（分析化學(xué)專業(yè)論文）高豐度蛋白質(zhì)的除去及蛋白質(zhì)的多維色譜分離與定量新方法研究.pdf

復(fù)旦大學(xué)博士學(xué)位論文 摘要 2 0 世紀中期以來，隨著d n a 雙螺旋結(jié)構(gòu)的提出和蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)的x 射線解析，開始 了分子生物學(xué)時代，對遺傳信息載體d n a 并q l 生命功能的主要體現(xiàn)者蛋白質(zhì)的研究，成為 生命科學(xué)研究的主要內(nèi)容。9 0 年代中期，在人類基因組計劃( h u m a ng e n o m i c p r o j c c t ) 研究 發(fā)展及功能基因組學(xué)的基礎(chǔ)上，國際上萌發(fā)產(chǎn)生了一門在整體水平上研究細胞內(nèi)蛋白質(zhì) 的組成及其活動規(guī)律的新興學(xué)科一蛋白質(zhì)組學(xué)( p r o t e o m i c s ) ，它以蛋白質(zhì)組( p r o t e o m e ) 為研究對象。蛋白質(zhì)組學(xué)( p r o t c o m i c s ) 已經(jīng)成為功能基因組學(xué)研究的重要領(lǐng)域，其重要性 和戰(zhàn)略意義日益顯著。 蛋白質(zhì)組學(xué)研究主要有兩種路線：第一種是傳統(tǒng)的雙向凝膠電泳( 2 - d e ) 分離技術(shù)。 但是雙向凝膠電泳技術(shù)仍然存在許多不足和一些難以克服的缺陷，比如有限的動態(tài)范圍， 分離樣品中分子量差別較大的蛋白、低拷貝蛋白、疏水蛋白以及極酸極堿蛋白的分辨能 力比較差，而且其操作過程費時費力，自動化程度低。針對這些固有的技術(shù)上的缺陷， 具有快速，高效，自動化程度高等優(yōu)點的液相色譜技術(shù)得到了長足發(fā)展，并成為蛋白質(zhì) 組學(xué)研究的第二條技術(shù)路線。發(fā)展兩維乃至多維色譜分離技術(shù)，提高峰容量和分離能力 是根本上解決復(fù)雜樣品分離問題的方法。從理論上說，只要組合在一起的兩種模式的分 離機理正交，整個二維系統(tǒng)的峰容量是每一維峰容量的乘積，特別適合于復(fù)雜樣品的分 析。在過去的十幾年中，已經(jīng)出現(xiàn)了一些被認為是突破性的進展，j o r g e n s o n ( 多維色譜一 電泳技術(shù)) ，y a t c s ( s h o t g u n 技術(shù)) ，a e b e r s o l d ( 1 c a 臌術(shù)) 等科學(xué)家在蛋白質(zhì)組學(xué)新 方法的研究方面打開了一個嶄新的局面。 目前，蛋白質(zhì)組學(xué)面臨的兩大挑戰(zhàn)是高豐度蛋白質(zhì)壓制低豐度蛋白質(zhì)造成低豐度蛋白 質(zhì)檢測困難以及蛋白質(zhì)的定量問題。s h o t g u n 為代表的b o t t o m - u p 技術(shù)在分離之前將蛋白質(zhì) 樣品進行酶解，一個蛋白質(zhì)酶解成多個肽段，這勢必使原本就很復(fù)雜的樣品變得更加復(fù) 雜，不僅給色譜的分離能力與質(zhì)譜的掃描速度提出挑戰(zhàn)，不利于低豐度蛋白質(zhì)的檢測， 而且將蛋白質(zhì)酶解成肽段的同時又損失了完整蛋白質(zhì)的信息。i c a t 技術(shù)在蛋白質(zhì)的相對 定量方面發(fā)揮了重大作用，然而已有的定量技術(shù)僅局限在相對定量方面。因此，現(xiàn)有的 多維色譜技術(shù)在解決蛋白質(zhì)組學(xué)的兩大問題上存在許多不足，本論文就是圍繞當(dāng)前蛋白 質(zhì)組學(xué)研究中存在的問題開展工作的，建立發(fā)展多維色譜技術(shù)方法達到實現(xiàn)高豐度蛋白 質(zhì)的去除以及完整蛋白質(zhì)的分離鑒定以及定量等目的。 本論文共分五章。主要內(nèi)容摘要如下： 第一章總結(jié)了蛋白質(zhì)組學(xué)的現(xiàn)狀與發(fā)展以及多維色譜與其相關(guān)技術(shù)在蛋白質(zhì)組學(xué)中 復(fù)旦太學(xué)博士學(xué)位論文 的應(yīng)用與進展。介紹了二維多維分離方法的理論依據(jù)，探討了目前蛋白質(zhì)組學(xué)研究使用 的技術(shù)模式的成功與不足。并介紹了本論文選題的目的和意義，著重在于如何利用多維 液相色譜的技術(shù)實現(xiàn)在完整蛋白水平上的分離，去除高豐度蛋白質(zhì)以及利用多維液相色 譜技術(shù)同時實現(xiàn)對蛋白質(zhì)的定性定量等問題。 第二章以鼠肝為研究對象比較了不同的提取環(huán)境對動物組織中蛋白質(zhì)提取的影響。主 要研究了三種提取環(huán)境：酸性、中性和堿性環(huán)境。利用雙向凝膠電泳分離成像技術(shù)比較 了在三種不同環(huán)境下提取的蛋白質(zhì)的分布的差異性，通過實驗證明了在不同的提取環(huán)境 下提取的蛋白質(zhì)在種類和含量上都是不同的，同時也證明了在蛋白質(zhì)組學(xué)的研究中不同 的分離路線或分離模式應(yīng)該根據(jù)具體分離條件的酸堿度的不同選用不同的蛋白提取方 法，以避免在分離的過程中因沉淀問題而損失蛋白質(zhì)，為后續(xù)工作打下基礎(chǔ)。 第三章針對肝臟組織蛋白建立了反相高效液相色譜x 2 向凝膠電泳( r p 輪一d e ) 的 三維分離系統(tǒng)。2 - d e 技術(shù)是比較成熟的蛋白質(zhì)分離手段，但是樣品負載量低是影響中低 豐度蛋白檢測的一個重要原因，同時2 - d e 技術(shù)對于復(fù)雜的蛋白質(zhì)樣品的分離能力是有限 的。