（分析化學(xué)專業(yè)論文）基于固體電極修飾的dna電化學(xué)生物傳感器研究.pdf

青島科技大學(xué)研究生學(xué)位論文 基于固體電極修飾的d n a 電化學(xué)生物傳感器研究 摘要 本論文分三部分，第一部分合成了一種電活性配合物，并且用此配合物作為 指示劑發(fā)展了一種新型的電化學(xué)d n a 傳感器；第二部分和第三部分發(fā)展了兩種 無指示劑的d n a 傳感器。 l 、合成了硝酸二水雙n - ( 2 吡啶甲基) 苯甲酰胺合鎘0 i ) ( 簡(jiǎn)稱f f c j c d l z 2 + ) 配合物，通過x 單晶衍射法表征了配合物的結(jié)構(gòu)，用電化學(xué)和熒光的方法研究 了此配合物與d s d n a 的相互作用機(jī)理。結(jié)果表明【c d l 2 】2 + 在玻碳電極上有很好的 電化學(xué)活性并且與d s d n a 發(fā)生了嵌插結(jié)合作用。在0 2m o ll 1n a a c h a c ( p h 7 0 2 ) 介質(zhì)中， c d l 2 】2 + 與d s d n a 形成的復(fù)合物的結(jié)合比為2 ：1 ，結(jié)合常數(shù)為2 5 5 6 l “2 m o l m 。以 c d l 2 】2 + 為指示劑制備了一種檢測(cè)乙肝病毒( h b v ) 的新型的電化 學(xué)傳感器。將2 1 個(gè)堿基序列的h b v 單鏈寡核苷酸( h b v s s d n a ) 通過共價(jià)鍵 合作用固定到玻碳電極上，與其互補(bǔ)序列單鏈d n a 進(jìn)行雜交，雜交信號(hào)通過微 分脈沖的方法( d p v ) 進(jìn)行表征。此d n a 傳感器對(duì)目標(biāo)h b v s s d n a 的檢測(cè)范 圍為1 0 1x1 0 一1 6 2 1 0 一m o l l - 1 ，相關(guān)系數(shù)為0 9 9 6 2 ，檢測(cè)限為7 1 9 1 0 。9 m o l l 一( 3 0 ，n = 1 1 ) 。 2 、制備了一種新型的用2 巰基苯并噻唑( m b t ) 自組裝金電極檢測(cè)目標(biāo) s s d n a 的電化學(xué)生物傳感器。因?yàn)閙 b t 可以嵌插入d s d n a 的雙螺旋之中，所 以可以用a u m b t 選擇性的區(qū)分s s d n a 和d s d n a ，通過掃描電鏡和循環(huán)伏安的 方法預(yù)先表征了a u m b t 的組裝情況。在過量的探針s s d n a 和適量的目標(biāo) s s d n a 的雜交溶液中，以組裝電極為工作電極通過d p v 表征了d n a 的雜交情 況。發(fā)現(xiàn)目標(biāo)s s d n a 的濃度與還原峰電流有一定的線性關(guān)系。此傳感器對(duì)目標(biāo) s s d n a 的檢測(cè)范圍為1 5 9 l o 。8 2 4 1 0 6 m o l l - 1 ，檢測(cè)限為2 3 8 1 0 一m o l l - 1 ( 3 0 ，n = 1 1 ) 。a u m b t 電極具有良好的重現(xiàn)性和再生性，在1 0 次檢n 再生的循 環(huán)過程中，峰電流信號(hào)沒有明顯的變化。此種傳感器制備方便，價(jià)格低廉，在連 續(xù)和定量檢測(cè)實(shí)際的生物樣品中目標(biāo)s s d n a 方面具有很大的發(fā)展?jié)摿Α?3 、制備了一種用2 巰基苯并咪唑( m b i ) 自組裝金電極檢測(cè)目標(biāo)s s d n a 的 電化學(xué)生物傳感器。與第二部分不同的是，利用a u m b i 檢測(cè)時(shí)，首先用固定了 探針s s d n a 的玻碳電極將目標(biāo)s s d n a 從樣品中分離出來，然后將目標(biāo)s s d n a 轉(zhuǎn)移到新的溶液中再用組裝電極檢測(cè)雜交情況，此傳感器對(duì)目標(biāo)s s d n a 的檢測(cè) 范圍為1 3 2x1 0 一1 5 9 1 0 一m o l l - l ，檢測(cè)限為4 5 8 1 0 9m o l l - 1 。 青島科技大學(xué)研究生學(xué)位論文 關(guān)鍵詞：電化學(xué)d n a 生物傳感器，伏安法，鎘配合物，2 一巰基苯并噻唑，2 巰基苯并咪唑 i i 青島科技大學(xué)研究生學(xué)位論文 s t u d yo fd n ae l e c t r o c h e m i c a lb 1 0 s e n s o r b a s e do ns o l i de l e c t r o d s a bs t r a c t t h e r ea l et h r e ep a r t si nt h i sp a p e r , a l le l e t r o a c t i v ec o m p l e xw a ss y n t h e s i z e di n t h ef i r s t p a r t a n dt h i s c o m p l e x w a su s e da si n d i c a t o rt od e v e l o pan o v e l e l e c t r o c h e m l 3 a ld n ab i o s e n s o r ；w ea l s od e v e l o p dt w ol a b e l f r e ed n ab i o s e n s o r si n t h es e c o n dp a r ta n dt h i r dp a r t ：1 n l ec o m p l e xd i a q u a b i s n - ( 2 一p y n d i n y l m e t h y l ) b e n z a m i d e ，仞一c a d m i u m ( 1 ) d i n i t r a t e c d l 2 ( h 2 0 ) 2 ( n 0 3 h ，w h e r el = n - ( 2 - p y r i d i n y l m e t