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膜片鉗技術(shù)講座 2006年12月 第一部分膜片鉗技術(shù)的基本概念第二部分離子通道的基本知識第三部分全細胞記錄結(jié)果舉例分析 第一部分膜片鉗技術(shù)的基本概念 學習內(nèi)容 1 膜片鉗的發(fā)展歷史2 膜片鉗的工作原理3 膜片鉗記錄常用的設(shè)備4 膜片鉗記錄的方式及基本操作5 全細胞記錄的步驟6 基本概念和參數(shù)的設(shè)置 1976年德國馬普生物物理化學研究所neher和sakmann首次在青蛙肌細胞上記錄到ach激活的單通道離子電流 從而產(chǎn)生了膜片鉗技術(shù) 1980年sigworth等獲得10 100g 的高阻封接 giga seal 1981年hamill和neher等對該技術(shù)進行了改進 引進了全細胞記錄技術(shù) 1 膜片鉗的發(fā)展歷史 內(nèi)爾 neher 薩克曼 sakmann 1944 1942 合作發(fā)明了膜片鉗技術(shù) 并應(yīng)用這一技術(shù)首次證實了細胞膜上存在離子通道 二人共獲1991年諾貝爾生理學與醫(yī)學獎 膜片鉗技術(shù) patchclamp 用微玻管電極接觸細胞膜 以吉歐姆 g 以上的阻抗使之封接 使電極開口處的細胞膜與其周圍膜在電學上絕緣 在此基礎(chǔ)上固定電位 對此膜片上離子通道的電流進行監(jiān)測記錄的方法 patchclamp鏡下觀 patchclamp鏡下觀 2 膜片鉗的工作原理 電極拉制器倒置相差顯微鏡epc 10膜片鉗放大器三維微操縱儀ced1401數(shù) 模 模 數(shù)轉(zhuǎn)換器cedepc軟件包 3 膜片鉗記錄的常用設(shè)備 電極拉制器 二步法拉制 倒置相差顯微鏡 epc 7膜片鉗放大器 德國 細胞吸附式 cell attachedmode或oncellmode 內(nèi)膜向外式 inside outmode 外膜向外式 outside outmode 全細胞記錄方式 whole cellrecording 4 膜片鉗的記錄方式及基本操作 微電極的拉制 材料 硼硅酸鹽毛細玻璃管拉制方法 二步法要求 盡可能使頭頸部短些 rs 拉制好的微電極涂硅酮樹酯 熱刨光 電極液的充灌 無氣泡充灌玻璃電極長度的1 3 微電極的安裝 記錄 測量 電極和參考電極 材料是ag 表面鍍成agcl減少接觸電位 5 全細胞記錄 電壓鉗模式 固定電壓 記錄電流 電流鉗模式 固定電流 記錄電壓 全細胞記錄的操作步驟 制作細胞涂片拉制玻璃電極灌注電極液 安裝電極在顯微鏡下找到微電極 移動三維操縱儀 使電極尖端接觸細胞用負壓輕輕抽吸 鉗緊細胞 形成全細胞記錄模式給予一定的鉗制電壓并觀察電流 全細胞記錄的形成過程 輸入漏電流 inputleakagecurrent 理論上講 不施加外部命令時 通過放大器探頭的電流應(yīng)該為0 如果由于放大器本身的原因產(chǎn)生了電流 這就是漏電流 由于放大器控制電流漂移的質(zhì)量很高 一般漏電流都很小 6 基本概念及參數(shù)設(shè)置 封接電流 sealcurrent 由于封接質(zhì)量不高 沒有形成良好的高阻封接 從封接處產(chǎn)生的電流 成為噪聲 內(nèi)向電流 inwardcurrent 從細胞外進入細胞內(nèi)的正離子 如na 電流或從細胞內(nèi)流向細胞外的負離子 如cl 電流 外向電流 outwardcurrent 從細胞內(nèi)流向細胞外的正離子 如k 電流或從細胞外流向細胞內(nèi)的負離子 如cl 電流 electrode與pipette的區(qū)別 electrode指金屬電極 即ag agcl電極 pipette指拉制出的玻璃電極 它不是真正意義上的電極 而是真正電極的依托 命令電壓 commandvoltage vcmp 通過放大器或計算機發(fā)出的指令電壓 用于鉗制細胞膜電位 鉗制電位 holdingpotential vh 人為地將細胞膜內(nèi)外的電壓差固定在某一數(shù)值 這一數(shù)值即為鉗制電壓或稱鉗制電位 實施這一行為的技術(shù)為電壓鉗技術(shù) voltageclamp rs是指流過電極尖端的電流所遇到的所有電阻 當將電極放入浴液中或在形成高阻封接時 rs主要是電極電阻 全細胞記錄模式形成后 rs包括電極電阻 破裂膜的殘余膜片電阻 細胞內(nèi)部電阻 一 串聯(lián)電阻 seriesresistance rs 補償 rs引起的誤差有如下二方面 1 串聯(lián)電阻產(chǎn)生電壓降 嚴重影響膜鉗制電壓的數(shù)值 2 膜電位對步階命令電壓的反應(yīng)時間延遲 補償方法 調(diào)節(jié) comp 