r p l c 是生物分析中常用的高效的分離模式，對蛋白或肽等有很好的分離能力，還具 有除鹽純化樣品的能力。r p l c 與2 一d e 的分離機理正交，兩種技術(shù)聯(lián)合使用能在很大程 度上提高樣品的分辨率。本章工作以大鼠的肝臟組織蛋白為研究對象建立了實驗路線并 確立了實驗條件。研究表明，蛋白質(zhì)樣品經(jīng)過r p l c 預(yù)分離之后，不同的蛋白就被富集 濃縮到不同的餾份中，極大的提高了單個餾份中的蛋白在2 - d e 上的上樣量和分辨率，這 一點在凝膠掃描圖上可以直觀的反映出來，同時，實驗證明r p l c 分離蛋白質(zhì)有著很好 的重現(xiàn)性，據(jù)此可以對同一樣品進行平行收集，以達到進一步增大單個餾份中蛋白的上 樣量的目的。因此，將r p l c 作為預(yù)分離手段用于2 - d e 之前對樣品進行預(yù)分離可以提高 蛋白質(zhì)在2 - d e 上的上樣量和分辨率。這條技術(shù)路線已經(jīng)在中國人肝項目表達譜的研究中 得到應(yīng)用。 第四章直接采用多維液相色譜的方法通過多維色譜分離的手段去除生物樣品中的高 豐度蛋白。中心思路就是：首先利用多維色譜技術(shù)對蛋白樣品進行有效分離，在完整蛋 白分離的基礎(chǔ)上，將高豐度蛋白質(zhì)在酶解成更復(fù)雜的肽段之前除掉。這條技術(shù)路線目前 還沒有類似報道。具體路線簡述如下： 發(fā)展了強陽離子交換色譜反相高效液相色譜( s a 礬堙l c ) 分離系統(tǒng)，對鼠肝組織蛋 白進行高效的分離。使用連續(xù)地線性鹽梯度將蛋白質(zhì)從s c x 色譜柱上洗脫下來，得到6 2 個餾份，每個餾份進一步使用常規(guī)的r p l c 進行第二維地分離，整個分離過程使用紫外 信號對蛋白的色譜峰進行監(jiān)測，在第二維的分離過程中將信號強也就是量大的高豐度蛋 復(fù)旦文學(xué)博士學(xué)位論文 白單獨收集，其余中低豐度的蛋白進行合并、濃縮和酶解，然后使用毛細管反相色譜 ( c r p l c ) 進行分離，之后進行質(zhì)譜鑒定，6 2 個餾份分別如法炮制。結(jié)果表明，一次實 驗流程可以去除7 7 個高豐度蛋白，占總蛋白量的3 4 5 ，與不經(jīng)過去除高豐度蛋白的樣 品進行比較，鑒定蛋白的數(shù)量提高了2 到3 倍之多。 在此基礎(chǔ)上，我們進一步簡化實驗路線并提高方法地通量。來自s c x 分離之后的6 2 個餾份經(jīng)過r p l c 進一步分離之后，我們將所有含有中低豐度蛋白的洗脫液合并濃縮到 一起，共同酶解之后使用在線的二維分離系統(tǒng)，即s h o t g u n 技術(shù)對酶解之后的肽段進行 分析鑒定。簡化后的實驗路線對中國人肝樣品進行了分析，5 8 個高豐度蛋白質(zhì)被去除， 共鑒定出1 2 1 3 個蛋白質(zhì)。 總之，這套系統(tǒng)對降低蛋白質(zhì)樣品地復(fù)雜性，避免高豐度蛋白質(zhì)在分離和質(zhì)譜鑒定過 程中壓制中低豐度蛋白提供了一個新的手段和思路。另外，通過多維液相色譜分離的方 法去除高豐度蛋白質(zhì)，相對通常使用的免疫親和的手段，無疑更具有通用性、靈活性、 低成本和周期短的優(yōu)勢。 第五章發(fā)展了多維液相色譜的t o p d o w n 技術(shù)路線，即s c x c r p l c 靶上酶解 m a l d i - t o f - t o f 分離鑒定系統(tǒng)。采用s c x c r p l c 分離系統(tǒng)，實現(xiàn)了在完整蛋白水平上 的兩維分離，本實驗室發(fā)展的新方法靶上酶解技術(shù)的采用將蛋白質(zhì)分離與質(zhì)譜鑒定有效 的結(jié)合起來，從而實現(xiàn)了蛋白從分離、酶解到鑒定這樣一個完整的t o p d o w n 路線。蛋白 質(zhì)樣品經(jīng)過常規(guī)柱s c x 分離之后，得到6 2 個餾份，每個餾份繼續(xù)使用毛細管反相柱 c r p l c 進行第二維分離，c r p l c 作為第二維具有除鹽和純化樣品的作用，為直接酶解提 供了可能，利用自動點樣儀將經(jīng)過c r p l c 的洗脫液直接收集到標準的m a l d i 靶板上， 點樣頻率為3 0 秒，個，經(jīng)過靶上單點酶解之后用m a l d i - t o f - t o f 鑒定。整個系統(tǒng)對中 國人肝蛋白進行了鑒定，共鑒定出3 3 1 3 個唯一蛋白。 與通常采用的s h o t g u n 技術(shù)相比，我們發(fā)展的多維液相色譜的t o p d o w n 技術(shù)路線更 能充分的分離蛋白質(zhì)，得到更多的包括肽譜和疏水性等有關(guān)蛋白質(zhì)的信息。與2 - d e 相比 具有成本低和自動化高等優(yōu)勢。 在此基礎(chǔ)上，我們進一步發(fā)展為三維蛋白分離系統(tǒng)，即s e c s c ) ( r p l c 系統(tǒng)，對肝 臟蛋白進行更為完全的分離，利用紫外可見檢測對蛋白峰進行歸一化處理，迸一步計算 出蛋白的含量，相對應(yīng)的蛋白質(zhì)色譜峰同時進行濃縮、酶解、進而m a l d i - t o f - t o f 檢 測定性分析，以達到對單個蛋白同時進行定性和定量的目的。這條路線已經(jīng)進行了有成 效的探索，得到一些初步的結(jié)果，為蛋白質(zhì)組學(xué)中的定量問題提供了一個可行的有價值 復(fù)旦文學(xué)博士學(xué)位論文 的新思路。 