽血，驗血測抗體效價，以便決定加強免疫或放血，與耳靜脈注射方式相反。 （二）、心臟抽血：家兔固定（仰臥）-準確找到心臟部位-剪毛（心臟部位）-消毒-進針（50ml注射器接帶硅膠管的12號針頭）抽血，抽至50ml，從硅膠管接頭處取下注射器，拔針頭，將血液注入100ml無菌空三角瓶，再重復上述操作繼續(xù)抽血，直至抽完。（三）、頸動脈放血：家兔固定（仰臥，身體及頭部固定）-剪毛（頸部）-找頸動脈管（消毒-剖開頸部；開皮、膜、肌肉，找到氣管兩邊的頸動脈管（桃紅色，有脈動）-小心分開動脈上的肌肉、神經（2條，白色）等-開口（見圖）-放血，接入100ml無菌空三角瓶。注意：看到氣管，停用所有銳器，可用止血鉗、鈍玻棒。注意不要剪破毛細動脈管！二、抗血清的分離，保存1、斜置裝血液的三角瓶0.5-1h；2、用無菌玻棒剝落、松動瓶壁上的血塊（利于血清析出）；3、原樣包扎好，做好記號，放進冰箱（4）過夜；4、次日：估計分離的血清量并觀察描述血清顏色；去血塊，離心取上清（3000rpm,20min），加疊氮鈉（終濃度為0.1%），混勻，分裝小管，作好標記，-20或-80保存待測。實驗三：酶免疫吸附試驗法（ELISA）測定抗體效價一、ELISA原理酶聯(lián)免疫吸附測定(enzyme-linked immunosorbent assay， 簡稱ELISA)是在免疫酶技術的基礎上發(fā)展起來的一種新型的免疫測定技術。ELISA過程包括抗原(抗體)包被在固相載體上，加待測抗體(抗原), 再加相應酶標記抗體(抗原)，生成抗原(抗體)-待測抗體(抗原)-酶標記抗體的復合物，再與該酶的底物反應生成有色產物。借助分光光度計的光吸收計算抗體(抗原)的量。二、實驗儀器、材料、試劑儀器：酶標板，酶標儀、保鮮膜、排槍材料：牛血清白蛋白（BSA) 抗原，10 g/ml溶液，包被液配制鼠抗BSA 待測抗體樣品，用PBST從1：1000開始倍比稀釋，連續(xù)稀釋8個稀釋度HRP標記羊抗小鼠IgG 二抗（按說明書稀釋使用，用PBST稀釋。）試劑：包被緩沖液：0.05 M pH 9.6碳酸鹽緩沖液（Na2CO3 1.59克，NaHCO3 2.93克，加水900ml，調pH，再定容至1L）0.01M PBS溶液（NaCl 8.5 g, Na2HPO4.12H2O 2.85g或Na2HPO4.2H2O 1.13g，KCl 0.2g， KH2PO4 0.27g，蒸餾水定容至1000ml，pH7.4）PBST洗滌液：含0.05 % Tween 20的0.01 M 的PBS（ pH 7.4 ）底物溶液：TMB（ 3,3,5,5-四甲基聯(lián)苯胺）2M H2SO4 （市售濃硫酸為18.4 M，根據(jù)要配制的2M硫酸體積，吸管吸好相應體積濃硫酸沿著器壁緩慢加到水中）三、實驗方法和步驟1.加抗原：取酶標板，加入100l/孔的抗原溶液（用包被緩沖液稀釋，用排槍加）2.包被抗原：保鮮膜包好， 37 1h或4 過夜（抗原分子通過疏水作用力結合到96微孔板上）3.封閉：甩干后以PBST（200l/孔）洗滌3次，3min/次，每孔加入100 l 5%（W/V)脫脂奶粉溶液（用PBS溶液配制）。保鮮膜包好， 37， 2h后（封閉的目的：降低背景干擾，避免假陽性），取出包被、封閉好抗原的酶標板,甩干孔內液體。以PBST（200l/孔）洗滌3次，3min/次4.加待測血清：標記各孔，加入相應稀釋度的抗體100l/孔（用PBST稀釋，按示意圖用單槍加）。37，保鮮膜包好，60min后甩干孔內液體5.加二抗：以PBST（200l/孔）洗滌4次，3min/次。各孔加入酶標二抗100l/孔，37，保鮮膜包好，45min后，甩干孔內液體6.顯色：以PBST（200l/孔）洗滌4次，3min/次。加入TMB底物溶液50L/孔，避光顯色10min(抽屜中），然后每孔加入50 l 的2M 硫酸終止反應7.結果分析在酶標儀上，于450nm處測各孔OD值。陰性無色，OD小于0.1；陽性黃色，3個重復的平均值大于0.2，且為陰性對照OD值的2.0倍。打開“酶免大師”，登錄密碼“1234”，設置參數(shù)，選“終點法檢測”，建微板，點擊“read”，等待讀取各孔OD值，導出。經免疫小鼠123456未免疫家兔789101112A0.2080.1880.1930.040.0470.047B0.1480.1410.1440.0480.0440.044C0.10.0910.0920.0390.0390.039D0.0720.0560.0630.040.0450.039E0.0640.0570.0540.0430.0380.045F0.057O.O540.0520.0430.0410.038G0.0490.0510.0490.0440.0450.035H0.0530.0480.0400.0430.040.04結論：由于實驗動物免疫效果不好等原因，所得OD值太小，小鼠免疫還可以，初步判斷抗原效價為一價。未免疫家兔的血清測定的OD值很小，說明實驗材料沒有很大的污染。穿插實驗;玻片法血型鑒定實驗材料：1、Ag：受檢血樣（紅細胞懸液）2、Ab：標準抗A血清、標準抗B血清（單克隆抗體，不同于標準A型血清、B型血清）。實驗方法和