第五章 伏安分析法 Voltammetry.doc

第五章 伏安分析法 (Voltammetry)伏安法和極譜法是一種特殊的電解方法，是以小面積、易極化的電極作工作電極、以大面積、不易極化的電極為參比電極組成電解池，電解被分析物質(zhì)的稀溶液，由所測(cè)得的電流電壓特性曲線來進(jìn)行定性和定量分析的方法。當(dāng)以滴汞作工作電極時(shí)的伏安法，稱為極譜法（Polarography），它是伏安法的特例。1922年由Jaroslav Heyrovsky創(chuàng)立。因其在這一研究中的杰出貢獻(xiàn)，1959年Heyrovsky被授予諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。從六十年代末，隨著電子技術(shù)的發(fā)展以及固體電極、修飾電極的廣泛使用以及電分析化學(xué)在生命科學(xué)、材料科學(xué)、醫(yī)藥、環(huán)境分析中的廣泛應(yīng)用，使伏安分析法得到了長(zhǎng)足的發(fā)展，本節(jié)重點(diǎn)介紹伏安分析目前最常用的三種方法即循環(huán)伏安法、極譜分析法和電流型生物傳感器。在含義上，伏安法和極譜法是相同的，而兩者的不同在于工作電極： 極譜法的工作電極是表面能周期性更新的液態(tài)電極，即滴汞電極；伏安法的工作電極是電解過程中表面不能更新的固定液態(tài)或固態(tài)電極，如懸汞、汞膜、玻璃碳、鉑電極等；（有的書把兩者統(tǒng)稱為極譜法）伏安和極譜分析法安其電解過程可以分為兩大類： 控制電位極譜法如直流極譜法，單掃描極譜法，脈沖極譜法，方波極譜法，催化極譜法，溶出伏安法，循環(huán)伏安法等。 控制電流極譜法如計(jì)時(shí)極譜法，交流示波極譜法等 （本課程介紹控制電位極譜法，且主要是直流極譜法）伏安法-電位分析-電解分析區(qū)別：方 法測(cè)量物理量電極面積極 化電流待測(cè)物濃度待測(cè)物消耗量電位分析電位、電動(dòng)勢(shì)-無(wú)濃差極化趨于0-極小電解分析電重量、電量大面積盡量減小極化有電流較高濃度完全消耗伏安法電 流小面積完全濃差極化有電流稀溶液極?。ǚ卜治龇ㄊ窃谝欢ǖ碾娢幌聦?duì)體系電流的測(cè)量；而電位分析法是在零電流條件下對(duì)體系電位的測(cè)量。）一、電解池的伏安行為濃差極化二、極譜分析法（一）極譜分析的原理與過程1、極譜分析的原理與過程極譜分析：在特殊條件下進(jìn)行的電解分析。 特殊性：使用了一支極化電極和另一支去極化電極作為工作電極；在溶液靜止的情況下進(jìn)行的非完全的電解過程。極化電極與去極化電極極譜波（電流-滴汞電極電位曲線）2、極限擴(kuò)散電流id3、極譜曲線形成條件4、滴汞電極的特點(diǎn)（二）擴(kuò)散電流方程1、尤考維奇方程2、影響擴(kuò)散電流測(cè)定的主要因素（三）干擾電流與抑制1、殘余電流2、遷移電流3、極譜極大4、氧波、氫波、前波（四）極譜定性方法（五）極譜定量分析方法極譜滴定法（伏安滴定法）（六）經(jīng)典直流極譜法的應(yīng)用經(jīng)典直流極譜的缺點(diǎn) （七）新的極譜分析方法 經(jīng)典極譜法具有較大的局限性。主要表現(xiàn)在電容電流在檢測(cè)過程中的不斷變化，電位施加較慢以及極譜電流檢測(cè)的速度較慢。為了克服這些局限性，一方面是改進(jìn)和發(fā)展極譜儀器，主要表現(xiàn)在改進(jìn)記錄極譜電流的方法，如微分極譜法；另一方面改變施加極化電位的方法，如方波極譜，脈沖極譜等。陽(yáng)極溶出伏安法及催化波極譜方法可以提高樣品的有效利用率及提高檢測(cè)靈敏度。二、循環(huán)伏安法(Cyclic Voltammetry，CV)（一）概述一種常用的電化學(xué)研究方法。該法控制電極電勢(shì)以不同的速率，隨時(shí)間以三角波形一次或多次反復(fù)掃描，電勢(shì)范圍是使電極上能交替發(fā)生不同的還原和氧化反應(yīng)，并記錄電流-電勢(shì)曲線。