（微生物與生化藥學專業(yè)論文）大腸桿菌對有機溶劑的耐受性研究.pdf

天津科技大學 學位論文原創(chuàng)性聲明 本人鄭重聲明：所呈交的論文是本人在導師的指導下獨立進行研究所取得的 研究成果。除了文中特別加以標注引用的內(nèi)容外，本論文不包括任何其他個人或 集體已經(jīng)發(fā)表或撰寫的成果內(nèi)容。對本文的研究做出重要貢獻的個人和集體，均 已在文中以明確方式標明。本人完全意識到本聲明的法律后果由本人承擔。 、? 作者簽名：土 j 圩、 日期：加暑年弓月；f 日 專利權聲明 本人鄭重聲明：所呈交的論文涉及的創(chuàng)造性發(fā)明的專利權及使用權完全歸天 津科技大學所有。本人完全意識到本聲明的法律后果由本人承擔。 -1r 作者簽名：土沖。圩 日期：z n 睜弓月日 學位論文版權使用授權書 本學位論文作者完全了解學校有關保留、使用學位論文的規(guī)定，同意學校保 留并向國家有關部門或機構送交論文的復印件和電子版，允許論文被查閱和借 閱。本人授權天津科技大學可以將本學位論文的全部或部分內(nèi)容編入有關數(shù)據(jù)庫 進行檢索，可以采用影印、縮印或掃描等復制手段保存和匯編本學位論文。 保密口( 請在方框內(nèi)打“ ， ) ，在年解密后適用本授權書。 本學位論文屬于 不保密彳( 請在方框內(nèi)打“ ) 。 作者簽名：王辛廳、 導師簽名：壬及 - - - r _ 一 日期：伽留年；月f 日 日期：力呀年歲月；je l 摘要 在有機溶劑水兩相體系生物轉(zhuǎn)化技術應用中，有機溶劑對細胞的毒害是其中的 重要障礙。研究有機溶劑對細胞的毒害及微生物對有機溶劑的耐受機制，對改造、選 育耐有機溶劑的菌株，增強在生物轉(zhuǎn)化中的應用有著重大意義。本文以大腸桿菌 ( e s c h e r i c h i ac o l i ) k 1 2 為模式菌株，研究了在有機溶劑水兩相系統(tǒng)中，有機溶劑甲 苯、四氯化碳、正己烷、鄰苯二甲酸二乙酯對e c o l ik 1 2 生長和e c o l ik 1 2 細胞膜的 影響，初步探討了e c o l ik 1 2 對有機溶劑的耐受機制。 通過研究甲苯、四氯化碳、正己烷、鄰苯二甲酸二乙酯對e c o l ik 1 2 生長的影響 可以得到以下結果： e c o l ik 1 2 對四種l o g p 值不同的有機溶劑的耐性不同：對正己烷耐性較強，依 次是鄰苯二甲酸二乙酯、四氯化碳，對甲苯的耐受性最弱。 大腸桿菌對不同濃度的有機溶劑耐受性不同：在1 5 、1 0 9 6 、0 3 ( v v ) 的甲 苯、四氯化碳、正己烷、鄰苯二甲酸二乙酯存在下，可以看到明顯的o d 值變化的差 異。 在0 3 的甲苯、四氯化碳等溶劑存在下，大腸桿菌存活率隨作用時間延長而降 低，甲苯尤其明顯。在添加0 3 的甲苯3 0 m i n 后，大腸桿菌的存活率僅為2 4 8 。 采用羅丹明1 2 3 ( r h l 2 3 ) 、二乙酸熒光素( f i ) a ) 熒光法測定在o 3 的甲苯、四 氯化碳等有機溶劑存在下，大腸桿菌細胞膜電位、細胞膜通透性的變化。結果發(fā)現(xiàn)在 添加0 3 的四氯化碳3 0 r a i n 后，r h l 2 3 和f d a 熒光強度下降了1 6 3 、3 4 5 ，即相 當于膜電位下降了1 6 3 ，膜滲透性增加了3 4 5 。當培養(yǎng)液中添加0 3 的甲苯時， f d a 熒光強度下降6 5 9 ；表明細胞膜完整性受到嚴重破壞。 用氣相色譜法研究了大腸桿菌細胞膜脂肪酸組成的變化，發(fā)現(xiàn)在鄰苯二甲酸二乙 酯、四氯化碳存在的情況下，細胞膜脂肪酸組成中飽和脂肪酸的含量增加。盡管甲苯 對大腸桿菌的抑制作用最強，但甲苯對膜脂肪酸組成影響卻不明顯。脂肪酸飽和度的 增加改變了細胞膜的流動性，增強了對有機溶劑的耐受性。 關鍵詞：大腸桿菌；有機溶劑：細胞膜：脂肪酸：有機溶劑耐受性 a bs t r a c t t h et o x i ce f f e c t so fo r g a n i cs o l v e n t so nw h o l ec e l l sa r eas e r i o u sd r a w b a c kf o rt h e a p p l i c a t i o no ft h e s ec e l l si n at w o - l i q u i dp h a s eb i o r e a c t o r i nt h i sr e s e a r c h ，t h eo r g a n i c s o l v e n tt o l e r a n c eo fe s c h e r i c h i ac o l ik 1 2i nat w o - p h a s es y s t e mh a db e e ns t u d i e d e l e m e n t a r i l y t h er e s u l t so b t a i n e dw i l lb eu s e f u la