總之，本論文圍繞蛋白質(zhì)組學(xué)的研究熱點，以液相色譜分離系統(tǒng)為基礎(chǔ)，發(fā)展了多種 有效的分離系統(tǒng)，以完整蛋白質(zhì)的分離為指導(dǎo)思想，建立了反相色譜預(yù)分離結(jié)合雙向凝 膠電泳的分離路線；開創(chuàng)了基于多維色譜分離為基礎(chǔ)的高豐度蛋白質(zhì)去除系統(tǒng)；發(fā)展了 多維液相色譜的t o p d o w n 技術(shù)路線，試圖在蛋白質(zhì)研究主流的2 - d e m s 技術(shù)之外，另 辟蹊徑，對蛋白組學(xué)新方法學(xué)的建立進行了有益的探索和研究，而且多數(shù)實驗路線已經(jīng) 在中國人肝項目中投入使用，貢獻了大量的有價值的實驗數(shù)據(jù)。 關(guān)鍵詞：多維液相色譜，雙向凝膠電泳，蛋白質(zhì)組學(xué)，t o p d o w n 技術(shù)，完整蛋白質(zhì) 4 復(fù)旦文學(xué)博士學(xué)位論文 a b s t r a c t s i n c e1 9 5 0 s ，s c i e n t i f i ci n t e r e s th a sb e e ni n c r e a s i n g l ys h i f t i n gt om o l e c u l a rb i o l o g yw i t h t h ea c c o m p l i s h m e n to ft h eg e n es e q u e n c i n go fh u m a ng e n o m ep r o j e c t ( h g p ) p r o t e o m i c sh a s b e e nt h ef o c u sd u et ot h er o l eo fe x e c u t o ro ft h el i f ef u n c t i o n p r o t e o m i c sr e f e r st ot h ea n a l y s i s o fa l lt h ep r o t e i n se x p r e s s e di nac e l lo rt i s s u e t h ei n v e s t i g a t i o no ff u n c t i o n a lp r o t e o m ei so f g r e a ts i g n i f i c a n c eg i v e nt h a tf u n c t i o n so fm o s to fg e n e sa r es t i l ln o tw e l lu n d e m t o o d p r e s e n t l y p r o t e o m i cr e s e a r c hf o c u s e so l ld i f f e r e n t i a lp r o t e o m ea n a l y s i so fh u m a nd i s e a s e s , w h i c h i s d e s i g n e dt of i n dk e yp r o t e i n sw i t hp o t e n t i a l st ob eu s e da sm a r k e r sf o rd i a g n o s i so rt a r g e t sf o r m e d i c a t i o n p r o t e o m i c si sa l s ob e c o m i n gt h es p o t l i g h to fa n a l y t i c a lc h e m i s t r y 2 dp a g ei st h em o s tu n i v e r s a lm e t h o df o rp r o t e o m i c sa n dp o s s e sh i g hr e s o l v ep o w e rf o r p r o t e i n s s o m ep r o b l e m si n2 dp a g e ，h o w e v e r , a r es t i l ld i f f i c u l tt ob eo v e r c o m es u c ha s l i m i t e dp hr a n g e ，t i m e - c o n s u m i n ga n di n e f f i c i e n ts e n s i t i v i t yf o rl o wa b u n d a n tp r o t e i n s t h e r e a l i t yh a sm o t i v a t e dc o n s i d e r a b l ee f f o r ti nd e v e l o p i n gn e wt e c h n i q u et or e s o l v ep r o t e o m i e sa s a l t e r n a t i v ea p p r o a c ht o2 dp a g e l i q u i dc h r o m a t o g r a p h yt e c h n o l o g i e sa r ep o w e r f u lt e c h n o l o g yt or e s o l v ep r o t e i n s b u t c o n v e n t i o n a lo n ed i m e n s i o n a ll cs y s t e m sa r ci n c a p a b l eo fc o m p l e t e l yr e s o l v i n ga l lt h e c o m p o n e n t si nac o m p l e xm i x t u r ed u et