對(duì)于一個(gè)新的電化學(xué)體系，首選的研究方法往往就是循環(huán)伏安法，可稱之為“電化學(xué)的譜圖”。本法除了使用汞電極外，還可以用鉑、金、玻璃碳、碳纖維微電極以及化學(xué)修飾電極等。1、基本原理 如以等腰三角形的脈沖電壓加在工作電極上，得到的電流電壓曲線包括兩個(gè)分支，如果前半部分電位向陰極方向掃描，電活性物質(zhì)在電極上還原，產(chǎn)生還原波，那么后半部分電位向陽(yáng)極方向掃描時(shí)，還原產(chǎn)物又會(huì)重新在電極上氧化，產(chǎn)生氧化波。因此一次三角波掃描，完成一個(gè)還原和氧化過程的循環(huán)，故該法稱為循環(huán)伏安法，其電流電壓曲線稱為循環(huán)伏安圖。循環(huán)伏安法中電壓掃描速度可從每秒種數(shù)毫伏到1伏。工作電極可用懸汞電極，或鉑、玻碳、石墨等固體電極。 2、可逆體系下的循環(huán)伏安掃描Fe(CN)63-與Fe(CN)62-是典型可逆的氧化還原體系。圖1.15是Fe(CN)63-在金電極上典型的循環(huán)伏安掃描曲線。電位激勵(lì)信號(hào)為三角波信號(hào)。E1與E2分別為0.8, -1.2 V vs SCE，電位輻值為1.0V。Ecp, Eap, 分別為陰極峰值電位與陽(yáng)極峰值電位。Icp, Iap分別為陰極峰值電流與陽(yáng)極峰值電流。確定峰值電流的方法可以采用切線法。正掃時(shí)（向左的掃描）為陰極掃描：Fe(CN)63- + e- = Fe(CN)62- （1）反掃時(shí)（向右的掃描）為陽(yáng)極掃描：Fe(CN)62- - e- = Fe(CN)63- （2）在該電極體系中，式（1）與式（2）還原與氧化過程中的電荷轉(zhuǎn)移的速率很快，電極過程可逆。這可以從伏安圖中還原峰值電位與氧化峰值電位之間的距離得到判斷。一般地，陽(yáng)極掃描峰值電位Eap與陰極掃描峰值電位Ecp的差值（DEp）可以用來檢測(cè)電極反應(yīng)是否是Nernst反應(yīng)。當(dāng)一個(gè)電極反應(yīng)的DEp接近2.3 RT/nF (或59/n mV，25C)時(shí)，我們可以判斷該反應(yīng)為Nernst反應(yīng)，即是一個(gè)可逆反應(yīng)。從圖1.15左圖可見，Ep相差接近于59 mV，還原電流與氧化電流增加較快。這是因?yàn)?，在陰極過程中，F(xiàn)e(CN)63-獲得電子還原成Fe(CN)62-的速度較快，電極表面Fe(CN)63-離子濃度迅速降低，反應(yīng)電流迅速增加。由于反應(yīng)電流增加得較快導(dǎo)致電極表面Nernst層恢復(fù)Nernst平衡的傾向增加，在陰極掃描中出現(xiàn)峰值電流及峰值電位。當(dāng)反向掃描時(shí)，在電極表面產(chǎn)物Fe(CN)62-離子的濃度接近于反應(yīng)離子Fe(CN)63-的初始濃度。換句話說，反掃描所獲得伏安掃描曲線相當(dāng)于在與Fe(CN)63-初始濃度相同的Fe(CN)62-離子的陽(yáng)極伏安掃描。于是陰極波與陽(yáng)極波基本上是對(duì)稱的。伏安掃描曲線可以作半微分處理，得到伏安曲線靈敏度有較大的提高（圖1.15右圖）。所謂電極反應(yīng)可逆體系是由氧化還原體系，支持電解質(zhì)與電極體系構(gòu)成。同一氧化還原體系，不同的電極，不同的支持電解質(zhì)，得到的伏安響應(yīng)不一樣。因此，尋找合適的電極，支持電解質(zhì)，利用伏安分析方法進(jìn)行氧化還原體系的反應(yīng)粒子濃度以及該體系的電化學(xué)性質(zhì)研究是電分析化學(xué)重要任務(wù)。 圖1.15伏安掃描圖譜中的電化學(xué)響應(yīng)來源于鐵中心離子的氧化還原。