h y l ) b e n z a m i d e w a s s y n t h e s i z e d a n dc h a r a c t e r i z e d b yx - r a y d i f f r a c t i o na n a l y s i s f l u o r e s c e n c e s p e c t r o s c o p ym a dv o l t a m m e t r yw e r eu s e dt op r o b et h ei n t e r a c t i o nb e t w e e n 【c d l 2 2 + a n ds a l m o n 弼o e r md n a r e s u l t ss h o w e dt h a t c d l 2 2 + h a de x c e l l e n te l e c t r o c h e m i c a l a c t i v i t yo ng l a s s yc a r b o ne l e c t r o d e ( g c d ) a n dc o u l di n t e r c a l a t ei n t ot h ed o u b l eh e l i x o fd o u b l e s t r a n d e dd n a ( d s d n a ) i n0 2m o l l - n a a c - h a cm e d i aq h7 0 2 ) ，t h e b i n d i n gr a t i ob e t w e e n 【c d l 2 2 + a n ds a l m o ns p e r md n a w a sc a l c u l a t e dt ob e2 ：1a n d t h eb i n d i n gc o n s t a n tw a s2 5 5 6l l 2m o l 。m a ne l e c t r o c h e m i c a ld n ab i o s e n s o rf o r t h ed e t e c t i o no fh u m a nh e p a t i t i sbv i r u s ( h b v ) d n af r a g m e n tw a sd e v e l o p e d t h e b i o s e n s o rr e l i e 匿l0 nt h ec o v a l e n ti m m o b i l i z a t i o no ft h e21 - m e rs i n g l e s t r a n d e dd n a ( s s d n a ) r e l a t e dt oh b vg e n eo nt h em o d i f i e dg l a s s yc a r b o ne l e c t r o d e ( g c e ) u s i n g c d l 2 2 + a sn o v e le l e c t r o a c t i v ei n d i c a t o r ，t h eh y b r i d i z a t i o nb e t w e e nt h ep r o b ea n di t s c o m p l e m e n t a r ys s d n a ，a s t h e t a r g e t , w a si n v e s t i g a t e db yd i f f e r e n t i a lp u l s e v o l t a m m e t r y ( d p v ) e x p e r i m e n t 、 r i 也n o n c o m p l e m e n t a r yo l i g o n u c l e o t i d e s w a s c a r r i e do u tt oa s s e s st h es e l e c t i v i t yo ft h ed e v e l o p e de l e c t r o c h e m i c a ld n ab i o s e n s o r t h et a r g e th b vd n ac o u l db eq u a n t i f i e dr a n g e df r o m1 0 1 1 0 堪t o1 6 2 10 由 m o l l - 1 w i t hg o o dl i n e a r i t y0 = 0 9 9 6 2 ) md e t e c t i o nl i m i tw a s7 19 10 叫m o l l - ( 3 0 ，n = 1 1 ) 2 an o v e lm e t h o df o rs e n s i t i v ed e t e c t i o no fs i n g l es t r a n d e dd n a ( s s d n a ) u s i n g 2 - m e r c a p t o b e n z o t h i a z o l e ( m b t ) s e l f - a s s e m b l e dm o n o l a y e rm o d i f i e dg o l de l e c t r o d e h a sb e e nd e v e l o p e d b a s e do nt h ei n t e r c a l a t i n ge f f e c to fm b t i n t od o u b l es t r a n d e d d n a ( d s d n a ) ，a u m b te l e c t r o d ep o s s e s s e dt h ea b i l i t yt od i s t i n g u i s hs s d n aa n d i i i 青島科技大學(xué)研究生學(xué)位論文 d s d n a c y c l i cv o l t a m m e t r y ( c v ) a n ds c a ne l e c t r o nm i c r o s c o p e ( s e m ) w e r eu s e dt o p r e l i m i n a r i l yc h a r a c t e