殼聚糖微球的制備及研究-開題報(bào)告.doc

殼聚糖微球的制備及研究（開題報(bào)告） 第 8頁殼聚糖微球的制備及研究摘要：殼聚糖是性能優(yōu)良的天然黏膜黏著劑，常用于多肽類藥物的黏膜給藥。殼聚糖微球除具有殼聚糖本身特點(diǎn)外，在性能上又有新的改善，利用殼聚糖制成的微球可以延長藥物在吸收位置的保留時(shí)間，達(dá)到控釋目的。實(shí)驗(yàn)以戊二醛，多聚磷酸鈉為交聯(lián)劑制備微球，通過單因素法考察微球制備工藝。關(guān)鍵詞：微球，殼聚糖，戊二醛，多聚磷酸鈉 1 研究背景1.1 微球微球是近年來發(fā)展的新劑型，它是以清蛋白、明膠、聚乳酸等材料制成的球狀載體給藥系統(tǒng)，微球中的藥物分散或包埋在材料中而形成球狀實(shí)體，微球直徑大小一般為0.3100m。不同粒徑范圍的微球針對性地作用于不同的靶組織。這類劑型的開發(fā)，對于發(fā)展緩控釋和靶向給藥系統(tǒng)具有重要的意義。1.1.1 微球的特點(diǎn)藥物制備成微球后可達(dá)到下述目的：掩蓋藥物不良?xì)馕都翱谖?，如魚肝油、生物堿類等；提高藥物的穩(wěn)定性，如易氧化的-胡蘿卜素、對水氣敏感的阿司匹林等；使液態(tài)藥物固體化便于應(yīng)用與儲存，如油類、香料、脂溶性維生素等；對緩釋或控釋藥物，可采用惰性基質(zhì)、薄膜、可生物降解材料、親水性凝膠等制成微球或微囊，可使藥物控釋或緩釋；使藥物濃集于靶區(qū)，如治療指數(shù)低的藥物或細(xì)胞毒素藥物（抗癌藥）制成微球或微囊的靶向制劑，可將藥物濃集于肝或肺等靶區(qū)，提高療效，降低毒副作用；除藥物外，可將活細(xì)胞或生物活性物質(zhì)包囊，如胰島、血紅蛋白等包囊，在體內(nèi)生物活性高，而具有很好的生物相容性和穩(wěn)定性1。1.1.2 各種微球的制備研究1.1.2.1 清蛋白微球 清蛋白微球制劑是人或動(dòng)物血清清蛋白與藥物一起制成的一種球狀制劑。清蛋白是體內(nèi)的生物降解物質(zhì)，注入肌體后，在肌體的作用下逐漸降解后清除，性能穩(wěn)定、無毒、無抗原性，因此清蛋白微球制劑是理想的控緩釋靶向制劑之一。其制備方法有：熱變性法；化學(xué)交聯(lián)法（即用化學(xué)交聯(lián)劑同清蛋白發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)使之變性）；聚合物分散法和界面縮聚法等。 1.1.2.2 聚乳酸、聚乳酸乙醇酸微球聚乳酸(PLA)是一種無毒可生物降解的聚合物，具有很好的生物相容性。目前，大部分PLA和PLGA微球均采用乳化分散法和相分離凝聚法制備。其中相分離法適合于水溶性藥物微球的制備，乳化分散法對水溶性、脂溶性藥物均適宜。1.1.2.3 明膠微球以明膠作載體材料，無不良反應(yīng)，無免疫原性，具有生物可降解性，是目前動(dòng)脈栓塞的主要材料，應(yīng)用廣泛。丁紅等2用乳化化學(xué)交聯(lián)法制備阿霉素明膠微球，對其粒徑及分布、體外釋放藥物進(jìn)行了研究，并在此基礎(chǔ)上進(jìn)行了動(dòng)物栓塞效果的初步實(shí)驗(yàn)。1.1.2.4 殼聚糖微球殼聚糖無毒，具有很好的生物相容性和生物可降解性。殼聚糖曾被提出制成微球，包封小分子抗炎藥物。殼聚糖微球的制備有乳化交聯(lián)、蒸發(fā)溶劑、噴霧干燥等方法。Nishioka Y3等考察了抗癌藥順氯氨鉑-殼聚糖微球的釋放特性，結(jié)果表明藥物包藏量隨殼聚糖含量增大而顯著增加，殼聚糖的摻入對微球初始破裂有抑制作用，藥物釋放速度明顯減少。1.1.2.5 聚羥基丁酸酯微球聚羥基丁酸酯(PHB)為微生物合成的新型可降解材料，生物相容性好，具有中長期降解周期。