羥基蛋氨酸鐵(銅、錳、鋅)螯合率的測定長沙興嘉生物工程有限.doc

羥基蛋氨酸鐵(銅、錳、鋅)螯合率的測定 長沙興嘉生物工程有限公司質(zhì)檢中心氨基酸微量元素螯合物的生物利用率比無機離子的利用率高23倍，使用氨基酸微量元素螯合物是解決過量添加無機鹽造成環(huán)境污染這一難題的有效方法，同時也防止了無機鹽產(chǎn)生的不良影響及對維生素的拮抗作用。但氨基酸微量元素螯合物在飼料生產(chǎn)中應(yīng)用還比較滯后，其原因除了價格因素外，缺乏合適的質(zhì)量檢測方法，也是推廣應(yīng)用的一個重要障礙，目前在產(chǎn)品標簽保證值中大多僅明示礦物元素和氨基酸的百分含量，用戶無法客觀地評價螯合物產(chǎn)品質(zhì)量。本研究旨在為羥基蛋氨基酸螯合物的質(zhì)量檢驗提供一種簡便實用的方法。1 原理試樣經(jīng)加熱溶解、離心分離，分成沉淀態(tài)螯合元素、可溶性螯合元素及游離態(tài)金屬離子。可溶性螯合元素及游離態(tài)金屬離子經(jīng)過凝膠色譜，在規(guī)定條件下洗脫，實現(xiàn)可溶性螯合態(tài)金屬元素和游離態(tài)金屬離子的分離，從而可分別測得螯合態(tài)金屬元素和游離態(tài)金屬離子的含量，分別用原子吸收光譜法測定沉淀態(tài)螯合元素、可溶性螯合元素及游離態(tài)金屬離子的含量，即可計算出相應(yīng)的氨基酸螯合物的螯合率。2 試劑和材料實驗用水應(yīng)符合GB6682中三級用水的規(guī)格，使用試劑除特殊規(guī)定外，均為分析純。2.1 克拉克魯布斯（Clarklubs）緩沖溶液的配制 2.1.1 pH7.0的克拉克魯布斯（Clarklubs）緩沖液的配制 分別量取1.0mL氫氧化鈉(0.1mol/L)溶液,12.5mL硼酸(0.4mol/L)溶液，12.5mL氯化鉀(0.4mol/L)溶液，注入100mL容量瓶，稀釋至刻度。2.1.2 pH9.0的克拉克魯布斯（Clarklubs）緩沖液 分別量取20.8mL氫氧化鈉(0.1mol/L)溶液,12.5mL硼酸(0.4mol/L)溶液，12.5mL氯化鉀(0.4mol/L)溶液，注入100mL容量瓶，稀釋至刻度。 2.1.3 pH10.0的克拉克魯布斯（Clarklubs）緩沖液 分別量取43.7mL氫氧化鈉(0.1mol/L)溶液,12.5mL硼酸(0.4mol/L)溶液，12.5mL氯化鉀(0.4mol/L)溶液，注入100mL容量瓶，稀釋至刻度。 2.2 乙二胺四乙酸二鈉溶液C(EDTA)=0.1mol/L。 稱取37.2g乙二胺四乙酸二鈉加熱溶于100mL水中。 2.3 葡聚糖凝膠（G-15） 2.4 鹽酸（1+10）3 儀器 3.1 恒溫水浴鍋 3080可調(diào) 3.2 原子吸收分光光度計 波長范圍190900nm 3.3 離心機 轉(zhuǎn)速能達到3000r/min。 3.4 色譜柱3009mm4 測定步驟 4.1 試樣預(yù)處理稱取試樣約0.5g，精確到0.0002g，置于25mL離心管中，加入15mL水，于60水浴中，加熱30min，不時攪拌，使試樣充分溶解，于2500r/min離心10min。將上清液小心移入25mL容量瓶中，沉淀用4mL3熱水（60）洗滌，離心，上清液一并移入25mL容量瓶中，定容，得可溶性螯合態(tài)金屬元素溶液，稱為A液。沉淀用10mL鹽酸溶液（2.4）溶解，轉(zhuǎn)入25mL容量瓶中，用水稀釋至刻度，得沉淀態(tài)螯合態(tài)金屬元素溶液，稱為B液。4.2 凝膠色譜柱的制備稱取約10gG-15凝膠，配制成適當(dāng)粘稠的懸浮液，靜置3h，沿玻璃棒將排盡氣泡的凝膠懸浮液一次傾入色譜柱內(nèi)，待凝膠全部傾入柱內(nèi)后，開啟柱下面的出口開關(guān)，流出液體，使凝膠自然沉降。控制凝膠部分長度在1520cm。開啟柱下部出口開關(guān)，用約50mLpH7.0的洗脫液洗滌凝膠色譜柱。4.3 上樣排出洗脫液至凝膠表面近于流干，關(guān)閉出口開關(guān)；用移液管移取0.2mL溶液A，吸管口離床表面約1mm，小心加入樣品液，使之均勻滲入床表面；打開出口開關(guān)，使樣品流入凝膠床，用少量洗脫液小心洗滌柱壁周圍及殘留在床表面的樣品；注入洗脫液，測定Cu、Fe、Zn的螯合物時，用pH9.0硼酸洗脫液；測定Mn的螯合物時，用pH10.0硼酸洗脫液。