oi n s u f f i c i e n tp e a kc a p a c i t y t h ed e v e l o p m e n to f t w o - o rm u l t i - d i m e n s i o n a lc o l u m nb a s e ds e p a r a t i o nt e c h n i q u e sg r e a t l yi m p r o v et h er e s o l v ep o w e r a n dp e a kc a p a c i t y d u r i n gt h ep a s td e c a d e ，al o to fa n a l y s t sc o n t r i b u t e dt ot h i sf i e l d ，s u c ha s j o r g e n s o n s m u l t i - d i m e n s i o n a ls e p a r a t i o n ，y a t e s s h o t - g u nt e c h n i q u e ，a e b e r s o l d s i c a t t e c h n i q u ea n ds oo n t h i sd i s s e r t a t i o ni sd i v i d e di n t o6p a r t s i nt h ef i r s tc h a p t e r ，a d v a n c e si n2 da n dm u l t i d i m e n s i o n a ls e p a r a t i o nt e c h n i q u e sw e r e s u m m a r i z e dw i t hd e t a i l s t h et h e o r yb a s i so fm u l t i d i m e n s i o n a ls e p a r a t i o nt e c h n i q u e sw a s i n t r o d u c e da n dt h ea d v a n t a g e sa n ds h o n c o m i n g so fe x i s t i n gt e c h n i c a lm o d e sw e r ed i s c u s s e d t h ei n t e n t i o na n dm e a n i n go ft h i sd i s s e r t a t i o nw e r ee x p l a i n e d i nc h a p t e r2 ，w eu s e dr a ta sa n i m a lm o d e lt oc o m p a r et h ee f f e c to fd i f f e r e n te x t m c t i o n c o n d i t i o n so nt h ee x t r a c t e dp r o t e i n s t h ee x t r a c tm e t h o d so ft i s s u es a m p l ea ta c i d i c ，n e u t r a la n d b a s i cp hw e r ed e s c r i b e da n dc o m p a r e db yu s i n gt w o d i m e n s i o n a lg e le l e c t r o p h o r e s i sa n d r e v e r s e d - p h a s el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y t h ei m a g e so ng e la n dm a s ss p e c t r as h o w e dt h a tt h e 5 復(fù)旦文學(xué)博士學(xué)位論文 d i f f e r e n tm e t h o dc 孤e n r i c hp r o t e i n sa td i f f e r e n tp hr a n g e d i f f e r e n tp he x t r a c tm e t h o d sc a nb e a p p l i e di n t oc o r r e s p o n d i n gl i q u i dc h r o m a t o g r a p h ym o d ew i t ht h ec o m p a t i b l em o b i l ep h a s es o t h a tt h el o s sa n dp r e c i p i t a t i o nc o u l db ea v o i d e d t h eg o o dr e p r o d u c i b i l i t ye n a b l e st h es a m p l e p r e p a r a t i o nm e t h o d st ob ew i d e l ya p p l i e di np r o t e o m i c sa n a l y s i s i nc h a p t e r3 ，w cd e s c r i b ea na p p r o a c hf o rf r a c t i o n a t i n gc o m p l e xp r o t e i ns a m p l e sf r o mr a t l i v e rp r i o rt o2 - d eu s i n gr p l c t h es t u d yi n d i c a t e dt h a tr p l cp r e f r a c t i o n a