sar e f e r e n c ef o rf u t u r es t u d i e so r g a n i c s o l v e n tt o l e r a n tm e c h a n i s mo f e c o i l s e v e r a lo r g a n i cs o l v e n t s ，s u c ha sn - h e x a n e ，d i r t h y lp h t h a l a t e ，c a r b o mt e t r a c h l o r i d ea n d t o l u e n e ，w h i c hm a y b eh a v ee f f e c to nt h ee c o l ik 1 2a r ed i s c u s s e dw i t ht h et u r b i d i t ya t6 6 0 b i n ( o d 6 面，c e l ls u r v i v a lr a t e sa n dt h ea l t e r a t i o n so fc e l ls h a p ea st a r g e t t h er e s u l t sa r e s u m m a r i z e di nt h r e ea s p e c t sa sf o l l o w s ： 田塢o r g a n i cs o l v e n tt o l e r a n c eo fe c o l ik 1 2i sd i f f e r e n tf o rt h e s eo r g a n i cs o l v e n t s e c o l ik 1 2s t r a i nc a nt o l e r a t en - h e x a n e ，l o wc o n c e n t r a t i o n so fd i r t h y lp h t h a l a t ea n dc a r b o m t e t r a c h l o r i d e ，r e s p e c t i v e l y t h eg r o w t hi n h i b i t i o nc a u s e db yt o l u e n ew a sv e r yo b v i o u s t h es u p p l e m e n t a r yc o n c e n t r a t i o no fo r g a n i cs o l v e n ti sa ni m p o r t a n ti n f l u e n c i n g f a c t o rf o re c o l ik 1 2 e c o l ik 1 2d i d n tg r o wi nt h ep r e s e n c eo f0 3 ( v v ) t o l u e n e t h e s u p p l e m e n t a r yc o n c e n t r a t i o n so fd i r t h y lp h t h a l a t ea n dc a r b o mt e t r a c h i o f i d ef o rr e s t r a i n i n g e c o l ik 1 2g r o w t hw c 他1 5 a n d1 0 ( v v ) ，r e s p e c t i v e l y ( 耖r o l u e n ei sh i g h l yt o x i cf o re c o l ik 1 2 t h ec e l ls u r v i v a lr a t e sw a s2 4 8 w i t h i n3 0 m i nw h e ne c o l ik 1 2g r o w ni nl bs u p p l e m e n t e dw i t h0 3 ( v v ) t o l u e n e t h ec e l lm e m b r a n ep o t e n t i a la n dp e r m e a b i l i t yw e r ee x a m i n e db ym e a s u r i n gt h e f l u o r e s c e n c ei n t e n s i t yo fc e l l sl a b e l e db yf l u o r e s c e i nd i a c e t a t e ( f d a ) a n dr h o d a m i n e 1 2 3 ( r h l 2 3 ) u s i n gt h ef l u o r e s c e n c es p e c t r o p h o t o m e t e r w h e nt h ec e l l sw e r et r e a t e dw i t h c a r b o nt e t r a c h l o f i d ef o r3 0m i n r h l 2 3a n df d ad e c r e a