r i z et h em b ts e l f - a s s e m b l e dm o n o l a y e ro ng o l de l e c t r o d e i n t h em i x t u r eo fe x c e s s i v ep r o b es s d n aa n dt a r g e ts s d n a ，c u r r e n ts i g n a lr e c o r d e db y d i f f e r e n t i a lp u l s ev o l t a m m e t r y ( d p v ) a f t e rd n a h y b r i d i z a t i o nr e f l e c t e dt h ee x t e n to f t h eh y b r i d i z a t i o n d e f i n i t er e l a t i o n sw e r eo b s e r v e db e t w e e n t h er e d u c t i v ep e a k c u r r e n t sa n dt h ec o n c e n t r a t i o no ft a r g e ts s d n a t h eq u a n t i t a t i v ed e t e c t i o no ft a r g e t s s d n aw a sa c h i e y e dw i t hal i n e a rr a n g ef r o m1 5 9 10 。8t o2 4 10 。6m o l l - 1 t h e d e t e c t i o nl i m i tw a s2 3 8 1 0 一m o l l - 1 ( 3 0 ，n = 11 ) t h ea u m b te l e c t r o d e p o s s e s s e dh i 曲r e u s a b i l i t ya n dr e p r o d u c i b i l i t y ，n os i g n i f i c a n td e t e r i o r a t i o no fp e a k c u r r e n t s o c c u r r i n go v e r 10d e t e c t i o n r e g e n e r a t i o n c y c l e s c o m b i n e d 、i t l l t h e a d v a n t a g e so fs i m p l i c i t ya n dl o w c o s t , t h ed e v e l o p e de l e c t r o c h e m i c a lb i o s t , n s o r s s h o wp o t e n t i a li nc o n t i n u o u sa n dq u a n t i t a t i v ed e t e c t i o no fs s d n ai nb i o l o g i c a l s a m p l e s 3 am e t h o df o rs e n s i t i v ed e t e c t i o no fs s d n au s i n g2 - m e r c a p t o b e n z i m i d a z o l e 0 v t b i ) s e l f - a s s e m b l e dm o n o l a y e rm o d i f i e dg o l de l e c t r o d eh a sb e e nd e v d o p e d f i r s t l y ， ag l a s s yc a r b o ne l e c t r o dw h i c hh a db e e nm o d i f i e dw i 吐1p r o b es s d n aw a su s e dt o s e p a r a t et h et a r g e ts s d n af r o ms a m p l ea n dt h e nt a r g e ts s d n a w a st r a n s f e rt oan e w s o l u t i o n ，a u m b ie l e c t r o dd e t e c tt a r g e ts s d n ai nt h es o l u t i o n t h eq u a n t i t a t i v e d e t e c t i o no ft a r g e ts s d n aw a sa c h i e v e dw i t hal i n e a rr a n g ef r o m1 3 2 10 一1 5 9 1o - 6 m 0 1 l - 1 ，t h ed e t e c t i o nl i m i tw a s4 5 8 10 一m o l l - 1 ( 3 0 ，n = 11 ) k e yw o r d s ：e l e c t r o c h e m i c a ld n ab i o s e n s o r , v o l t a m m e t r y ， c d l 2 2 + ， 2 - m e r c a p t o b e n z o t h i a z o l e ，2 - m e r c a p t o b e n z i m i d a z o l e i v 青島科技大學(xué)研究生學(xué)位論文 獨(dú)創(chuàng)性聲明 本人聲明所呈交的學(xué)位論文是本人在導(dǎo)師指導(dǎo)下進(jìn)行的研究工作及取得的 研究成果。據(jù)我所知，除了文中特別加以標(biāo)注和致謝中所羅列的內(nèi)容以外，論文 中不包含其他人已經(jīng)發(fā)表或撰寫過的研究成果，也不包含為獲得其他教育機(jī)構(gòu)的 學(xué)位或證書使用過的材料。與我一同工作的同志對(duì)本研究所做的任何貢獻(xiàn)均已在 論文中作了明確的說明并表示謝意。 申請(qǐng)學(xué)位論文與資料若有不實(shí)之處，本人承擔(dān)一切相關(guān)責(zé)任。 