其化學(xué)結(jié)構(gòu)式為：-CH(CH)3-CH2-CO-O- ，它比PLA、PLGA降解周期長，生物相容性更好，較適合作為中長期控釋藥物的載體。與目前已有的其他可生物降解材料相比，有易純化、無殘留催化劑等優(yōu)點(diǎn)。實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果與同劑量的原藥組相比，延長抗生育效果更顯著，不良反應(yīng)小，安全性高。1.1.2.6 磁性微球目前，磁性微球作為一種新型的生物分離技術(shù)和靶向藥物的載體，受到人們的廣泛關(guān)注和研究。磁性微球根據(jù)其組成材料的不同可分為磁性高分子微球、磁性生物大分子微球和磁性無機(jī)物微球。磁性微球給藥載體的特點(diǎn)是減少用藥劑量，增強(qiáng)藥物對靶組織的特異性，提高療效，減少不良反應(yīng)。1.1.2.7 生物黏附微球生物黏附微球是指藥物與黏附材料分散在載體中。這類微球在到達(dá)黏膜表面時(shí)，其中的黏附材料可與生物黏膜產(chǎn)生黏附作用，從而在黏膜表面滯留較長時(shí)間，并持續(xù)釋放藥物。其制備方法有噴霧干燥法、溶媒干燥法4等。1.1.3 殼聚糖微球的應(yīng)用1.1.3.1 緩控釋給藥殼聚糖是一種弱堿，在中性和堿性條件下不溶。在酸性介質(zhì)中，其氨基在溶液中被質(zhì)子化，成為帶正電的多聚糖，故通常使用pH值13的醋酸緩沖液作為殼聚糖溶液的溶劑。殼聚糖分子內(nèi)具有活性基團(tuán)氨基，可與含雙官能團(tuán)的醛類或酸酐類藥物發(fā)生化學(xué)交聯(lián)，使藥物大量分布于交聯(lián)結(jié)構(gòu)內(nèi)，緩慢釋放，包封在殼聚糖微球內(nèi)的藥物具有明顯的緩釋、控釋或延時(shí)釋藥5的特征。1.1.3.2 靶向給藥殼聚糖本身具有一定的黏膜黏附性，通過控制殼聚糖微球的大小、形狀，選擇適當(dāng)?shù)慕o藥方法，能夠提高殼聚糖微球的靶向效果。1.1.3.3 生物大分子給藥隨著生物技術(shù)的發(fā)展，疫苗、蛋白質(zhì)這類藥物具有活性高、療效穩(wěn)定、毒副作用小、用量少等突出優(yōu)點(diǎn)，但是疫苗、蛋白質(zhì)類藥物還具有分子質(zhì)量大，在體內(nèi)外的穩(wěn)定性差，容易受體內(nèi)酶、微生物、體液所降解，生物膜通透性差，半衰期短等缺點(diǎn)，使得疫苗、蛋白質(zhì)類藥物的臨床應(yīng)用大受限制。而將疫苗、蛋白質(zhì)類藥物制成微球系統(tǒng)給藥，不僅能夠有效防止藥物在體內(nèi)的很快降解，還能將藥物緩慢釋放并靶向送達(dá)體內(nèi)的作用部位，從而達(dá)到長效緩釋靶向目的。1.1.3.4 黏膜黏附給藥殼聚糖具有較好的黏膜黏附性，在酸性環(huán)境下黏附力最強(qiáng)，且具有一定的促滲作用。殼聚糖的黏附機(jī)制主要是與黏液中的糖蛋白產(chǎn)生非共價(jià)鍵，如氫鍵、范德華力、離子間的相互作用等。1.1.3.5 降低藥物的毒副作用，提高療效載有藥物的殼聚糖微球隨血液循環(huán)到達(dá)靶區(qū)周圍釋放藥物，使靶區(qū)周圍很快達(dá)到有效的治療藥物濃度，而在機(jī)體其他部位藥物的分布量較小，從而減少了對機(jī)體正常組織的毒副作用。同時(shí)由于載體殼聚糖自身具有一定的生理活性，與藥物可產(chǎn)生協(xié)同作用增強(qiáng)療效。 1.1.3.6 提高疏水性藥物對細(xì)胞膜的通透性殼聚糖微球溶脹引起的擴(kuò)散釋藥過程可以增加藥物在吸收部位的濃度梯度，對藥物的吸收具有協(xié)同促進(jìn)作用。