鐵離子在溶液中的形態(tài)不同，所獲得的伏安響應(yīng)不同。例如當(dāng)鐵的活性中心處于細(xì)胞色素C（一種生物體系中的電子傳遞蛋白）中時(shí)，伏安響應(yīng)將發(fā)生變化（圖1.16）。 從圖1.15到圖1.16，我們可以看到鐵在不同的狀態(tài)下伏安圖譜是不一樣的。前者是一種配合物狀態(tài)；后者是鐵活性粒子與蛋白質(zhì)的相互作用。實(shí)際上不同的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，盡管都含有鐵活性中心，其伏安圖譜是不一樣的。例如血紅蛋白，肌紅蛋白與細(xì)胞色素C都含有鐵活性中心，但其伏安行為是不同的。對(duì)于同一種蛋白，不同構(gòu)象，伏安行為也不同。因此，伏安分析方法不僅可以用來分析不同的電子傳遞蛋白，而且可以用來分析不同蛋白質(zhì)構(gòu)象情況下的電子傳遞行為。3、不可逆體系下的循環(huán)伏安掃描如果電活性物質(zhì)可逆性差，則氧化波與還原波的高度就不同，對(duì)稱性也較差。同時(shí)氧化峰與還原峰的峰值電位差值相距較大，相距越大不可逆程度越大（圖1.17）。一般地，我們利用不可逆波來獲取電化學(xué)動(dòng)力學(xué)的一些參數(shù)，如電子傳遞系數(shù)a以及電極反應(yīng)速度常數(shù)k等。4、循環(huán)伏安法的應(yīng)用 根據(jù)循環(huán)伏安法圖的氧化波和還原波的峰高和對(duì)稱性中可判斷電活性物質(zhì)在電極表面反應(yīng)的可逆程度。 循環(huán)伏安法還可研究電極吸附現(xiàn)象、電化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)物、電化學(xué)化學(xué)耦聯(lián)反應(yīng)等,尤其適用于研究金屬絡(luò)合物、有機(jī)化合物、生化物質(zhì)等的氧化還原機(jī)理。三、電流型生物傳感器1、生物傳感器概述因?yàn)槟壳暗碾娏餍蛡鞲衅髦饕糜谏镂镔|(zhì)的分析，因此，我們將以電流型生物電化學(xué)傳感器為例介紹電流型傳感器的原理。生物傳感器是利用一定的生物或化學(xué)的固定技術(shù)，將生物功能物質(zhì)（酶、抗體、核酸、微生物等）固定在換能器上，將生物化學(xué)反應(yīng)能轉(zhuǎn)換成電信號(hào)的一種分析測(cè)試裝置。它包括接受器、換能器（信號(hào)轉(zhuǎn)換器）兩個(gè)主要部分。接受器是生物傳感器中最關(guān)鍵的部分，將具有分子識(shí)別功能的生物物質(zhì)（分子識(shí)別元件）固定于載體膜上構(gòu)成生物敏感膜，即接受器，它決定著傳感器的好壞和靈敏度的高低；在生物體中，有許多具有分子識(shí)別功能的物質(zhì)，能識(shí)別一些特定的物質(zhì)，并與之結(jié)合成復(fù)合物，表1列出了幾種具有分子識(shí)別功能的生物物質(zhì)和它所識(shí)別的分子。常用的換能器有石英晶體微天平、電化學(xué)電極、離子敏場(chǎng)效應(yīng)晶體管、熱敏電阻、光纖等。表1 具有分子識(shí)別功能的生物物質(zhì)和被識(shí)別的分子生 物 物 質(zhì)被 識(shí) 別 的 分 子酶抗體結(jié)合蛋白質(zhì)植物凝血素激素受體特定DNA序列底物、底物類似物、輔酶抗原、抗原類似物維生素A、維生素H等糖鏈、具有糖鏈的分子或細(xì)胞激素目標(biāo)DNA當(dāng)待測(cè)物質(zhì)與分子識(shí)別元件特異性結(jié)合后，通過換能器將所產(chǎn)生的反應(yīng)結(jié)果（形成復(fù)合物或產(chǎn)生光、電、熱、聲等）轉(zhuǎn)變?yōu)榕c待測(cè)物濃度有關(guān)的電信號(hào)或光信號(hào)輸出，通過電子系統(tǒng)處理和顯示，從而達(dá)到分析檢測(cè)的目的。