(符小燕)漆酶高產(chǎn)菌株的篩選及產(chǎn)酶條件的優(yōu)化

大學生科技創(chuàng)新漆酶高產(chǎn)菌株的篩選和產(chǎn)酶條件的優(yōu)化符小燕 刁惠萍指導教師 林俊芳 研究員學院名稱食品學院 專業(yè)名稱03食品科學與工程摘 要漆酶是一種含銅的多酚氧化酶（Laccase ，pdiphenol oxidase ,EC)，具有降解木質素，去除酚類和芳胺類化合物的毒性作用，漆酶的造紙工業(yè)，環(huán)境保護，食品工業(yè)具有廣泛的應用價值。本課題主要選取實驗室現(xiàn)有的大型真菌，及從野外采集華南地區(qū)特色菌株進行產(chǎn)漆酶菌株的初篩，并進行產(chǎn)酶條件的研究。實驗結果如下：（1） 用PDABavendamn方法進行漆酶菌株的初篩。從69個土樣和本實驗室現(xiàn)有的大型真菌菌株共200株，篩選出兩個漆酶野生菌株M1、M2及十六個大型真菌漆酶菌株。（2） 選取兩個野生菌株M1、M2和一個大型真菌菌株（菌株2號）進行液體發(fā)酵，優(yōu)化產(chǎn)酶培養(yǎng)條件。 比較研究了天然馬鈴薯培養(yǎng)基中添加不同營養(yǎng)物質的培養(yǎng)基對菌株M1，M14的產(chǎn)酶的影響。與其他培養(yǎng)基相比，添加有淀粉的PDA培養(yǎng)基漆酶活性較高。 對于菌株2號，搖瓶培養(yǎng)比靜止培養(yǎng)能明顯加快產(chǎn)酶的速度，縮短了最高產(chǎn)酶的天數(shù)。 不同碳源對菌株2號漆酶的分泌的影響很大，產(chǎn)漆酶最好的碳源是麥芽提取物，其次是淀粉和葡萄糖，最低的是蔗糖。 不同的葡萄糖添加量對菌株2號漆酶分泌影響不顯著。 不同的氮源對菌株2號分泌漆酶活性影響很大，與無機氮相比，有機氮對漆酶分泌影響較大。最佳的氮源是酪蛋白胨，其次是酵母膏，漆酶活性最低是硝酸銨。 銅離子的菌株2號漆酶分泌影響較大，與對照（銅離子濃度0mmol/L）相比，添加銅離子達到終濃度為0.1mmol/L，漆酶最高活性提高3倍。(3) 比較目前研究最多的漆酶菌株側耳和菌株2號分泌漆酶最高酶活，得出本實驗篩選得到的菌株2號的最高酶活明顯比側耳的高，差不多是側耳分泌漆酶最高酶活的2倍。關鍵詞 漆酶 篩選 產(chǎn)酶條件目 錄1 前言.1 2 材料與方法.2 2.1 材料. 2 2.1.1 土樣.2 2.1.2 菌種 .2 2.1.3 試劑.2 2.1.4 主要試劑的配制.2 2.1.5 器材.3 2.2 培養(yǎng)基. 3 2.2.1 PDA固體培養(yǎng)基. 3 2.2.2 PDA液體培養(yǎng)基. 4 2.2.3 漆酶菌株初篩培養(yǎng)基.4 2.2.4 產(chǎn)酶培養(yǎng)基.4 2.3 方法. 4 2.3.1 漆酶菌株的篩選.4 土壤漆酶菌株的篩選. 4 現(xiàn)有大型真菌漆酶菌株的篩選. 4 2.3.2 漆酶菌株液體發(fā)酵培養(yǎng).4 2.3.3 漆酶活性的測定. 5 3 結果與分析.5 3.1 漆酶菌株的篩選結果. 5 3.1.1 土壤中產(chǎn)漆酶菌種的篩選.5 3.1.2 現(xiàn)有的大型真菌漆酶菌株的篩選.6 3.2 漆酶菌株產(chǎn)酶條件的研究. 7 3.2.1 不同營養(yǎng)物質對M1和M14號菌株的產(chǎn)漆酶的影響. .7 3.2.2 搖瓶和靜止培養(yǎng)對菌株2號漆酶分泌的影響. 8 3.2.3 不同碳源對菌株2號漆酶分泌的影響. .9 3.2.4 不同氮源對菌株2號漆酶分泌的影響.10 3.2.5 碳源添加量對菌株2號漆酶分泌的影響.10 3.2.6 銅離子對漆酶分泌的影響.11 3.3 與對照漆酶菌株（側耳）漆酶活性的比較.11 4 討論和結論.12 4.1 平板篩選產(chǎn)漆酶菌種.12 4.2 對M1和M2的產(chǎn)酶研究.12 4.3 對2號菌種的產(chǎn)酶條件的優(yōu)化.12 4.4 2號菌種與對照漆酶菌株（側耳）漆酶活性的比較.13 致詞.14參考文獻.15 英文摘要.171 前 言漆酶是一種含銅的多酚氧化酶(Laccase, P-diphenol oxidase, EC.)