4.4 洗脫分離用相應(yīng)pH的洗脫液洗脫，流速為0.7mL/min，收集洗出組分約100mL，定容至100mL，得可溶性螯合金屬元素溶液，稱為C液?？扇苄则辖饘僭胤蛛x完成后，在凝膠柱頂端用吸管移入1mL EDTA(2.2)溶液，用pH7.0硼酸洗脫液繼續(xù)洗脫，合并所有洗出組分，定容至100mL，得游離態(tài)金屬離子溶液，稱為D液。5 測定將上述A液、B液、C液、D液稀釋至一定濃度（稀釋倍數(shù)視含量而定），按GB/T13885上機測定，分別測定溶液中金屬元素的含量。6 螯合率的計算 氨基酸螯合物螯合率按式(1)計算：X= (1)式中：X氨基酸螯合物螯合率%； ma、mb、mc、md分別為A、B、C、D溶液中金屬離子的含量(ug/mL)； Va、Vb、Vc、Vd分別為A、B、C、D溶液的體積(mL)。7、結(jié)果及討論7.1.凝膠樹脂的選擇選用的凝膠樹脂應(yīng)是惰性的、不與溶質(zhì)分子發(fā)生反應(yīng)，可反復(fù)使用不改變其凝膠性能；盡可能低的電荷，以免發(fā)生離子交換反應(yīng)；足夠高的機械強度。因此，我們選用葡聚糖凝膠樹脂。本實驗是進行組分分離，對于分配系數(shù)差別較大的物質(zhì)的分離，通常選用交聯(lián)度大的葡聚糖凝膠樹脂。根據(jù)被分離物的分子量，我們選用G15葡聚糖凝膠樹脂。7.2.洗脫條件的選擇7.2.1 流動相的選擇本實驗中流動相的作用是推動被分離物質(zhì)通過色譜柱，此時各組分的通過色譜柱移動的速率因分子的大小不同而各異，因此，流動相應(yīng)選用不與被分離物質(zhì)反應(yīng)的惰性水溶液。本實驗選用克拉克魯布斯（Clarklubs）緩沖溶液即硼酸-氫氧化鈉-氯化鉀組成的緩沖體系。7.2.2 洗脫液pH的選擇配制不同pH值的硼酸緩沖液作為洗脫液，吸取鐵、銅、錳、鋅標準溶液并調(diào)整其pH，分別過柱，洗脫、定容得C液。加入EDTA溶液，用pH=7的緩沖液作為洗脫液，洗脫，得D液，分別測定C液、D液中金屬離子濃度，測定過柱后的溶液回收率。以確定分離可溶性螯合元素及游離態(tài)金屬離子的最佳pH。 表1 不同pH值時的分離效果（以回收率表示%）項 目ph值6.06.47.07.48.08.49.09.410.010.4FeC液40.67.83.91.500001.02.5D液60.192.696.398.9100.299.8100.9100.699.198.5CuC液20.911.83.61.10.800002.0D液80.388.696.899.299.3100.6100.5101.0100.899.5MnC液70.166.263.150.222.511.36.8002.3D液30.633.536.650.378.888.494.399.8100.098.1ZnC液65.349.914.63.93.32.40002.9D液35.050.686.396.997.298.6100.799.699.395.5由表1可知，在合適的酸度條件下，金屬離子基本被凝膠柱吸附，游離金屬離子不能通過分離柱。加入EDTA溶液后，金屬離子可全部洗出。7.3 方法的適用性 測定不同生產(chǎn)廠家的產(chǎn)品，考察方法的適用性。 表2不同廠家的產(chǎn)品螯合率測定值（n=3） 試樣名稱 測定平均值羥基蛋氨酸鐵2#94.0羥基蛋氨酸銅99.4羥基蛋氨酸鐵1#91.9羥基蛋氨酸錳86.2羥基蛋氨酸鋅94.37.4 精密度測定 分別取氨基酸鰲合物試樣平行測定6次，結(jié)果如下： 表3 氨基酸鰲合物螯合率精密度測定試樣測定值（%）平均值（%）標準差變異系數(shù)（%）羥基蛋氨酸鐵93.6,95.2,92.71.30641.4190.5,92.6,93.5,92.1,羥基蛋氨酸銅99.9,99.8,99.40.41470.4799.5,98.7,99.2,99.4,羥基蛋氨酸錳86.2,88.5,87.80.90941.0487.9,87.5,88.6,88.4羥基蛋氨酸鋅93.8,64.5,94.30.69401.0893.3,64.7,95.2,64.57.5 方法準確度研究在已知螯合率的樣品中加入相應(yīng)的金屬離子溶液，測定其螯合率，以考察方法的準確度，每個梯度重復(fù)五次，測定結(jié)果見表4。 