生物傳感器的基本工作原理如圖1所示。圖1 生物傳感器的工作原理1967年S.J.烏普迪克等制出了第一個(gè)生物傳感器葡萄糖傳感器。將葡萄糖氧化酶包含在聚丙烯酰胺膠體中加以固化，再將此膠體膜固定在隔膜氧電極的尖端上，便制成了葡萄糖傳感器。當(dāng)改用其他的酶或微生物等固化膜，便可制得檢測(cè)其對(duì)應(yīng)物的其他傳感器。固定敏感膜的方法有吸附固定法、直接化學(xué)結(jié)合法、自組裝法、高分子載體法、高分子膜結(jié)合法?，F(xiàn)已發(fā)展了第二代生物傳感器（微生物、免疫、酶免疫和細(xì)胞器傳感器 ），研制和開發(fā)第三代生物傳感器，將生物技術(shù)和電子技術(shù)結(jié)合起來的場(chǎng)效應(yīng)生物傳感器。2、生物傳感器的分類生物傳感器的分類方法多種多樣，一般按照以下幾方面進(jìn)行分類。 A、根據(jù)生物傳感器中生物敏感材料的屬性，可分為： 1）酶?jìng)鞲衅?。這是研究最早的一類生物傳感器。酶是一類生物催化劑，對(duì)相應(yīng)底物具有催化轉(zhuǎn)化作用，可構(gòu)建基于催化作用的生物酶?jìng)鞲衅?；同時(shí)，有些物質(zhì)對(duì)酶活性有特異性抑制作用，可制成酶抑制性生物傳感器。2）微生物傳感器。從活性污泥、河水、腐質(zhì)中得到的微生物，如真菌、細(xì)菌、酵母等，將其固定到換能器表面，制成微生物傳感器。利用活微生物的代謝功能檢測(cè)目標(biāo)分析物。3）組織傳感器。將哺乳動(dòng)物或植物的組織切片作為分子識(shí)別材料直接固定到換能器的表面，制得的傳感器稱為組織傳感器。它利用組織切片中的生物活性物質(zhì)對(duì)目標(biāo)分析物的作用來進(jìn)行分析檢測(cè)。4）細(xì)胞傳感器。利用活細(xì)胞作為探測(cè)單元，可以測(cè)量被分析物的功能性信息，是目前生物傳感器研究中的一個(gè)熱點(diǎn)。5）免疫傳感器。利用抗體與抗原之間的免疫應(yīng)答機(jī)理，將其中之一修飾到換能器的表面，制得的傳感器稱為免疫傳感器?？梢詸z測(cè)復(fù)雜體系中對(duì)應(yīng)的免疫組分。6）DNA傳感器。將特定序列的DNA固定到換能器表面，通過與目標(biāo)DNA雜交形成雙鏈DNA，檢測(cè)由于雜交產(chǎn)生的響應(yīng)信號(hào)，對(duì)目標(biāo)DNA進(jìn)行高選擇性、高靈敏度的檢測(cè)。DNA生物傳感器按照換能器劃分主要包括電化學(xué)DNA傳感器、光學(xué)DNA傳感器及壓電DNA傳感器等。7）分子印跡傳感器。以分子印跡聚合物(molecularly imprinted polymer，MIP)為識(shí)別元件，結(jié)合不同種類轉(zhuǎn)換器可制得分子印跡傳感器(Molecular Imprinted Polymer Sensors)。MIP又稱為塑料抗體，屬于合成分子識(shí)別系統(tǒng)，其制備技術(shù)稱為分子印跡技術(shù)，主要是將要分析的目標(biāo)分子(又稱印跡分子)作為模板，與功能化單體、交聯(lián)荊一起發(fā)生聚合反應(yīng)，形成聚合物后再將印跡分子從聚合物中抽提出來。這樣聚合物上就留下了與印跡分子的空間結(jié)構(gòu)和化學(xué)官能團(tuán)兩方面均互補(bǔ)的識(shí)別部位(空穴)，其大孔結(jié)構(gòu)使印跡分子可以在聚合物基體中進(jìn)行擴(kuò)散。識(shí)別部位具有“分子記憶 功能，可以選擇性地識(shí)別印跡分子，它既有生物傳感器的專一識(shí)別性，又有化學(xué)傳感器的機(jī)械穩(wěn)定性、熱穩(wěn)定性。B、根據(jù)生物傳感器的信號(hào)獲取方式，可分為：1）電化學(xué)生物傳感器。