，廣泛分布于高等動植物、昆蟲、真菌分泌物和少量細菌中，其中最主要的是擔子菌亞門的白腐真菌。按其來源主要分為漆樹漆酶(Rhus Laccase)和真菌漆酶(Fungal Laccase)兩大類,還有從稻根生脂固氮螺菌(Azospirilium Lipofcrum)上分離得到的細菌漆酶。此外,馬鈴薯、毒萵苣、香蕉、桃子、咖啡豆、苜?；ǖ戎参镏幸埠衅崦?甚至在一些動物腎臟(如豬腎)和血清中也發(fā)現(xiàn)了漆酶1。漆酶為含銅的糖蛋白，約由 500 個氨基酸組成，多為單一多肽，個別為四聚體。糖配基占整個分子的 10%45%，糖組成包括氨基己糖、葡萄糖、甘露糖、半乳糖、巖藻糖和阿拉伯糖等。由于分子中糖基的差異，漆酶的分子量隨來源不同會有很大差異，甚至來源相同的漆酶分子量也會不同。通過對漆酶蛋白質晶體結構的研究發(fā)現(xiàn),漆酶具有3個銅離子結合位點,共結合4個銅離子,且這4個銅離子處于漆酶的活性部位,在催化氧化反應中起決定作用，如果除去銅離子,漆酶將失去催化作用7。漆酶具有較強的氧化還原能力，能催化多酚、多氨基苯等物質的氧化，使分子氧直接還原成水，將酚類和芳胺類化合物還原成醌類物質，沒有副產(chǎn)物的生成。由于漆酶具有特殊的催化性能和廣泛的作用底物，使得漆酶具有廣泛的應用價值。漆酶應用主要集中在制漿造紙，特別是紙漿的生物漂白，環(huán)境保護，木質纖維素降解等方面。造紙工業(yè)方面，由于漆酶能高效的降解木質素及與木質素具有相似結構的物質，避免造紙工序中所使用的化學物質影響環(huán)境。環(huán)境保護方面，漆酶能有效的除去工業(yè)廢水、化學農(nóng)藥當中的毒物酚、芳胺、單寧和酚醛化合物，生物消除有毒化合物，使得漆酶在廢水處理等環(huán)保事業(yè)有廣闊的前景。在食品工業(yè)，由于能催化酚類物質的降解而廣泛應用于飲品的澄清和穩(wěn)定等方面3。此外，漆酶在酶免疫測定(EIA) 、生物檢測及有機合成等方面得到了不同程度的應用。多年來，漆酶一直是研究的熱點，涉及生物化學、物理、醫(yī)學、環(huán)境等多個領域，尤其是它在木質素降解、微生物菌體形態(tài)發(fā)生以及植物病原等方面的研究較為突出,在制漿造紙工業(yè)的紙漿生物漂白、廢水處理等方面更具有極大的環(huán)保研究價值和應用潛力。這一研究不僅為人類了解天然物質，探索生命現(xiàn)象提供信息，而且對生物資源的開發(fā)和利用都有重要意義2。因此,篩選一些漆酶高產(chǎn)菌株和研究產(chǎn)酶的優(yōu)化條件是一項具有重要現(xiàn)實意義的工作。本實驗從土壤、從野外采集華南地區(qū)特色菌株共200種菌株以及從實驗室現(xiàn)有的大型真菌菌株中進行產(chǎn)漆酶菌株的篩選。并對各別篩選出菌種做產(chǎn)酶優(yōu)化條件的研究。本實驗不盡為實驗室保留寶貴的菌種，也為菌種產(chǎn)酶條件的優(yōu)化研究增添了豐富的資料，為今后漆酶的研究打下堅實的基礎。2 材料與方法2.1 材料2.1.1 土樣 169號土樣，采于華南農(nóng)業(yè)大學的菜地、草地、樹木園、湖邊淤泥中及湖邊的枯木堆中。2.1.2 菌種 野外采集具有華南地區(qū)特色大型真菌200種菌株（未知名）和實驗室提供的一些菌種，如側耳。2.1.3 試劑 愈創(chuàng)木酚 上?；瘜W試劑總廠生產(chǎn) 分析純ABTS2，2-Azino-bis-(3-ethylbenztbiozoline6-sulfonicacid)片劑，上海生工公司生產(chǎn)CuSO45H2O 廣東臺山粵僑試劑塑料有限公司 分析純 檸檬酸 廣州化學實際廠 分析純檸檬酸鈉 成都市聯(lián)合化工試劑研究所 分析純KH2PO4 廣東光華化學廠有限公司 分析純MgSO47H2O 廣東光華化學廠有限公司 分析純吐溫80 天津博迪化工有限公司 分析純葡萄糖 市售馬鈴薯 市售2.1.4 主要試劑的配制（1） 0.2mmol/L pH4.5檸檬酸檸檬酸鈉緩沖溶液 A液：0.2mmol/L檸檬酸溶液：稱取檸檬酸21.014g，加入蒸餾水溶解定容至500mL。 