本人簽名：譚7 ，青看 簽字日期力咿年月日 關(guān)于論文使用授權(quán)的說明 本學(xué)位論文作者完全了解學(xué)校有關(guān)保留、使用學(xué)位論文的規(guī)定，有權(quán)保留并 向國(guó)家有關(guān)部門或機(jī)構(gòu)送交論文的復(fù)印件和磁盤，允許論文被查閱和借閱。本人 授權(quán)學(xué)?？梢詫W(xué)位論文的全部或部分內(nèi)容編入有關(guān)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行檢索，可以采用 影印、縮印或掃描等復(fù)制手段保存、匯編學(xué)位論文。本人離校后發(fā)表或使用學(xué)位 論文或與該論文直接相關(guān)的學(xué)術(shù)論文或成果時(shí)，署名單位仍然為青島科技大學(xué)。 ( 保密的學(xué)位論文在解密后適用本授權(quán)書) 本學(xué)位論文屬于： 保密口，在年解密后適用于本聲明。 不保密口。 本人簽名：譯痞倘 導(dǎo)師簽字：強(qiáng)書毒 簽字日期：力孝年6 月占日 簽字日期：2 印占年否月6 日 青島科技大學(xué)研究生學(xué)位論文 第一章前言 核酸是生物體內(nèi)一類含有磷酸基團(tuán)的重要的生物大分子，擔(dān)負(fù)著生命信息的 儲(chǔ)存和傳遞，是生命化學(xué)研究中一個(gè)重要領(lǐng)域。脫氧核糖核酸( d e o x y r i b o n u c l e i c a c i d ，d n a ) 是核酸的一種，它是主要的遺傳物質(zhì)，是遺傳信息的載體，具有貯 存和傳遞信息的功能，對(duì)它的研究在生命科學(xué)中具有重要的意義。研究d n a 的 結(jié)構(gòu)和功能，可以從分子水平上了解生命現(xiàn)象的本質(zhì)，解釋藥物的作用機(jī)理。人 類的許多遺傳疾病與其d n a 序列不同程度的變異有關(guān)?；蛲蛔?、癌變以及老 化過程都可能涉及到d n a 的堿基損傷，因此對(duì)d n a 的研究是現(xiàn)代生物學(xué)、醫(yī)學(xué) 和生命科學(xué)的重要課題之一。 對(duì)d n a 常見的分析方法有電化學(xué)法、熒光光度法、光散射技術(shù)及色譜法等， 其中d n a 電化學(xué)傳感器是目前d n a 傳感器中最成熟的一種，文獻(xiàn)報(bào)道最歲卜6 】。 電化學(xué)d n a 傳感器是近幾年迅速發(fā)展起來的一種全新思想的生物傳感器，其用 途是檢測(cè)基因及一些能與d n a 發(fā)生特殊相互作用的物質(zhì)。由于它具有選擇性好， 靈敏度高，測(cè)試費(fèi)用低及抗干擾等優(yōu)點(diǎn)，已被廣泛應(yīng)用于研究d n a 的結(jié)構(gòu)形態(tài)【7 1 、 堿基序列【8 1 、d n a 的損傷【9 1 0 】、基因診斷 1 1 , 1 2 1 、病毒檢測(cè)【1 3 】及蛋白質(zhì)鏈的分析【1 4 】 等諸多領(lǐng)域。 1 1d n a 的組成、結(jié)構(gòu)及其變性與復(fù)性 1 1 1d n a 的組成 d n a 是核酸的一種，是大量脫氧核苷酸的聚合體。脫氧核糖核苷酸由堿基、 脫氧糝糖和磷酸構(gòu)成。d n a 的堿基有四種，即腺嘌呤( a ) 、鳥嘌呤( g ) 、胞嘧啶 ( c ) 和胸腺嘧啶( t ) 。d n a 在堿基組成上遵從c h a r g a f f 規(guī)則，a 與t 的量相等，g 與c 的量相等，即堿基互補(bǔ)，并且嘌呤的總數(shù)等于嘧啶的總數(shù)。 1 1 2d n a 的結(jié)構(gòu) d n a 是以4 種脫氧核苷酸為基本單元組成的多聚核苷酸，脫氧核苷酸之間 通過磷酸二酯鍵相連接。脫氧核苷酸由脫氧核糖、磷酸根和堿基3 種成分組成。 脫氧核糖是在2 位沒有羥基的五碳糖。堿基連接于脫氧核糖的1 位，磷酸基團(tuán) 連接于脫氧核糖的3 位羥基或5 位羥基。構(gòu)成d n a 分子的基本單元的脫氧核 苷酸通過3 ，5 磷酸二酯鍵相連形成d n a 分子。 基丁同體電極修飾的d n a 電化學(xué)生物傳感器研究 d n a 的結(jié)構(gòu)分為一級(jí)結(jié)構(gòu)和空間結(jié)構(gòu)。d n a 由多條脫氧核糖核苷酸鏈構(gòu)成， 每條鏈均以磷酸基( 磷酸酯鍵) 為橋從一個(gè)核苷的3 連接到相鄰核糖的5 位置 上，這就是d n a 的一級(jí)結(jié)構(gòu)?？臻g結(jié)構(gòu)又分為二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)，其中二級(jí) 結(jié)構(gòu)就是由j a m e sw a i s o n 和f r a n c i sc r i c k 在1 9 5 3 年確定的d n a 的雙螺旋結(jié) 構(gòu)，它是現(xiàn)代生物學(xué)誕生的標(biāo)志。d n a 雙螺旋結(jié)構(gòu)十分穩(wěn)定，主要有三種力量來 維持結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定：( 1 ) 互補(bǔ)堿基對(duì)之間的氫鍵；( 2 ) 堿基堆積力，它主要是由于芳香 族堿基的兀電子之間相互作用而引起d n a 分子中的堿基層堆積，結(jié)果在d n a 分子內(nèi)部形成一個(gè)疏水的核心( h y d r o p h o b i cc o r e ) ；( 3 ) 磷酸殘基上的負(fù)電荷與介質(zhì) 中的陽離子之間形成的離子鍵。其中第二種力是主要結(jié)合力。在二級(jí)結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ) 上，d n a 還可扭曲或卷曲形成三級(jí)結(jié)構(gòu)。 