按鈕 二 液界 接 電位及其補償主要成分 1 液體 金屬 agcl電極與電極內(nèi)液 2 電極內(nèi)液 細胞外液 3 電極內(nèi)液 細胞內(nèi)液 破膜后 等待一定時間即可消除 范圍 可達幾百mv補償方法 電極入水按 search offset 三 膜片鉗系統(tǒng)中的電容 膜電容 membranecapacitance cm 細胞膜的脂質(zhì)雙分子層是電的不良導體 因而由細胞外液 脂質(zhì)雙分子層 細胞內(nèi)液就構(gòu)成了細胞膜電容 cm的大小與細胞膜表面積 包括內(nèi)陷折疊部分 成正比 與脂質(zhì)雙分子層的厚度成反比 對于一個球形細胞 膜電容的計算公式為 cm d2 100 pf d為細胞直徑 m 由于有細胞膜內(nèi)折 infolding 的存在 實際的cm要比計算的大1 5 3倍 一般情況下 生物膜的電容大體都是1 f cm2 電極電容 pipettecapacitance cp 電極電容包括跨壁電容 ct 電極非浸液部分與鄰近地表形成的漂浮電容 cs 跨壁電容 transmuralcapacitance ct 電極浸液部分的內(nèi)外液之間形成的電容 跨壁電容的介質(zhì)為玻璃電極壁 在膜片鉗實驗中其值可能很大 一般電極浸液深1mm會產(chǎn)生1pf或更大一些的電容 減小跨壁電容的方法 1 加厚電極管壁 采用厚壁玻璃毛坯拉制電極 或在電極浸液部分外部涂以硅膠樹脂等疏水性物質(zhì) 2 減小電極浸液深度 浸液部分越大 ct越大 3 補償電路 采用膜片鉗放大器內(nèi)置的電容補償電路進行補償 慢電容 slowcapacitance cslow 與快電容 fastcapacitance cfast 快電容主要指電極電容 慢電容主要指膜電容 在貼附式記錄時 膜電容數(shù)值較小 此時要補償?shù)碾娙葜饕强祀娙?即電極電容 打破細胞膜形成全細胞記錄模式后 膜電容顯著增大 此時主要補償?shù)氖锹娙?即膜電容 電容補償?shù)脑瓌t c fast和 fast按鈕 fast 鈕補償快電容 主要是電極電容 大部分的電容瞬變值可用 fast 控制鈕進行補償 四 快速電容補償 fastcapacitancecompensation c slow 鈕補償慢電容 即電極尖端與大地之間的電容 主要是膜片電容 在全細胞記錄模式 緩慢電容補償?shù)闹导礊樵摷毎碾娙葜?五 緩慢電容補償 slowcapacitativecompensation 第二部分電壓門控性離子通道基本知識 電流密度 currentdensity 單位細胞膜面積的電流大小 在進行全細胞記錄時 由于細胞直徑大小的不同 離子通道數(shù)目也不相同 因此為便于不同細胞間的比較 采用電流密度這一概念 由于膜電容的大小與細胞大小成正比 故電流密度 im cm pa pf 整流 rectification 整流是指電流易向一個方向流動 而不易向反方向流動 內(nèi)向性整流是指正離子易從膜外向膜內(nèi)流動 而不易從膜內(nèi)流向膜外 原因 離子通道的開放導致膜電阻發(fā)生了變化 表現(xiàn) 電流和電壓的關(guān)系不滿足歐姆定律的直線關(guān)系 外向整流隨膜電位的去極化 i v曲線明顯向y軸 電流軸 靠近 如ik電流 內(nèi)向整流隨膜電位的去極化 i v曲線明顯向x軸 電壓軸 靠近 如煙堿電流 ik電流的外向整流 煙堿電流的內(nèi)向整流 去極化方向 去極化方向 尾電流 tailcurrent 指通道在激活因素結(jié)束時的關(guān)閉過程中 所記錄到的電流稱為尾電流 tailcurrent 電流的rundown現(xiàn)象指隨著記錄時間的延續(xù) 通道電流逐漸降低的現(xiàn)象 許多種類細胞的鈣電流都具有rundown現(xiàn)象 rundown現(xiàn)象形成的原因全細胞記錄模式形成以后 由于電極內(nèi)液與細胞內(nèi)液之間的相互透析 造成細胞內(nèi)大分子物質(zhì)稀釋或丟失 同時 細胞內(nèi)atp也因稀釋而嚴重不足 而鈣離子在外排時耗能較大 從而導致rundown現(xiàn)象的發(fā)生 減小電流rundown的方法 1 電極內(nèi)充灌atp gtp等可減弱其發(fā)生速率 2 采用穿孔式膜片鉗記錄方法 perforatedpatchclamp 由于其只在細胞膜上用藥物形成微小孔洞而不打破細胞膜 所以細胞內(nèi)大分子成分和atp均不會被稀釋或丟失 能夠有效地抑制rundown現(xiàn)象的發(fā)生 第三部分全細胞記錄結(jié)果舉例 附錄1 推薦書目王紹 徐濤 電生理學方法 韓濟生主編 神經(jīng)科學原理 第二版 pp55 65 北京 北京醫(yī)科大學中國協(xié)和醫(yī)科大學