B液：0.2mmol/L檸檬酸鈉溶液：稱取檸檬酸鈉29.412g，加入蒸餾水溶解定容至500mL。A液和B液混合，攪勻，于pH計上調節(jié)至pH4.5，即為0.2mmol/L pH4.5檸檬酸檸檬酸鈉緩沖溶液。（2） 0.5mmol/L的ABTS溶液將一片ABTS片劑（142mg/片）用0.2mmol/L pH4.5檸檬酸檸檬酸鈉緩沖溶液溶解定容至250mL，配成1.0308mmol/L的ABTS母液；再取48.5mL的ABTS母液，用0.2mmol/L pH4.5檸檬酸檸檬酸鈉緩沖溶液定容至100mL。（3） 微量元素溶液（1L）MgSO47H2O 3.0g，MnSO4H2O 0.5g，CoCl26H2O 0.1g，ZnSO47H2O 0.1g，CuSO45H2O 0.1g，KAl（SO4）212H2O 10mg，HBO3 10mg，Na2MoO42H2O 10mg（4） 去銅離子微量元素水溶液（1L）MgSO47H2O 3.0g，MnSO4H2O 0.5g，CoCl26H2O 0.1g，ZnSO47H2O 0.1g， KAl（SO4）212H2O 10mg，HBO3 10mg，Na2MoO42H2O 10mg（5） 100mmol/L CuSO4溶液取2.4968g CuSO45H2O加蒸餾水定容至100mL2.1.5 器材SI900R搖床，韓國出產(chǎn)；LRH70生化培養(yǎng)箱，上海一恒科學儀器有限公司；752紫外可見光分光光度計，上海精密科學儀器有限公司；Universal 16R 高速冷凍離心機；HHS型電熱恒溫水浴鍋，上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠；自動滅菌鍋，山東新華醫(yī)療器械股份有限公司；超凈工作臺，蘇凈集團安泰公司制造。2.2 培養(yǎng)基2.2.1 PDA固體培養(yǎng)基去皮馬鈴薯200g（水煮20分取其汁），葡萄糖20g，瓊脂粉20g，加自來水至1L，pH自然，121滅菌20min。2.2.2 PDA液體培養(yǎng)基馬鈴薯液體培養(yǎng)基：去皮馬鈴薯200g（水煮20分取其汁），加自來水至1L，pH自然，121滅菌20min。2.2.3 漆酶菌株初篩培養(yǎng)基PDA固體培養(yǎng)基中加入愈創(chuàng)木酚0.04，pH自然，121滅菌20min。2.2.4 產(chǎn)酶培養(yǎng)基葡萄糖 20g，酵母提取物 2.0g， KH2PO4 0.17g，MgSO47H2O 0.44g，CaCl22H2O 0.37g。吐溫80 0.50mL，微量元素 80mL。加蒸餾水至1L，PH自然，121滅菌20min。（根據(jù)實驗調整碳源和氮源）2.3 方 法2.3.1 漆酶菌株的篩選 土壤漆酶菌株的篩選將所采集土樣NO. 169號各取1g溶于9ml的無菌水中，振蕩器振蕩，制得土樣懸液，然后吸取1ml土樣懸液加入9ml無菌水中，充分混勻，制得稀釋10倍的土樣懸液。吸取稀釋10倍的土樣懸液1ml于培養(yǎng)皿里，倒入大概50的篩選培養(yǎng)基1cm厚，混勻，靜置凝結。置于28的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2天后每天觀察菌落周圍顏色變化情況。 將有紅色菌圈或者有可能產(chǎn)生紅色圈的菌種挑出5mm5mm一塊，再次接入篩選培養(yǎng)基上培養(yǎng)。若發(fā)現(xiàn)有雜菌，需再次進行分離，直到?jīng)]有雜菌為止，并給其拍照。 同時把最后有紅色圈的菌種挑入PDA培養(yǎng)基中培養(yǎng)，反復純化處理，得到純的菌落，PDA斜面接種置于4的冰箱中保留菌種。 現(xiàn)有大型真菌漆酶菌株的篩選將待篩選野生菌種和實驗室菌種取其菌絲于平板PDA固體培養(yǎng)基上活化培養(yǎng)，5天后，將活化了的菌種接種于平板初篩培養(yǎng)基上，30恒溫培養(yǎng)，4天后觀察它們的顯色情況。