1 1 3d n a 的變性與復(fù)性 1 1 3 1d n a 變性d n a 生物功能表現(xiàn)所必需的 d n a 受到某些理化因素的影響，使分子中的氫鍵、堿基堆積力等被破壞，雙 螺旋結(jié)構(gòu)解體，分子由雙鏈( d s d n a ) 變?yōu)閱捂? s s d n a ) 的過程稱為變性。變 性的實(shí)質(zhì)是維持二級(jí)結(jié)構(gòu)的作用力受到了破壞，即雙螺旋破壞。但是d n a 的一 級(jí)結(jié)構(gòu)未變，即變性不引起共價(jià)鍵的斷裂。 引起變性的外部因素：加熱、極端的p h 、有機(jī)溶劑、尿素、甲酰胺等。它 們都能破壞氫鍵、疏水鍵、堿基堆積力，從而破壞雙螺旋。在實(shí)際應(yīng)用中，d n a 的熱變性用得較多。 d n a 變性后的表現(xiàn)：分子由具有一定剛性變?yōu)闊o規(guī)則線團(tuán)，d n a 溶液的粘 度降低，沉降速度增加；藏在里面的堿基全部暴露出來，使d n a 的a 2 6 0 增加， 即表現(xiàn)出增色效應(yīng)( h y p e r c h r o m i ce f f e c t ) 。 在活細(xì)胞內(nèi)，d n a 在表現(xiàn)其生物活性時(shí)，要解開雙螺旋鏈，實(shí)質(zhì)上也是一個(gè) 變性過程。因此，d n a 變性也是其生物功能表現(xiàn)所必需的。 1 1 3 2d n a 復(fù)性一核酸研究中的常用手段 d n a 的變性是可逆的，解除變性條件，滿足一定條件后，解開的兩條d n a 互補(bǔ)鏈又可以重新恢復(fù)形成雙螺旋結(jié)構(gòu)，并恢復(fù)有關(guān)的性質(zhì)和生物功能。這個(gè)過 程稱為d n a 復(fù)性。例如，對(duì)熱變性的d n a 溶液，緩慢冷卻，雙螺旋又重新形成， 之所以變性d n a 能夠復(fù)性，是由于互補(bǔ)鏈的存在，且滿足了復(fù)性條件，如復(fù)性 溫度、d n a 濃度、溶液離子強(qiáng)度等。在核酸雜交的研究中要經(jīng)常利用d n a 的變 性和復(fù)性。有時(shí)候變性以后如果不想讓它復(fù)性就要改變復(fù)性條件。例如，熱變性 的d n a 溶液迅速冷卻，復(fù)性條件無法達(dá)到，d s d n a 變?yōu)閟 s d n a 以后無法再變回 2 青島科技大學(xué)研究生學(xué)位論文 d s d n a 。 1 2 小分子化合物與d n a 的作用方式 d n a 分子中平行堆積的堿基、聚合的陰離子磷酸骨架和兩條核苷酸鏈螺旋 形成的大溝n d , 漣j 構(gòu)成了有機(jī)小分子與b n a 相互結(jié)合的位點(diǎn)，作用的方式主要 有非共價(jià)結(jié)合、共價(jià)結(jié)合、剪切作用三種類型。 1 2 1 非共價(jià)結(jié)合 非共價(jià)結(jié)合包括靜電結(jié)合、溝內(nèi)結(jié)合和嵌插結(jié)合。另外還有氫鍵、離子鍵、 范德華力、疏水鍵這些弱的相互作用。小分子通過溝內(nèi)或嵌插結(jié)合在核酸的螺旋 溝或堿基中，加上靜電力的作用，常會(huì)誘發(fā)許多生物效應(yīng)，阻礙核酸信息的正常 表達(dá)。同時(shí)，這三種力還憑借氫鍵、范德華力、疏水作用等使相互作用加強(qiáng)。 ( 1 ) 靜電結(jié)合( e l e c t r o s t a t i cb i n d i n g ) ，即小分子與d n a 分子的帶負(fù)電荷的核 糖磷酸基骨架之間通過靜電作用而結(jié)合。該作用沒有選擇性，是非特異性的。通 常認(rèn)為單純的靜電結(jié)合模式在作為藥物的應(yīng)用上價(jià)值不大，但有些分子與d n a 的靜電作用對(duì)其與d n a 間的嵌插作用起著重要的穩(wěn)定作用。 ( 2 ) 溝內(nèi)結(jié)合( g r o o v eb i n d i n g ) ，即小分子與雙鏈d n a 的大溝或小溝的堿基 邊緣直接發(fā)生相互作用。大溝區(qū)、小溝區(qū)在電勢(shì)能、氫鍵特征、立體效應(yīng)、水合 作用上都有很大不同。小分子與d n a 的小溝壁緊密作用，這是由于小溝區(qū)為 a - t 富集區(qū)，而且存在水合結(jié)構(gòu)，具有芳香環(huán)結(jié)構(gòu)的小分子易于自由扭轉(zhuǎn)來適合 小溝區(qū)，同時(shí)取代溝內(nèi)的水分子進(jìn)入小溝區(qū)，作用形式主要是氫鍵作用和范德華 力。大分子蛋白質(zhì)與d n a 在大溝結(jié)合。 ( 3 ) 嵌插結(jié)合( i n t e r c a l a t i o nb i n d i n g ) ，即平面或幾乎平面的芳香環(huán)嵌入d n a 分 子雙螺旋的堿基對(duì)之間。結(jié)合的作用力來自芳環(huán)的離域7 【體系與堿基的7 c 體系 間形成的龍一7 r 相互作用及疏水相互作用。這種作用是藥物分子與d n a 發(fā)生作用 的重要形式之一。 1 2 2 共價(jià)結(jié)合 與非共價(jià)結(jié)合相比，小分子化合物與d n a 共價(jià)結(jié)合的序列特異性識(shí)別能力 要強(qiáng)許多。小分子與d n a 特定堿基作用形成加合物，使d n a 的雙鏈解旋且發(fā)生 彎曲。如苯并二毗咯類抗生素( d u o c a r m y c i n ) 及其衍生物只能在d n a 小溝中對(duì) a t 富集區(qū)識(shí)別，分子中活潑的環(huán)丙烷與小溝區(qū)內(nèi)特定堿基序列中a 的n 3 共價(jià)結(jié) 合后導(dǎo)致在該位點(diǎn)脫去嘌呤【1 5 】。 3 基丁固體電極修飾的d n a 電化學(xué)生物傳感器研究 1 2 3 剪切作用 具有剪切作用的分子特異選擇結(jié)合位點(diǎn)，并最終使d n a 鏈斷裂。博萊霉烈1 6 】 ( b l e o m y c i n ) 是一種典型的d n a 切割化合物，分子結(jié)構(gòu)的特殊性使其能夠識(shí)別并 結(jié)合在d n a 中5 - g c 3 序列的鳥嘌呤上，然后經(jīng)一系列化學(xué)反應(yīng)最終導(dǎo)致d n a 斷鏈，這種雙功能性對(duì)于設(shè)計(jì)人工核酸酶及發(fā)展有效的抗腫瘤藥物具有非常重要 的指導(dǎo)意義。 