t i o nc a np r o v i d e s t r o n ge n r i c h m e n te f f e c tw h i c he n a b l e dn st ov i s u a l i z ea d d i t i o n a la n dl e s sa b u n d a n c ep r o t e i n s c h r o m a t o g r a p h i ce n r i c h m e n tw a sa l s od e m o n s t r a t e db yt h ep e p t i d em a s sf i n g e r p r i n td a t a , w h i c hg a v em a s ss p e c t r aw i t hi n c r e a s e dn u m b e ro fd e t e c t e dp e p t i d ea n di m p r o v e ds i g n a l i n t e n s i t y t h er e p r o d u c i b i l i t yo ft h i sp r e f r a c t i o n a t i o nt e c h n o l o g ya l l o w sp o o l i n go fs e v e r a l c o n s e c u t i v er i m so ft h es a m es a m p l e ，r e s u l t i n gi nah i g h l ye n r i c h m e n to fl o wa b u n d a n c e p r o t e i n s t h i st e c h n o l o g yr o u t eh a sb e e na p p l i e di n t ot h es t u d yo fp r o f i l i n gm o d eo fc h i n e s e h u m a nl i v e rp r o t e o m i c sp r o j e c t ( c h l p p ) i n c h a p t e r4 ，f o rt h e f i r s tt i m ea c o m p r e h e n s i v et w o - d i m e n s i o n a l ( 2 d ) l i q u i d - p h a s e s e p a r a t i o ns y s t e m ，c o u p l i n gs 仃o n gc a t i o ne x c h a n g ec h r o m a t o g r a p h y ( s c x ) t or e v e r s e d p h a s e h i g hp e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y ( r p l c ) ，i n s t e a do fi m m a n o a f f i n i t yc h r o m a t o g r a p h y ， w a sd e v e l o p e da tt h ei n t a c tp r o t e i nl e v e lf o rd e p l e t i o no fh i g ha b u n d a n c ep r o t e i n sf r o mr a tl i v e r t h ec o r ei d e aw a st od e p l e t et h eh i g ha b u n d a n c ep r o t e i n sb e f o r et h ed i g e s t i o n p r o t e i n sb o u n dt ot h es c x p h a s ew e r ee l u t e do f fu s i n gac o n s e c u t i v el i n e a rs a l tg r a d i e n t a f t e rs a l tf r a c t i o n a t i o n ，6 2f r a c t i o n sw e r eo b t a i n e d e v e r yf r a c t i o nw a ss e p a r a t e df u r t h e rb y r p l c u l t a a v i o l e ts i g n a lw a su s e dt od e t e c tt h es e p a r a t i o np r o c e s s t h ep r o t e i np e a k sw i t h s i g n a li n t e n s i t ya b o v e0 1a uw a sd e f i n e da sh i g ha b u n d a n c ep r o t e i n s ，w h e r e a st h eo t h e rw a s d e f i n e da sm i d d l e o rl o wh i 【g ha b u n d a n c ep r o t e i n t h e n ，t h ee f f l u e n t sc o n t a i n e d h i g h a b u n d a n c ep r o t e i n sw e r ec o l l e c t e di n d i v i d u a l l ya n do t h e re f f l u e n t sw e r ep o o l e dt o g e t h e r t h e c o m b i n e dm i d d l e - o rl o wh i r g ha b u n d a n c ep r o t e i n sw e r el y o p h i l i z e d ，d i g e s t e da n ds e p a r a t e db y c a p i l l a r yr e v e r s e dp h a s el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y ( c r p l c ) m a s ss p c c n 蜘e t r yw a su s e dt o a n a l y z et h ep r o t e i n 6 2f r a c t i o n sw e r et r e a t e du s i n gt h es a m em e t h o d t h er e s u l t sw e r et h a t7 7 h i g ha b u n d a n c ep r o t e i n sw e r ed e p l e t e di na ne x p e r i m e n t a lp r o c e s sa n di d e n t i f i e dp r o t e i n s n u m b e rw a si n c r e a s e d2 - 3t i m e s b a s e do nt h er e s u l t s ，as i m p l i f i e dr a p i d s p e e da n dh i g h t h r o u g h p u tp r o t o c o lw a sp u t f o r w a r df u r t h e r i n s t e a do fs e p a r a t i n ge v e r yf r a c t i o nu s i n gc r p l c ，a l le f f l u e n t sc o n t a i n i n g 6 復(fù)旦大學(xué)博士學(xué)位論文 m i d d l e - o rl o wa b u n d a n c ep r o t e i nw e r ec o m b i n e d ，e n r i c h e d ，d i g e s t e da n ds e p a r a t e db yo n l i n e s h o t g u nt e c h n o l o g y t h es i m p l i f i e dm e t h o dw a su s e dt oa n a l y z ec h i n e s el i v e rs a m p l e 5 8h i g l l a b u n d a n c ep r o t e i n sw e r ed e p l e t e da n d1 2 1 3p r o t e i n sw e r ei d e n t i f i e d i ns u m m e r y , t h es y s t e mp r e s e n t e dan o v e li d e aa b o u tt h ed e p l e t i o no fh i 曲a b u n d a n c e p r o t e i n s i nc o n t r a s tw i t ha f f i n i t yt e c h n o l o g y , t h i ss t r a t e g yw i t ht h ea d v a n t a g e so fl o w - c o s ta n d s a v i n g - t i m eh a sn ob i a st oa n yp r o t e i n sa n dc o u l dr e a l i z et h eg l o b a lp r o t e i n sa n a l y s i s i n c h a p t e r5 ，f o rt h e f i r s tt i m e ，t h e2 - ds e p a r a t i o n p l a t f o r mb a s e do nt h el i q u i d c h r o m a t o g r a p h yc o m b i n e dw i t ho n p r o b ed i g e s t i o nt e c h n i q u ea n di d e n t i f i c a t i o no fm a s s s p e c t r o m e t r yw a sc o n s t r u c t e di n i n t a c tp r o t e i n sl e v e lf o rs e p a r a t i o na n di d e n t i f i c a t i o no f c o m p l e xl i v e rt i s s u ep r o t e i n s t h e2 - dl i q u i dc h r o m a t o g r a p h i cs y s t e mw a sc o n s t r u c t e db y c o u p l i n gs c x w i t hc r p l c p r o t e i n sw e r ep r e f r a c t i o n a t e db ys c xa c c o r d i n gt oc h a r g ei nt h e f i r s td i m e n s i o n a ls e p a r a t i o n 6 2f r a c t i o n se l u t i n gf r o mt h ef i r s td i m