將顯色的菌種編號，拍照。2.3.2 漆酶菌株液體發(fā)酵培養(yǎng)產(chǎn)酶培養(yǎng)基分裝于250mL三角瓶中，每瓶100mL，在121滅菌30min。每瓶接種帶有菌絲的瓊脂塊4塊(5mm5mm)，每個梯度兩個重復，30，110r/min搖瓶培養(yǎng)。2.3.3 漆酶活性的測定 在無菌超凈臺中，用移液器每瓶取出1ml酶液到離心管中。 取樣結束后，每支離心管中加入一定量已滅菌的檸檬酸檸檬酸鈉溶液稀釋。 將裝有樣本酶液的離心管放入高速冷凍離心機中，10000rpm， 4，離心10分鐘。 將樣品管，空白管，0.5mmol/LABTS放在恒溫水浴鍋中，30預熱10min。 加入適量預熱好的酶液和0.5mmol/LABTS溶液達到3mL的反應液，于1cm比色皿中，啟動反應5分鐘，測定420nm下吸光值隨時間的變化值，每分鐘讀一次數(shù)。在上述條件下，取吸光值變化的線性部分，定義每分鐘轉化1umol的底物所需的酶量為一個酶活力單位，用U/mL表示。運用以下公式計算酶活。漆酶酶活力U/mL =式中： -ABTS在420nm下吸光系數(shù)，為； -1min；-1min內，吸光度OD的變化值； V1-酶反應中，反應液的總體積，3mL； V2 -酶反應中，酶液的體積。3 結果與分析3.1 漆酶菌株的篩選結果由于微生物分泌的漆酶能催化愈創(chuàng)木酚，在菌落周圍形成紅褐色的輪環(huán)，因此根據(jù)紅色圈的有無和大小，可以初步判斷該菌是否產(chǎn)漆酶及酶活的高低。3.1.1 土壤中產(chǎn)漆酶菌種的篩選將所采集土樣的懸液接種至初篩培養(yǎng)基上，培養(yǎng)了2天后，培養(yǎng)基上零星有菌落長出來了，三天后菌落逐漸長大，在第4天其中14號有一個菌落的周圍有紅褐色的菌圈，其他菌株的生長情況良好。用平板篩選法，對不同菌落進行菌種轉移，并對應標號。其中14號和1號培養(yǎng)皿中的菌落周圍都有明顯的紅褐色圈，分別給兩個菌種取名為M1和M14。以下是3天后的顯紅褐色菌圈圖，如下圖1，圖2所示。初步確定這兩種菌株能夠產(chǎn)漆酶，且菌圈很大，酶活估計不低。 圖1 1號皿中M1菌的變色圈圖圖2 14號皿中M14菌的變色圈圖3.1.2 現(xiàn)有的大型真菌漆酶菌株的篩選用初篩培養(yǎng)基培養(yǎng)4天后，有16個皿中菌落周圍出現(xiàn)紅褐圈，分別按116編號，下面是它們在4天后顯紅褐色圈的圖片，如圖3所示。初步確定它們都為能產(chǎn)漆酶的菌種。 圖3 116號大型真菌漆酶菌株初篩圖3.2 漆酶菌株產(chǎn)酶條件的研究3.2.1 不同營養(yǎng)物質對M1和M14號菌株的產(chǎn)漆酶的影響馬葡培養(yǎng)基：在馬鈴薯液體培養(yǎng)基中添加葡萄糖20g，酵母膏5g，MgSO47H2O 1.5g，KH2PO4 3g，pH自然。馬淀培養(yǎng)基：在馬鈴薯液體培養(yǎng)基中添加淀粉20g，酵母膏5g，MgSO47H2O 1.5g，KH2PO4 3g，pH自然。土樣中所篩的菌株M1和M14分別用馬鈴薯液體培養(yǎng)基（簡稱馬液）、馬鈴薯葡萄液體培養(yǎng)基（簡稱馬葡）和馬鈴薯淀粉液體培養(yǎng)基（簡稱馬淀），在接種量和其他培養(yǎng)條件下?lián)u瓶培養(yǎng)，第3天和第4天時測定其酶活，測得酶活所繪的柱形圖如圖4和圖5所示。圖4 不同培養(yǎng)基對M1分泌漆酶的影響從圖4中可以看出，三天時是在馬鈴薯液體中添加營養(yǎng)物質的酶活高，在第四天時，單純的馬鈴薯液體培養(yǎng)基的產(chǎn)漆酶的酶活反而比添加營養(yǎng)物質的培養(yǎng)基高，這個結果有待以后考究。第四天的酶活比第三天的酶活高，但是添加營養(yǎng)物的培養(yǎng)基的差別不大。圖5 不同培養(yǎng)基對M14的分泌漆酶的影響從圖5中可以看出，添加營養(yǎng)物質的培養(yǎng)基中產(chǎn)酶的酶活基本上比單純的馬鈴薯液體培養(yǎng)基的高；除了馬葡培養(yǎng)基外，第四天的酶活都明顯比第三天的高；馬葡的酶活反而比第三天的低，這個結果有待以后考究。