1 3d n a 與小分子作用的研究方法 在研究小分子和d n a 相互作用的過程中，表征手段和研究方法是獲得可靠 信息的關(guān)鍵。常用的分析方法主要有電化學(xué)法、光譜法、序列凝膠電泳及足印跡 分析技術(shù)、x 一射線晶體衍射分析法及粘度法等。 1 3 1 電化學(xué)法 自b a r d 等人最先用電化學(xué)方法對(duì)溶液中的電活性金屬配合物與d n a 相 互作用進(jìn)行研究后【1 7 】，電化學(xué)研究方法迅猛發(fā)展。一方面，因?yàn)殡娀瘜W(xué)方法具有 快速、靈敏、樣品消耗量少和儀器簡(jiǎn)單的優(yōu)點(diǎn)，其在d n a 結(jié)構(gòu)分析、藥理分析 及d n a 傳感方面的應(yīng)用越來越受重視，而且顯示出了驚人的發(fā)展速度。另一方 面，由于生物體系是一個(gè)充滿電解質(zhì)溶液的體系，絕大多數(shù)反應(yīng)都發(fā)生在膜系統(tǒng) 的界面上，因而盡管存在許多物理和化學(xué)上的差異，電化學(xué)體系仍然是一個(gè)非常 好的生物體系模擬，是了解d n a 的理化性質(zhì)的有效手段之一。 對(duì)d n a 的電化學(xué)行為的研究是實(shí)現(xiàn)d n a 電化學(xué)檢測(cè)、d n a 傳感器設(shè)計(jì) 及研究d n a 與靶向分子作用的基礎(chǔ)。常用的電化學(xué)技術(shù)包括：循環(huán)伏安法和 線性掃描伏安法【1 8 , 1 9 ；方波伏安法 2 0 】；微分脈沖伏安澍2 1 】；電位溶出伏安 法【2 2 】；交流阻抗【2 3 1 等。 b a r d 2 4 - 2 6 等人系統(tǒng)研究了o s ( b p y ) 3 2 + 、c o ( b p y ) 3 3 + 、f e ( b p y ) 3 3 + 、c o ( p h e n ) 3 ”、 f e ( p h e n ) 3 3 + 等金屬配合物和d n a 的相互作用后發(fā)現(xiàn)，若e o 向負(fù)方向移動(dòng)，則小 分子與d n a 發(fā)生靜電作用；若e o 向正方向移動(dòng)，則小分子與d n a 發(fā)生嵌插 作用，這也成為電化學(xué)法研究小分子和d n a 相互作用時(shí)的重要依據(jù)。 z h o u 等【27 】采用電化學(xué)方法包括循環(huán)伏安法、微分脈沖伏安法等研究了 c o ( p h e n ) 3 郵( p h e n = 1 ，1 0 鄰菲咯啉、聯(lián)吡啶) 與6 巰基嘌呤配合物及d n a 間的作用 機(jī)理。結(jié)果表明c o ( ph e n ) 3 * 3 - 6 巰基嘌呤與d n a 是部分的嵌插作用相結(jié)合，而c o ( b p y ) 3 + 3 則是通過靜電作用相結(jié)合。這項(xiàng)研究將有助于應(yīng)用6 巰基嘌呤來設(shè)計(jì)和合 成鎮(zhèn)咳藥物。 4 青島科技大學(xué)研究生學(xué)位論文 彭圖治 2 8 - 3 0 1 等人采用循環(huán)伏安法和計(jì)時(shí)庫侖法等電化學(xué)手段研究了更生霉 素、h o e s t3 3 2 5 8 、米托蒽醌等小分子和d n a 的相互作用并推導(dǎo)出不可逆電活性 分子與d n a 相互作用的電化學(xué)公式，可以便捷準(zhǔn)確的計(jì)算d n a 與配體結(jié)合常 數(shù)和結(jié)合位點(diǎn)信息。 1 3 2 光譜法 幾乎所有的光譜學(xué)技術(shù)都可以用來研究小分子與d n a 的相互作用，其中紫 外可見光譜、分子熒光光譜、圓二色譜、線二色譜是較為常用的方法。 ( 1 ) 紫外一可見光譜法：紫外可見光譜法是研究小分子與d n a 相互作用機(jī)理最 常用、最方便的方法。d n a 分子中的堿基具有光學(xué)活性，在2 6 0m 附近有特征 吸收，但與小分子作用后由于其吸收光譜變化通常較小，因此一般不選該吸收峰 作為研究對(duì)象。許多小分子本身有光學(xué)活性，與d n a 作用后會(huì)發(fā)生某些變化， 因此常用紫外可見光譜來研究小分子與d n a 的作用。 ( 2 ) 熒光光譜法：有些小分子與d n a 結(jié)合后，會(huì)使原本熒光很弱的分子熒光強(qiáng) 度增大很多。有些小分子與d n a 結(jié)合后，會(huì)發(fā)生熒光猝滅作用。利用這些現(xiàn)象， 可用熒光光譜法進(jìn)行分析，獲得熱力學(xué)和動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)。 ( 3 ) 圓二色光譜法和線二色光譜法：圓二色光譜( c d ) 是以高頻變換的左旋或右 旋偏振光作為入射光，一方面根據(jù)d n a 在2 4 0 - 2 9 0a m 處的吸收能提供有關(guān)其二 級(jí)結(jié)構(gòu)的信息，確定d n a 的構(gòu)象；另一方面對(duì)一些本身沒有c d 信號(hào)，但在與 d n a 結(jié)合后能產(chǎn)生誘導(dǎo)c d 的分子可獲取有關(guān)其結(jié)構(gòu)的一些間接信息。線二色光 譜( l d ) 則采用了與固定光軸方向平行或垂直的平面偏振光。 1 3 3 序列凝膠電泳及足印跡分析技術(shù) 序列凝膠電泳及足印跡分析技術(shù)是生物學(xué)中用來研究小分子與d n a 相互作 用最基本的兩種手段【3 l 】。凝膠電泳可以考察d n a 剪切或其它分子與d n a 螺旋共 價(jià)結(jié)合留下的永久性痕跡，研究其它分子與d n a 作用的序列特異性；對(duì)于多數(shù) 與d n a 發(fā)生非共價(jià)結(jié)合的分子來說，足印跡法及轉(zhuǎn)錄足印跡法是確定其結(jié)合位 點(diǎn)的比較好的方法，其中轉(zhuǎn)錄阻斷的方法更易判斷序列特異性較高的藥物結(jié)合位 點(diǎn)。 