e n s i o nw e r es u b j e c t e d a u t o m a t i c a l l yt oc r p l ct os e p a r a t es i m i l a r l yc h a r g e dp r o t e i n so nt h eb a s i so ft h e i rv a r i o u s h y d r o p h o b i c i t i e s an o v e lr a p i do n - t a r g e t d i g e s t i o nt e c h n i q u ew a sa d o p t e dt oc o u p l ee f f e c t i v e l y t h es e p a r a t i o nt e c h n i q u ea n dm a s ss p e c t r o m e t r yt e c h n i q u e a f t e rd i g e s t i o n ，t h em a t r i xw a s d e p o s i t e do nt h es a m es p o t ，r e s p e c t i v e l y t h e n ，t h ed r i e dp l a t ew a sa n a l y z e db ym a s s s p e c t r o m e t r y t h i sn e wt e c h n o l o g yc o u p l e dt h et o p d o w na p p r o a c ha n db o s o m - u p t e c h n o l o g i e s t h eh i g he f f i c i e n c yo fs y s t e mw a sd e m o n s t r a t e df o ra n a l y s i so fi n t a c tp r o t e i n s f r o mt h es o l u b l el y s a t e so fn o r m a lh u m a nl i v e r at o t a lo f3 3 1 3p r o t e i n sw e r ei d e n t i f i e d w e 蛐e rd e v e l o p e dt h r e e d i m e n s i o n a l s e p a r a t i o ns y s t e mc o m b i n e ds e cw i t ht h e s c x r p l cm e n t i o n e da b o v e t h i s3 ds y s t e me x h i b i t e dt h ep o t e n t i a lo ff u r t h e rh i g hr e s o l u t i o n f o re x t r e m e l yc o m p l i c a t e dm i x t u r e t h ei n t e n t i o no f3 ds y s t e mw a st or e a l i z et h ei d e n t i f i c a t i o n a n dq u a n t i f i c a t i o no fp r o t e i n s w eh a de x p l o r e ds o m er e l a t i v ee x p e r i m e n t sa n dm a d es o m e e f f e c t i v er e s u i t s i naw o r d ，t h em a i nc o n t r i b u t e so ft h i sd i s s e r t a t i o ni st h ed e v e l o p m e n to fe f f e c t i v e s e p a r a t i o ns y s t e mb a s e dm u l t i - d i m e n s i o n a ls y s t e m w ea i ma te x p l o r i n ga n df i n d i n go u tn e w t e c l m o l c l g i c a ls y s t e m sf o rp r o t e o m i c s ，s ot h a tm o r eb r e a k t h r o u g h sc a nb eo b t a i n e da tt h e q u a l i t a t i v ea n a l y s i sa n dq u a n t i f i c a t i o ns t u d y k e y w o r d ：m u l t i - d i m e n s i o n a ls e p a r a t i o n ，t w o d i m e n s i o n a lg e le l e c t r o p h o r e s i s ，p r o t e o m i c s ， t o p - d o w n ，i n t a c tp r o t e i n 7 。 復(fù)旦太學(xué)博士學(xué)位論文 第一章蛋白質(zhì)組學(xué)現(xiàn)狀與發(fā)展以及多維色譜與其相關(guān)技 術(shù)在蛋白質(zhì)組學(xué)中的應(yīng)用與進展 1 引言 隨著人類基因組計劃的完成，生命科學(xué)研究己進入了后基因組時代1 1 1 。在這個時代， 生命科學(xué)的主要研究對象是功能基因組學(xué)，包括結(jié)構(gòu)基因組研究和蛋白質(zhì)組研究等1 2 】。 