3.2.2 搖瓶和靜止培養(yǎng)對菌株2號漆酶分泌的影響在接種量和其他的培養(yǎng)條件相同的情況下，用搖瓶和靜止兩種培養(yǎng)方式培養(yǎng)菌株2號，測得漆酶活性變化曲線圖如圖6所示。圖6搖瓶靜止培養(yǎng)對菌株2號漆酶分泌的影響 靜止和搖瓶培養(yǎng)的最高酶活相差不大（搖瓶培養(yǎng)245U/mL,靜止培養(yǎng)236 U/mL），但是搖瓶培養(yǎng)能明顯提前酶活高峰，比靜止培養(yǎng)縮短了12天。3.2.3 不同碳源對菌株2號漆酶分泌的影響分別用淀粉，葡萄糖，麥芽糖，麥芽提取物，蔗糖各10g來代產(chǎn)酶培養(yǎng)基中的葡萄糖(20g)，在接種量和其他培養(yǎng)條件一致的情況下?lián)u瓶培養(yǎng)。測得漆酶活性變化曲線如圖7所示。 圖7不同碳源對菌株2號漆酶分泌的影響從圖7可以看出，不同碳源對漆酶的分泌的影響很大，產(chǎn)漆酶最好的碳源是麥芽提取物，其次是淀粉和葡萄糖，最低的是蔗糖。這些碳源的酶活力曲線趨勢都差不多。3.2.4 不同氮源對菌株2號漆酶分泌的影響用胰蛋白胨，酪蛋白胨，酵母稿，酵母提取物，硝酸銨作為氮源各2g，來代替產(chǎn)酶培養(yǎng)基中酵母提取物，并且葡萄糖為10g，在接種量和其他培養(yǎng)條件一致的情況下?lián)u瓶培養(yǎng)，測酶活性，將最高酶活做柱圖如圖8所示。圖8 不同氮源對菌株2號漆酶分泌的影響從圖8中明顯可以看出，不同的氮源對漆酶的最高酶活的影響很大，有機氮源由于無機氮源，最佳的氮源是酪蛋白胨，其次是酵母膏，產(chǎn)酶酶活最低是硝酸銨。3.2.5 碳源添加量對菌株2號漆酶分泌的影響雖然在最佳碳源的實驗中得出最佳的碳源是麥芽提取物，但是由于麥芽提取物作為碳源的成本太高了，本實驗選用經(jīng)濟的葡萄糖作為碳源，添加量分別為5g/L, 10g/L, 15g/L,20g/L, 25g/L，在接種量和其他培養(yǎng)條件一致的情況下?lián)u瓶培養(yǎng)，測得漆酶活性變化曲線如圖9所示。圖9 不同碳源添加量對漆酶分泌的影響由圖9可以看出，不同的碳源葡萄糖的添加量的五個梯度的酶活曲線趨勢都差不多一致，葡萄糖的添加量對漆酶分泌影響不顯著。3.2.6 銅離子對漆酶分泌的影響用產(chǎn)酶培養(yǎng)基，在接種量和其他培養(yǎng)條件一致的情況下，開始搖瓶培養(yǎng)六天后添加不同量的銅離子，使銅離子終濃度達到0.1mmol/L,0.2 mmol/L,0.5 mmol/L,1.0 mmol/L,2.0 mmol/L，加入銅離子后測得的酶活的曲線圖如圖10所示。 圖10銅離子濃度對漆酶分泌的影響從圖10中可以看出，與對照相比，銅離子對漆酶活性有明顯影響，銅離子濃度在0 .1mmol/L到2.0mmol/L的范圍，濃度為0.1mmol/L 為產(chǎn)酶最高酶活的最佳的添加濃度；同時也可以得出在此范圍內，銅離子為1mmol/L時，曲線相對平緩，酶活變化相對較小。3.3 與對照漆酶菌株（側耳）漆酶活性的比較碳源和氮源分別是淀粉（10g/L）和酪蛋白胨(2g/L)代替液體培養(yǎng)基中的葡萄糖和胰蛋白，并添加銅離子濃度為1mmol/L，其他的培養(yǎng)條件一樣，測得的最高酶活所作的柱形圖如圖7所示。 圖7 與對照漆酶菌株最高酶活比較圖從圖7中明顯可以看出，所篩的2號菌株的最高酶活明顯比側耳的高，差不多是側耳菌種的2倍。4 結論與討論4.1 平板篩選產(chǎn)漆酶菌種本實驗通過加有愈創(chuàng)木酚的PDA培養(yǎng)基從69個土樣，200種野生菌種篩選中篩選出菌落周圍紅褐色圈大的2株高產(chǎn)漆酶的菌株M1和M14，及編號為116的16株高產(chǎn)漆酶的菌株。4.2 對M1和M2的產(chǎn)酶研究本實驗對M1和M14做了馬鈴薯液體培養(yǎng)基及在其中添加一些營養(yǎng)物質的培養(yǎng)基對產(chǎn)酶的影響。對于M1，在第三天的酶活最高的是加有淀粉的馬鈴薯培養(yǎng)基，第四的時候是馬鈴薯液體培養(yǎng)基的產(chǎn)酶活最高。