根據(jù)測(cè)量信號(hào)不同，電化學(xué)生物傳感器又可分為電流型、電位型、電導(dǎo)型、電容型和阻抗型。2）壓電生物傳感器。壓電晶體具有高靈敏的質(zhì)量響應(yīng)特征，其頻率變化與結(jié)合在其上的物質(zhì)質(zhì)量相關(guān)。顯然，具有生物親和性質(zhì)的組分，可以構(gòu)建壓電生物傳感器。3）光化學(xué)生物傳感器。此類傳感器以光學(xué)信號(hào)變化量為檢測(cè)信息，由于可利用的光學(xué)信號(hào)很多，包括光吸收、反射、熒光、磷光、化學(xué)發(fā)光等等，所以，具體類別很多，可大致分為光化學(xué)酶?jìng)鞲衅骱凸饣瘜W(xué)免疫傳感器等。4）熱傳導(dǎo)生物傳感器。通過特殊的量熱設(shè)備來測(cè)量由于化學(xué)和生物反應(yīng)導(dǎo)致反應(yīng)體系的熱量變化，此變化值與分析物濃度相關(guān)。3、生物傳感器的特點(diǎn)（1）采用固定化生物活性物質(zhì)作催化劑，價(jià)值昂貴的試劑可以重復(fù)多次使用，克服了過去酶法分析試劑費(fèi)用高和化學(xué)分析繁瑣復(fù)雜的缺點(diǎn)。 （2）專一性強(qiáng)，只對(duì)特定的底物起反應(yīng)，而且不受顏色、濁度的影響。 （3）分析速度快，可以在一分鐘得到結(jié)果。 （4）準(zhǔn)確度高，一般相對(duì)誤差可以達(dá)到1 （5）操作系統(tǒng)比較簡(jiǎn)單 ，容易實(shí)現(xiàn)自動(dòng)分析 （6）成本低，在連續(xù)使用時(shí)，每例測(cè)定僅需要幾分錢人民幣。 （7）有的生物傳感器能夠可靠地指示微生物培養(yǎng)系統(tǒng)內(nèi)的供氧狀況和副產(chǎn)物的產(chǎn)生。在產(chǎn)控制中能得到許多復(fù)雜的物理化學(xué)傳感器綜合作用才能獲得的信息。同時(shí)它們還指明了增加產(chǎn)物得率的方向。（8）生物固化膜不穩(wěn)定4、電流型生物傳感器基本原理我們以葡萄糖傳感器為例介紹電流型生物傳感器的基本原理。葡萄糖傳感器中的基礎(chǔ)電極主要有兩種，一種是酶Pt/H2O2電極；一種是酶Pt/O2電極。酶Pt/H2O2電極的結(jié)構(gòu)如圖1.27所示。其中鉑柱電極為工作電極，鉑絲電極為輔助電極，Ag-AgCl電極為參比電極。葡萄糖在在葡萄糖氧化酶的作用下，發(fā)生還原反應(yīng)： GOD b-D- C6H12O6 + O2 + H2O - C6H10O6 + H2O2 通過測(cè)量H2O2在鉑電極上的反應(yīng)電流便可確定底物-D- C6H12O6的濃度。該酶Pt/H2O2電極過程的基本歷程為：1）底物S由液相傳質(zhì)到傳感器表面2）底物S通過透析膜3）底物S在液相與酶層中進(jìn)行分配4）底物S在酶層中傳質(zhì)與反應(yīng)5）反應(yīng)產(chǎn)物粒子通過透析膜進(jìn)入基礎(chǔ)電極室6）反應(yīng)產(chǎn)物粒子在基礎(chǔ)電極上發(fā)生電荷轉(zhuǎn)移反應(yīng)很顯然，該電極過程是較復(fù)雜的。其中第2步第5步由透析膜的性質(zhì)決定；第1步由底物的擴(kuò)散步驟決定；第3步是由膜性質(zhì)及以及底物分子在液相及酶層中的擴(kuò)散行為決定；第6步是由產(chǎn)物粒子在內(nèi)電解液中的鉑電極上的電極過程決定。理想的電極過程應(yīng)是由第6步來決定。這樣就要對(duì)透析膜及酶層有所要求。即，反應(yīng)粒子與產(chǎn)物粒子能迅速通過透析膜。酶層厚度要適中，使得反應(yīng)產(chǎn)物粒子能及時(shí)地通過酶層。一般地酶電極的電極過程由反應(yīng)產(chǎn)物在酶層中的擴(kuò)散控制。這時(shí)要設(shè)法提高酶活性，降低米氏常數(shù)。5、底物葡萄糖的測(cè)定方法舉例 電極