同時(shí)殼聚糖分子可以改變膜轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制，打開細(xì)胞通道，有利于提高藥物在細(xì)胞間瞬間滲透的能力，促進(jìn)藥物在細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮藥效。殼聚糖微球可以改變膜轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制，增加藥物對生物膜的通透性，有利于藥物在細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮藥效。1.1.3.7 提高藥物的穩(wěn)定性抗生素口服給藥時(shí)存在作用部位濃度低、滯留時(shí)間短，在酸性胃液中不穩(wěn)定等問題。殼聚糖微球作為抗生素藥物的載體，能提高藥物穩(wěn)定性，保持藥物活性。另外，隨著生物技術(shù)的發(fā)展、基因重組肽和蛋白質(zhì)藥物不斷涌現(xiàn)，且越來越多地應(yīng)用于臨床。與化學(xué)合成藥物相比，肽類藥物6具有毒副作用輕，吸收快的特點(diǎn)，但由于此類藥物在胃腸道內(nèi)極易被酶降解，因而臨床上一般采用注射方式給藥；因其普通注射劑半減期較短，為維持體內(nèi)有效治療濃度，需要長期頻繁注射給藥，如采用皮下或肌肉注射，生物利用度也不高；此外，多數(shù)肽類藥物不易透過生物膜屏障，從而使療效受到影響。若考慮將這類藥物用殼聚糖包覆后可明顯提高藥物的穩(wěn)定性。1.1.3.8 基因治療殼聚糖是一種并不多見的無生物毒性的堿性多糖，具有良好的組織相溶性，易于生產(chǎn)和儲存，成為一種高效載體應(yīng)用于基因治療7領(lǐng)域。1995年，Mumper等人首次進(jìn)行了殼聚糖-DNA復(fù)合物的制備。這種復(fù)合物是殼聚糖以溶液的形式與DNA自聚集形成沉淀，從而制備得到大小為150-500nm的微球，使它在基因治療領(lǐng)域作為載體成為可能。殼聚糖作為一種具有廣泛應(yīng)用的基因治療載體，對其應(yīng)用目前僅限于實(shí)驗(yàn)室研究，有待進(jìn)一步系統(tǒng)深化。2 文獻(xiàn)綜述2.1 殼聚糖甲殼素(chitin)是廣泛存在蝦、蟹和昆蟲甲殼中的物質(zhì)，也存在于低等植物中，如：菌、藻類的細(xì)胞壁中，自然界每年生物合成的甲殼素有數(shù)十億噸之多，在自然界的含量僅次于纖維素，殼聚糖(CS)是甲殼素的脫乙酰產(chǎn)物。由于殼聚糖分子內(nèi)存在大量的游離胺基，使其溶解性能提高，反應(yīng)活性增強(qiáng)，從而應(yīng)用范圍也大大拓寬，所以殼聚糖在化工、輕工、醫(yī)藥、食品及環(huán)境保護(hù)等領(lǐng)域中的開發(fā)應(yīng)用研究十分活躍8。2.1.1 殼聚糖的性質(zhì)殼聚糖，學(xué)名為(1,4)-2-氨基-2-脫氧-D-葡聚糖，是自然界存在的唯一堿性多糖，通常甲殼素的脫乙酰度超過55時(shí)就叫殼聚糖，而作為工業(yè)品的殼聚糖，N-脫乙酰度在70以上，不溶于水和有機(jī)溶劑，可溶于pH6.5的稀酸。在稀酸中，其葡萄糖氨基轉(zhuǎn)化為R-NH3+ ，形成聚陽離子凝膠溶液9。具有良好的生物相容性和生物可降解性，不僅無毒無味，而且有抗菌消炎、促進(jìn)傷口愈合、抗酸、抗?jié)儭⒔抵?、降低膽固醇及直接抑制腫瘤細(xì)胞的作用。2.1.2 殼聚糖在化工、生物領(lǐng)域的應(yīng)用研究甲殼素及其衍生物的應(yīng)用很廣泛，可以用作紡織品的防縮、防皺整理劑，涂料印花固著劑以及防雨布上漿劑。