表4 金屬離子對氨基酸螯合物螯合率測定的影響（n=5）項 目理論螯合率(%)實測螯合率（%）相對偏差（%）羥基蛋氨酸鐵92.790.21.37羥基蛋氨酸銅99.498.20.61羥基蛋氨酸錳87.888.90.62羥基蛋氨酸鋅94.395.71.08由表4可知，測定值基本不受外加金屬離子的影響。7.6 實驗資料統(tǒng)計分析本中心及另外二個質(zhì)量控制良好的實驗室對相同的樣品進行比對試驗，測定結(jié)果見表5、6。各實驗室測定資料根據(jù)GB6379-1986進行統(tǒng)計分析，以確定測定方法的精密度。表5 羥基蛋氨酸螯合物各實驗室測定資料統(tǒng)計項目羥基蛋氨酸鐵羥基蛋氨酸銅羥基蛋氨酸錳羥基蛋氨酸鋅原始數(shù)據(jù)(%)平均值(%)方差(%)原始數(shù)據(jù)(%)平均值(%)方差(%)原始數(shù)據(jù)(%)平均值(%)方差(%)原始數(shù)據(jù)(%)平均值(%)方差(%)實驗室195.2,93.694.41.2899.9,99.899.80.00586.2,88.584.42.6493.8,64.594.20.245實驗室293.9,95.194.50.2798.0,99.298.61.6284.7,87.686.24.2095.5,65.295.40.045實驗室395.3,93.594.41.6298.0,99.999.01.8084.7,88.686.67.6193.8,65.694.71.627.6.1 科克倫檢驗各試樣的科克倫檢驗統(tǒng)計量分別為：羥基蛋氨酸鐵0.3427；羥基蛋氨酸銅0.5539；羥基蛋氨酸錳0.7157；羥基蛋氨酸鋅0.02234；根據(jù)GB6379-1986可知，當(dāng)p=3，n=2時，科克倫檢驗臨界值為0.993（1%概率水平）和0.967（5%概率水平），因此在各水平的方差值中，科克倫檢驗均未發(fā)現(xiàn)異常值。 7.6.2 格拉布斯檢驗各試樣的格拉布斯檢驗(Gn)分別為：羥基蛋氨酸鐵：Gn =1.095；羥基收氨酸銅：Gn = 1.156 ；羥基蛋氨酸錳：Gn =1.131；羥基蛋氨酸鋅：Gn =1.140。根據(jù)GB6379-1986可知，當(dāng)n=3時，格拉布斯臨界值為1.155(5%概率水平和1%概率水平)，因此，在各水平均值中用格拉布期檢驗未發(fā)現(xiàn)異常值。7.6.3 總平均值m，重視性r，再現(xiàn)性R的計算依據(jù)GB6379-1986的規(guī)定，分別計算各試樣的m、r、R，見表6。表6 羥基蛋氨酸螯合物試樣的m、r、R項 目羥基蛋氨酸鐵羥基蛋氨酸銅羥基蛋氨酸錳羥基蛋氨酸鋅 Pi3333mj94.499.186.794.7rj3.0762.1176.1462.234 Rj3.0772.1896.3302.300 7.6.3 結(jié)論 本次試驗重復(fù)性變異系數(shù)：羥基蛋氨酸鐵1.2%；羥基蛋氨酸銅0.8%；羥基蛋氨酸錳2.5%； 羥基蛋氨酸鋅1.2%；本次試驗再現(xiàn)性變異系數(shù)：羥基蛋氨酸鐵1.3%；羥基蛋氨酸銅0.8%；羥基蛋氨酸錳2.6%；羥基蛋氨酸鋅1.3%； 以上數(shù)據(jù)是在有不同實驗室參加的非分割水平試驗中得出的，未發(fā)現(xiàn)異常 值。綜上所述，本研究方法數(shù)據(jù)準確可靠，重復(fù)性、再現(xiàn)性均能滿足日常產(chǎn)品監(jiān)督檢驗的要求。本檢測方法采用中華人民共和國國家標準 GB/T 13080.22005 飼料添加劑 蛋氨酸鐵（銅、錳、鋅）螯合物的測定 凝膠過濾色譜法參考文獻 1.G.A.Leach and Richard Patton Analysis techniques for chelated minerals valuated 2.E.Rothenbuehler ctal An improved method for separation of peptides an -amino acids on copper-sephadex.Analytical B