盡管現(xiàn)在己有多個物種的基因組被測序，但在這些基因組中通常有一半以上基因的功能 是未知的。目前功能基因組中所采用的策略，如基因芯片、基因表達序列分析( s e r i a l a n a l y s i s o f g e n ee x p r e s s i o n ，s a g e ) 等，都是從細胞中m r n a 的角度來考慮的，其前提是細 胞中m r n a 的水平反映了蛋白質(zhì)表達的水平。但事實并不完全如此從d n a 到蛋白質(zhì)，存 在三個層次的調(diào)控，即轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控( t r a n s c r i p t i o n a lc o n t r 0 1 ) ，翻譯水平調(diào)控( t r a n s l a t i o n a l c o n t r 0 1 ) ，翻譯后水平調(diào)控( p o s t t r a n s l a t i o n a lc o n t r 0 1 ) 。從m r n a 角度考慮，實際上僅包括了 轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控，并不能全面代表蛋白質(zhì)表達水平。實驗也證明，組織中m r n a 豐度與蛋 白質(zhì)豐度的相關(guān)性并不好，尤其對于低豐度蛋白質(zhì)來說，相關(guān)性更差f 3 】。更重要的是， 蛋白質(zhì)復(fù)雜的翻譯后修飾、蛋白質(zhì)的亞細胞定位或遷移、蛋白質(zhì)一蛋白質(zhì)相互作用等幾 乎無法從m r n a 水平來判斷。毋庸置疑，蛋白質(zhì)是生理功能的執(zhí)行者，是生命現(xiàn)象的直 接體現(xiàn)者，對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的研究將直接闡明生命在生理或病理條件下的變化機制。 蛋白質(zhì)本身的存在形式和活動規(guī)律，如翻譯后修飾、蛋白質(zhì)間相互作用以及蛋白質(zhì)構(gòu)象 等問題，仍依賴于直接對蛋白質(zhì)的研究來解決。雖然蛋白質(zhì)的可變性和多樣性等特殊性 質(zhì)導(dǎo)致了蛋白質(zhì)研究技術(shù)遠遠比核酸技術(shù)要復(fù)雜和困難得多，但正是這些特性參與和影 響著整個生命過程。傳統(tǒng)的對單個蛋白質(zhì)進行研究的方式已無法滿足后基因組時代的要 求。這是因為：( 1 ) 生命現(xiàn)象的發(fā)生往往是多因素影響的，必然涉及到多個蛋白質(zhì)。( 2 ) 多個 蛋白質(zhì)的參與是交織成網(wǎng)絡(luò)的，或平行發(fā)生，或呈級聯(lián)因果。( 3 ) 在執(zhí)行生理功能時蛋白 質(zhì)的表現(xiàn)是多樣的、動態(tài)的，并不像基因組那樣基本固定不變【2 4 】。因此要對生命的復(fù) 雜活動有全面和深入的認識，必然要在整體、動態(tài)、網(wǎng)絡(luò)的水平上對蛋白質(zhì)進行研究。 因此，在上世紀9 0 年代中期，國際上產(chǎn)生了一門新興學(xué)科蛋白質(zhì)組學(xué)& r o t e o m i c s ) ， 它以細胞內(nèi)全部蛋白質(zhì)的存在及其活動方式為研究對象【5 】?？梢哉f蛋白質(zhì)組研究的開展 不僅是生命科學(xué)研究進入后基因組時代的里程碑，也是后基因組時代生命科學(xué)研究的核 心內(nèi)容之一。 蛋白質(zhì)組( p r o t e o m e ) - - 詞是澳大利i i p m a c q u a r i e 大學(xué)的w i l k i n s 和w i l l i a m s 在1 9 9 4 年首次 8 。 復(fù)旦文學(xué)博士學(xué)位論文 提出，最早見諸于文獻是在1 9 9 5 年7 月的( ( e l e c t r o p h o r e s i s ) ) 雜志上6 7 1 。它是指一個有機 體的全部蛋白質(zhì)組成及其活動方式。他們認為，生命科學(xué)的重點將要轉(zhuǎn)移到在蛋白質(zhì)組 水平上揭示生命的活動規(guī)律。1 9 9 7 年舉行了第一次國際性的“蛋白質(zhì)組學(xué)”會議，并于同 年出版了第一部蛋白質(zhì)組學(xué)的專著?，F(xiàn)已不但開展了大腸桿菌、酵母等低等生物的蛋白 質(zhì)圖譜，而且也有進行人類細胞的蛋白質(zhì)圖譜研究報道，并均已著手建立蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù) 庫。目前，澳大利亞、歐洲、日本和美國等已紛紛成立了有關(guān)的研究機構(gòu)和公司，美國 各主要大學(xué)和藥廠，均迅速啟動了蛋白質(zhì)組學(xué)研究。值得注意的是，公司和藥廠等出于 篩選新藥等應(yīng)用前景的考慮，已經(jīng)開始進行環(huán)境變化、病毒感染、藥物應(yīng)用等對細胞作 用的研究。這充分顯示出，在蛋白質(zhì)組學(xué)這個研究領(lǐng)域，基礎(chǔ)研究與實際應(yīng)用研究幾乎 呈并駕齊驅(qū)的趨勢。可以這樣認為，蛋白質(zhì)組學(xué)是研究細胞內(nèi)所有蛋白質(zhì)及其動態(tài)變化 規(guī)律的科學(xué)，它是從更為深入的一個層次上去認識生命活動的規(guī)律。自1 9 9 5 年蛋白質(zhì)組 概念的提出到現(xiàn)在，雖然只有短短的十一年時間，蛋白質(zhì)組學(xué)研究卻已經(jīng)得到了突飛猛 進的發(fā)展。在目前功能基因尚不很清楚的情況下