利用殼聚糖制成的高效絮凝劑能夠有效地改善水質(zhì)，對工業(yè)廢水的金屬離子有著良好的吸附性能，并可以從海水中吸附鈾，在造紙工業(yè)上可以制成紙張整理劑，提高紙張的抗拉、抗撕強(qiáng)度以及電絕緣性能等。在醫(yī)療方面也有著廣泛的應(yīng)用，利用殼聚糖制成具有良好的生物相容性的吸水薄膜，制成合成皮膚10可用于醫(yī)治燒傷，利用殼聚糖制成的隱形眼鏡片無須用機(jī)器打磨，大大降低隱形眼鏡的成本。在農(nóng)業(yè)中充分利用甲殼質(zhì)，則可增加產(chǎn)量。在種籽表面涂上一層殼聚糖，就能減少真菌的侵襲，加強(qiáng)植物的抗病能力，也可防蟲害。試驗(yàn)證明，在小麥和豌豆的種籽上涂一層甲殼質(zhì)，就能使產(chǎn)量增加一成或三成。同時(shí)也可以用作食品及飼料添加劑及高級食品的軟包裝材料，例如，將殼聚糖用超聲波降解為低殼聚糖，此糖具有抗腫瘤的生理功能，是雙歧乳桿菌的生長因子，而且它還具有促進(jìn)四環(huán)素、鐳素等抗菌素吸收進(jìn)入血液中的效用，對人體有益無害。因而可代替常用的防腐劑苯甲酸鈉和苯甲酸（這兩種物質(zhì)對肝功能衰弱的人是有害的）。又因?yàn)闅ぞ厶莵碓簇S富，具有機(jī)械性能良好，化學(xué)性質(zhì)較穩(wěn)定、無毒、無抗原性等特點(diǎn)，一般可用作固定化酶載體11。在化妝品工業(yè)上也有著廣泛的應(yīng)用，將殼聚糖經(jīng)羧甲基化得到的羧甲殼聚糖，它與透明質(zhì)酸（在醫(yī)學(xué)、化妝品工業(yè)中得到廣泛應(yīng)用）具有十分相似的分子結(jié)構(gòu)，日后有望替代透明質(zhì)酸。2.1.3 殼聚糖在醫(yī)藥方面的研究殼聚糖有殺菌、抑菌、消炎和促進(jìn)傷口愈合的功能，還可降低膽固醇，增強(qiáng)免疫力，排除體內(nèi)毒素，且有親和性，不與體液起反應(yīng)，也無抗原反應(yīng)。早在1979年，學(xué)術(shù)界就將其抗菌機(jī)理推測分為兩類，一類是以細(xì)菌帶負(fù)電荷的細(xì)胞膜為作用靶的機(jī)理；另一類是以細(xì)菌分子中DNA為作用靶的抗菌機(jī)理。由于殼聚糖本身特有的性質(zhì)，能與許多物質(zhì)化合，制成特殊的藥物，以殼聚糖為包裹材料包埋自制的磁流體，并偶聯(lián)色素配基得到一種新型親和磁性毫微粒，這種微粒在細(xì)胞分離、固定化酶、免疫診斷及腫瘤靶向治療等許多方面均有應(yīng)用。將殼聚糖和絲心蛋白共混可交聯(lián)成半互穿聚合物網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，具有智能水凝膠的性能，用此聚合物制成包藥微球，形成緩釋劑，減少服藥次數(shù)和藥物的不良反應(yīng)。2.2多聚磷酸鈉多聚磷酸鈉(TPP)，分子式為Na5P3O10，是一種白色結(jié)晶或結(jié)晶性粉末，有吸濕性，溶于水。在酸性溶液中煮沸，水解成正磷酸鹽。有刺激性，對堿金屬與重金屬鹽有絡(luò)合能力，能軟化硬水，可調(diào)節(jié)緩沖皂化值的pH值。具有離子交換性能，使懸浮液變成溶液，一般作為分離分散和抗絮凝劑，分離堿土和重金屬離子。主要用作合成洗滌劑的助劑、鉆井泥漿分散劑、造紙用油點(diǎn)防止劑和陶土分散劑。2.3 戊二醛戊二醛(GTA)由于分子式兩端各有一個(gè)醛基，是一種優(yōu)良的雙官能團(tuán)交聯(lián)劑。它與蛋白質(zhì)交聯(lián)的特點(diǎn)是交聯(lián)性能好，結(jié)合量多，結(jié)合牢固性較大，且能夠保持蛋白質(zhì)的原有構(gòu)型。戊二醛主要應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)工程、免疫化學(xué)、皮革化學(xué)、食品微生物工業(yè)、石油開采、環(huán)境保護(hù)等諸多工業(yè)。