1 3 4x 一射線晶體衍射分析法 對(duì)于d n a 與小分子結(jié)合后所引起的結(jié)構(gòu)變化，用x 射線晶體衍射分析 ( x r d ) 可提供直接的結(jié)合位點(diǎn)及結(jié)構(gòu)變化的信息【3 2 】，但需要提供小分子與d n a 加和物的晶體。由于目前在培養(yǎng)小分子與d n a 加和物的晶體方面存在一定的困 5 基丁同體電極修飾的d n a 電化學(xué)生物傳感器研究 難，這方面的研究現(xiàn)在開展不多。另外，還存在晶體狀態(tài)下的分子構(gòu)型與其生理 環(huán)境下的液相構(gòu)型是否一致的問題。 1 3 5 粘度法 “ 在沒有晶體結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)的情況下，粘度測(cè)定是檢測(cè)小分子與d n a 是否以插入 方式結(jié)合的最有效的方法。小分子配合物以其插入配體通過經(jīng)典的插入方式與 d n a 作用時(shí)，d n a 相鄰堿基對(duì)的距離會(huì)變大以容納插入配體，因而導(dǎo)致d n a 雙螺旋伸長(zhǎng)，d n a 溶液的粘度增加；當(dāng)以靜電、溝面結(jié)合等非插入方式與d n a 作用時(shí)，d n a 溶液的粘度無明顯變化；以部分插入方式與d n a 作用時(shí)，則可能 使d n a 雙螺旋發(fā)生扭結(jié)，使其粘度減j , 、 3 3 , 3 4 】。 1 3 6 其它方法 此外，原子力顯微鏡( a f m ) 和掃描隧道顯微鏡( s t m ) 可以直觀的觀察到 小分子與d n a 結(jié)合的方式，是人們研究小分子和d n a 相互作用的重要方法 【3 5 1 。微量熱法、能量轉(zhuǎn)移法等也是近幾年來發(fā)展起來的無損分析法。 總之，對(duì)于小分子化合物與d n a 相互作用的研究，僅用單一的方法是遠(yuǎn)遠(yuǎn) 不能令人滿意的，而應(yīng)采取多種分析方法進(jìn)行全方位、多層次的研究，以獲得作 用結(jié)合方式、結(jié)合位點(diǎn)數(shù)、反應(yīng)熱力學(xué)、動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)等較為完備和可靠的結(jié)論。 1 4d n a 電化學(xué)生物傳感器的研究 1 4 1d n a 電化學(xué)生物傳感器的基本結(jié)構(gòu) d n a 電化學(xué)生物傳感器是9 0 年代的一個(gè)新的研究熱點(diǎn)。它是將有反應(yīng)活性的 一單股寡核苷酸固定在某種支持物( 感受器) 上作為探針，它可以在含有復(fù)雜成 分的環(huán)境下特異地識(shí)別出某一靶子底物，并通過換能裝置把非電量生物信號(hào)轉(zhuǎn)換 為電信號(hào)。d n a 電化學(xué)傳感器是一種全新的基因檢測(cè)技術(shù)，它不僅具有分子識(shí) 別及傳感功能，而且還具有良好的分離純化基因功能，因此在分子生物學(xué)和生物 醫(yī)學(xué)工程領(lǐng)域有很大的實(shí)際意義。 d n a 電化學(xué)生物傳感器主要由兩個(gè)部分組成，一是由d n a 探針構(gòu)成的感應(yīng) 器，二是換能器。d n a 探針一般是人工合成的單鏈d n a ( s s d n a ) 片段，其堿基序 列與靶基因的堿基序列互補(bǔ)。換能器的功能是將d n a 雜交信息轉(zhuǎn)換為可測(cè)定的 電信號(hào)，根據(jù)信號(hào)差異可以定性定量檢測(cè)靶基因。 d n a 電化學(xué)傳感器因其具有受環(huán)境干擾小，電信號(hào)測(cè)量比較簡(jiǎn)單，不需要激 光誘導(dǎo)或精密的分光器件等裝置和儀器成本低等優(yōu)點(diǎn)，是最有發(fā)展前景的一類 6 青島科技大學(xué)研究生學(xué)位論文 d n a 分析方法。 1 4 2d n a 電化學(xué)生物傳感器的原理 d n a 電化學(xué)傳感器根據(jù)信號(hào)轉(zhuǎn)換方式的不同可以分為兩類：一類是有標(biāo)記的 方法( 1 a b e l l e dm e t h o d s ) ，另一類是無標(biāo)記的方法( 1 a b e l f r e em e t h o d s ) 。有標(biāo)記的 方法是通過可以和d n a 通過嵌插作用結(jié)合的氧化還原活性小分子的電信號(hào)的變 化來區(qū)分s s d n a 和d s d n a 。它是以電極為換能器，將一定長(zhǎng)度( 通常為十五到五 十個(gè)堿基) 的單鏈d n a ( s s d n a ) 片段固定到電極( 如金電極、玻碳電極等) 表面，形 成d n a 探針，在一定的溫度、離子強(qiáng)度、p h 等條件下，這種d n a 探針上的s s d n a 與溶液中與之互補(bǔ)的靶d n a ( e d n a ) 發(fā)生特異的選擇性雜交，雜交結(jié)果形成雙鏈 d n a ( d s d n a ) ，這種轉(zhuǎn)變的結(jié)果通過電活性雜交指示劑所引起的電壓、電流或電 導(dǎo)等電信號(hào)的變化體現(xiàn)出來，從而可對(duì)特定序列的靶基因進(jìn)行定性定量檢測(cè)。無 標(biāo)記的方法的表現(xiàn)方式有兩種：一種是通過d n a 本身鳥嘌呤的電化學(xué)信號(hào)；另 一種是比較s s d n a 和d s d n a 在電極表面的電化學(xué)特征的不同，可以通過電化學(xué) 阻抗的方法來表征。 應(yīng)用d n a 電化學(xué)傳感器進(jìn)行分析時(shí)主要步驟如下： ( 1 ) d n a 探針的固定，即要將s s d n a 連接或者固定到一個(gè)固體電極的表面， 形成d n a 探針電極。 ( 2 ) 分子雜交過程，d n a 探針電極放入被測(cè)溶液，與互補(bǔ)的目標(biāo)s s d n a 在最 佳條件下雜交形成d s d n a ，這一過程中必須控制合適的雜交條件。 ( 3 ) 雜交的指示，即將雜交信息轉(zhuǎn)化為可測(cè)定的電化學(xué)信號(hào)，通過電流、電 壓、電導(dǎo)、電容或電化學(xué)阻抗的變化作為檢測(cè)信號(hào)。 ( 4 ) 雜交信號(hào)的電化學(xué)測(cè)量，根據(jù)所選擇電化學(xué)指示劑的不同，用相應(yīng)的電 化學(xué)方法完成電化學(xué)信號(hào)的測(cè)定。 其中，d n a 探針的篩選、固定以及雜交的指示是這類傳感器的關(guān)鍵技術(shù)， 研究小分子和d n a 的相互作用對(duì)于篩選合適的雜交指示劑具有重要的意義。 1 4 3s s d n a 的固定方法 固定s s d n a 的基底有很多種，常用的基底有電極以及便于分離的磁性納米顆 粒 3 6 , 3 7 ，其中電極有碳質(zhì)電極和金屬電極。碳質(zhì)電極包括玻碳電極3 8 , 3 9 、碳糊電 極1 4 0 , 4 1 、熱解石墨電極【4 2 1 等，金屬電極包括金電極【4 3 】、鉑電極等。磁性納米顆粒 結(jié)合了磁性粒子和納米材料的優(yōu)點(diǎn)，是一種新型的親和性固相載體，具有粒徑小， 超順磁性和比表面積大等特性，作為基因載體有著優(yōu)越的特性，可能成為最有前 景的基因載體材料。 7 基丁同體電極修飾的d n a 電化學(xué)生物傳感器研究 固定s s d n a 的方法也因電極種類的不同而不同，常用的固定方法主要有吸附 法、共價(jià)鍵合法、自組裝法、組合法等。 1 4 3 1 吸附法 即將d n a 直接滴涂或在一定電位富集吸附到電極表面。早期的電化學(xué)傳感 器一般都用此種方法。w 幻g 【4 4 】等在0 1t o o l l - 1p h5 o 的乙酸緩沖溶液中于+ 1 7 v 處理碳糊電極1m i n ，然后于+ o 5v 吸附d n a 探針2r a i n ，從而固定d n a 探針。也有文章用兩步吸附法固定d n a ，龐代文等【4 5 1 采用先通過2 ，2 。二硫二乙 醇自組裝得到自組裝單分子層( s a m ) ，再在s a m 上共價(jià)鍵合和吸附固定d n a 制備了兩類d n a 修飾電極，并對(duì)得到的d n a 修飾電極進(jìn)行了電化學(xué)和譜學(xué)表 征。周家宏等【4 6 】先在裸金電極上吸附聚賴氨酸，然后再將電極浸入d n a 水溶液 中制得d n a 修飾電極。吸附法相對(duì)簡(jiǎn)單，但是結(jié)合的力度和方向性較差，d n a 在溶液中有可能脫附或結(jié)構(gòu)扭曲而不易發(fā)生正確的雜交反應(yīng)。 1 4 3 2 共價(jià)鍵合法 這是d n a 分子固定的一種常用方法。它是將電極表面預(yù)處理后產(chǎn)生各種功 能的活性鍵合基因，再與s s d n a 發(fā)生有機(jī)反應(yīng)，通過共價(jià)鍵的形成把s s d n a 固 定在電極表面。方禹之1 4 7 4 9 1 等人用多種方法將s s d n a 片段固定在石墨電極上，如 用e d c 或n h s 活化已被氧化的光譜純石墨電極，用于固定s s d n a ；或用5 3 氨基丙基三乙氧基硅烷( p r n h 2 ，硅烷i i ) 將石墨電極表面硅烷化以引入氨基， 再用e d c 為偶聯(lián)活化劑，將s s d n a 固定于電極表面。 1 4 3 3 自組裝法 根據(jù)分子的自組裝作用，在電極表面形成高度有序的s s d n a 單分子層，通 常是利用巰基化合物修飾s s d n a 后再組裝于金電極的表面形成單分子層，有研究 結(jié)果已證實(shí)硫醇化合物與金電極的作用機(jī)理如下： 2 a u + 2 r s h = 2 a u s r + h 2 2 a u + 2 r s h + 0 2 = 2 a u s r + h 2 0 a u s 間的結(jié)合很強(qiáng)( 鍵能8 4k j m 0 1 ) ，很少有其它基團(tuán)與之競(jìng)爭(zhēng)，保證了這種吸 附的選擇性。同時(shí)巰基和大多數(shù)有機(jī)基團(tuán)的反應(yīng)性強(qiáng)，使得巰基衍生物制備不太 困難，為自組裝單分子膜( s a m ) 外表面基團(tuán)的控制提供了方便【5 0 】。自組裝單分 子膜分子排列和l b ( l a n g m u i r - b l o d g e t t ) 膜一樣有序緊密，而且不易被水和有機(jī) 溶劑溶解洗脫。s a m 對(duì)酸、堿和離子滲透都有較強(qiáng)的抵抗能力，在超低溫、超 高真空f o r t y ) 條件下也保持相對(duì)穩(wěn)定。s a m 技術(shù)結(jié)合了化學(xué)吸附的穩(wěn)定性和 8 青島科技大學(xué)研究生學(xué)位論文 l b 膜的有序性，通過變化頭基、尾基以及鏈的類型和長(zhǎng)度可以控制和改變單層 的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)，通過選擇適當(dāng)?shù)奈不梢再x予s a m 外表面以特定的性質(zhì)，并可 為進(jìn)一步組裝提供活性結(jié)合點(diǎn)。 金電極上的巰基自組裝研究主要集中在固定方法及條件方面。d n a 在金電 極的自組裝固定方法主要有兩種：( 1 ) 有機(jī)硫化物或二硫化物在金電極上形成自 組裝膜，引入各種所需的活性基團(tuán)，如羧基、羥基、氨基等，然后用偶聯(lián)活化劑 d n a 通過共價(jià)反應(yīng)連接在自組裝膜上，或是利用自組裝膜上基團(tuán)與d n a 嵌插 作用固定。( 2 ) 先將d n a 進(jìn)行衍生化反應(yīng)，在d n a 上連接上- - s h 基或s 原子， 后將衍生化的d n a 直接自組裝固定在金電極上，得到結(jié)合牢固、排列有序、分 布均勻的單層d n a 自組裝膜。 鞠烷先等【5 1 】使用碳二酰亞胺( e d c ) 活化巰基乙酸自組膜，