按理來說應該是添加有豐富碳源和氮源的培養(yǎng)基的產(chǎn)酶高，此結果有待進一步研究。對于M14，在第三天和第四的酶活最高的都是加有淀粉的馬鈴薯培養(yǎng)基。要進一步的實驗和研究才能給下定論哪種培養(yǎng)基是最優(yōu)的。4.3 對2號菌種的產(chǎn)酶條件的優(yōu)化（1）搖瓶培養(yǎng)比靜止培養(yǎng)能加快產(chǎn)酶的速度，縮短最高產(chǎn)酶的天數(shù)。那是由于搖瓶培養(yǎng)的得到氧氣和營養(yǎng)物質較均勻，菌種的生長快，使得產(chǎn)酶快的原因。（2）由本實驗室可得，對于菌株2號漆酶分泌，最佳的碳源是麥芽提取物，其次是葡萄糖。碳源是構成微生物細胞代謝的營養(yǎng)物質，按理來說在一定的碳源濃度范圍內應該有一個濃度是高產(chǎn)漆酶的最佳值，可是本實驗卻出現(xiàn)在5g/L25g/L的濃度范圍上沒有多大的區(qū)別，具體的原因還要待深入的研究。（3）氮源對漆酶活性的影響很大，這是由于漆酶的催化能力受到其自身催化反應活性中心位點附近的氨基酸配體影響，而培養(yǎng)基中的氮源物質則是合成氨基酸配體的原料，本實驗得出有機氮源優(yōu)于無機氮源，實驗所選的五種氮源中最佳產(chǎn)酶的氮源是酪蛋白胨。（4）銅離子的添加對漆酶活性的影響很大同時由于漆酶的催化活性中心是由四個銅離子構成，因此培養(yǎng)基中添加銅離子能很好促進漆酶的合成，為漆酶的合成提供關鍵銅元素，從而與提高漆酶的活性?？墒倾~是重金屬，高濃度的銅離子在一定的程度上會抑制菌種的生長，而低濃度又不利于漆酶的合成。本實驗銅離子濃度在0 .1mmol/L到2.0mmol/L的范圍內，濃度為0.1mmol/L 為產(chǎn)酶最高酶活的最佳的添加濃度，銅離子為1mmol/L時，最高酶活的產(chǎn)期較長。在實際的生產(chǎn)中，銅離子的添加量視具體情況而定。4.4 菌株2號與對照漆酶菌株（側耳）漆酶活性的比較 本實驗得出2號菌種的最高酶活差不多是目前研究最多的側耳的2倍，說明本實驗所篩的菌種產(chǎn)酶的酶活性較高，基本達到了高產(chǎn)漆酶菌株的篩選的目的。若用在實際的生產(chǎn)漆酶中可以大大地降低產(chǎn)酶的成本。致 謝本實驗能順利完成，離不開林俊芳教授、郭麗瓊教授和韓君莉師姐的悉心指導和鼓勵，在此向以上三位表示衷心的感謝！同時也感謝實驗室的老師、其他的師兄師姐和同學給予的幫助和支持。再一次誠摯地向所有幫助和關心過我們的人表示衷心的感謝！Screening for Novel Laccase-producing Microbes and Optimize the Laccase-producing ConditionFu Xiaoyan, Diao Huiping (College of Food Science, South China Agricultural University Guangzhou 510642,China）Abstract：Laccases,（pdiphenol oxidase ,EC）,are a sort of coppery polyphenol oxidases, which possess lignin degradation, detoxification of phenols and amine groups. Laccases are widely used in pulp industry, bioremediation and food industry. The task mostly chosen the fungi in lab and field acquisition bloom south region feature strains to make the primary laccase-producing screening test and do some laccase-producing conditional researchs. The experiment results are as follows:(1) From sixty-nine soil samples and the two hundred fungi strains in lab, we screened out two wild laccase strains( M1 and M14 )and sixteen fungi laccase strains.