2.4 兩步固化法離子交聯(lián)法是目前在載藥殼聚糖微粒的研究中使用最多的制備方法。它是利用無不良反應(yīng)的三聚磷酸鈉(TPP)對殼聚糖進(jìn)行離子誘導(dǎo)凝膠化形成微球。在室溫?cái)嚢柘?，將pH值79的TPP溶液滴加到pH值46殼聚糖乙酸溶液中，通過帶負(fù)電的磷酸根離子與殼聚糖分子鏈上帶正電的質(zhì)子化氨基發(fā)生分子內(nèi)和分子間交聯(lián)凝膠化，便可迅速生成微球。Xu等將不同相對分子質(zhì)量和脫乙酰度的殼聚糖制成不同濃度的乙酸溶液，再與不同濃度TPP反應(yīng)。在包裹牛血清白蛋白(BSA)的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)TPP質(zhì)量濃度為1 gL-1 時(shí)，降低殼聚糖溶液質(zhì)量濃度至0.5gL-1，會出現(xiàn)大粒徑的聚集體；增大殼聚糖質(zhì)量濃度至4 gL-1，BSA包封率降低。另外，殼聚糖相對分子質(zhì)量和脫乙酰度的增加都能提高BSA的包封率，同時(shí)也都會降低BSA的體外釋放速率?；瘜W(xué)交聯(lián)法利用殼聚糖分子鏈上的氨基或羥基與一些化學(xué)交聯(lián)劑反應(yīng)的特性，可在一定條件下制備出藥物微球。有實(shí)驗(yàn)表明，微球粒徑隨交聯(lián)度增加而數(shù)倍地增長，另外透射電鏡顯示高交聯(lián)度粒子容易發(fā)生聚集現(xiàn)象。需要指出的是，化學(xué)交聯(lián)往往會對細(xì)胞的存活率和大分子藥物的完整性產(chǎn)生不利影響，且交聯(lián)劑毒性較大，因而用該法制得的殼聚糖藥物載體在應(yīng)用上有一定局限性。3 技術(shù)路線3.1 TPP-GTA為交聯(lián)劑制備CS微球取一定量的CS溶于2ml HAc溶液中，作為水相。將液體石蠟20ml和1.0%的吐溫-80加至水相中，室溫2000rmp攪拌乳化30 min制成W/O型乳劑，在磁力攪拌的作用下加入0.3ml一定濃度的GTA固化，固化一定時(shí)間后，加入定量的石油醚離心10min，傾去油相，用去離子水洗滌數(shù)次，冷凍干燥，制得載藥微球。3.2 CS微球表面形貌觀察采用透射電鏡觀察形態(tài)下觀察微球形態(tài)。 3.3 CS微球體外釋放性能的研究精密稱取CS微球約10mg置透析袋中，加磷酸鹽緩沖液(PBS, pH 7.4) 2ml，然后用透析夾夾緊，靜置于100ml PBS中。分別于10min，20min，30min，1h，2h，3h，5h，8h，16h，24h，48h從外部溶液中取樣3ml，同時(shí)補(bǔ)充磷酸鹽緩沖液3ml。所取樣液測定其266 nm處紫外光密度值，由標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算藥物累計(jì)釋放率。4 進(jìn)度安排9月22日9月28日 在導(dǎo)師指導(dǎo)下，準(zhǔn)備資料、儀器設(shè)備，并確定課題。9月28日10月22日 撰寫開題報(bào)告、翻譯文獻(xiàn)。制備微球顆粒；考察體外釋放性能；觀察微球成球性。10月22日10月30日 撰寫論文。5 參考文獻(xiàn)1陳智,田景振.藥用微球應(yīng)用概況J.齊魯藥事,2009,28(3):164-167.2丁紅,刑桂琴,謝茵.阿霉素明膠微球的制備與特性研究J.中國醫(yī)院藥學(xué)雜志,2000，20(7):387-389.3Nishioka Y,Kyotani S,Okamura M,et al.Release characterist ics of