(2) Choose two wild strains(M1 and M14 )and one fungi strain(NO.2) to proceed liquid fermentation and optimize the producing enzyme culture conditions. Compare the effect of laccase producing fungi strains M1 and M14 with adding different nutrition in the natural potato culture medium. The result showed the activities of laccase with adding starch was higher than other culture mediums. To the strain NO.2, shake culture can accelerate the producing enzymatic speed compared with stationary culture. The different carbon source made great impact to the strain NO.2 and the result showed the best carbon source in producing laccase was malt extract, the next to starch and glucose, the minima sucrose. The different glucose rate made inconspicuousness to the laccase secretion of the strain NO.2. The different nitrogen source made great impact to the laccase secretion of the strain NO.2.Organonitrogen had more impact than inorganic nitrogen, the optimal nitrogen source was casein peptone, the next yeast extract, the worst ammonium nitrate. Copper had great impact to the laccase of the strain NO.2. compared with the strength 0mmol/l, adding the end strength of 0.1mmol/l, the supreme laccase activity can raise three times, (3) Comparing the supreme laccase enzyme activity to laccase strain Pleurotus ostreatus which is widely studied and the strain N0.2, the experiment showed the supreme enzyme activity of the NO.2 was nearly two times of laccase activity in Pleurotus ostreatus, Key words: laccase; screening ; laccase-producing condition參 考 文 獻1 Reinhammar