s e db y1 6 3 a n d3 4 5 ，i t i n d i c a t e dt h a tc e l lm e m b r a n ep o t e n t i a ld e c r e a s e d eb y1 6 3 a n dm e m b r a n ep e r m e a b i l i t y i n c r e a s e db y3 4 5 t h ed e g r e s s i v ee x t e n to ff d ar e l a t i v ef l u o r e s c e n c ei n t e n s i t yw a s m a x i m a la n dd e s c e n d e d6 5 9 i nt h ep r e s e n c eo ft o l u e n ea f t e r3 0m i ni n c u b a t i o n f a t t ya c i dc o m p o s i t i o nw a sa n a l y z e du s i n gg a sc h r o m a t o g r a p h y c o m p a r e dw i t hn o s o l v e n t , t h es y n t h e s i so fl i p i d sc o n t a i n i n gs a t u r a t e df a t t ya c i d si nt h ep r e s e n c eo fd i r t h y l p h t h a l a t ea n dc a r b o mt e t m c h i o f i d eh a da ni n c r e a s e d e s p i t et h et o x i cp o t e n c yo ft o l u e n ea s ag r o w t hi n h i b i t o rf o re c o l ik 1 2 ，l i t t l ec h a n g e si nf a t t ya c i dc o m p o s i t i o nw e r eo b s e r v e d w h e ne c o l ik 1 2g r o w nw i t ht o l u e n e a l t e r a t i o n si nt h es a t u r a t i o nd e g r e eo ff a t t ya c i d s c h a n g e dt h ef l u i d i t yo fc e l lm e m b r a n e sa n dp r o v i d e de c o l ik 1 2w i t hap e r m e a t i o nb a r r i e r t oh y d r o p h o b i cc o m p o u n d sa n di nt h i sw a yc o m p e n s a t ef o rt h ee f f e c t sc a u s e db ys o l v e n t s k e yw o r d s ：o r g a n i cs o l v e n t s ，c e l lm e m b r a n e ，e s c h e r i c h i ac o l i ，f a t t ya c i d ，o r g a n i cs o l v e n t t o l e r a n c e 目錄 1 前言m ”1 1 1 生物轉(zhuǎn)化概述m 1 1 1 1 生物轉(zhuǎn)化的概念”1 1 1 2 微生物生物轉(zhuǎn)化m 1 1 1 3 生物轉(zhuǎn)化在藥物合成中的應用m 1 1 1 4 生物轉(zhuǎn)化中的新技術、新領域2 1 2 有機介質(zhì)中完整細胞生物轉(zhuǎn)化“3 1 2 1 完整細胞生物轉(zhuǎn)化的形式3 1 2 2 有機相催化的優(yōu)勢和缺點4 1 2 3 有機溶劑的選擇4 1 3 有機溶劑對微生物的影響5 1 3 1 有機溶劑對細胞毒害機理的研究”5 1 3 2 細胞對有機溶劑耐受機理的研究及進展6 1 4 大腸桿菌對有機溶劑耐受性研究進展8 1 5 立題背景8 1 6 主要研究內(nèi)容及思路9 2 材料與方法1 0 2 1 材料 2 1 1 菌株 2 1 2 培養(yǎng)基1 0 2 1 3 相關溶液 2 1 4 主要藥品m 1 0 2 1 5 主要儀器m 1 1 2 2 實驗方法m 1 1 2 2 1g c o k 1 2 的培養(yǎng) 2 2 2 有機溶劑添加時間對菌體生長的影響1 2 2 2 3 采用單染色法觀察有機溶劑對大腸桿菌形態(tài)的影響1 2 2 2 4 采用活菌計數(shù)法考查有機溶劑對大腸桿菌存活率的影響1 2 2 2 5 脂肪酸的提取m “1 2 2 2 6 分析方法m m m 1 3 3 結果與討論? 1 6 3 1 有機溶劑對e c o l ik 1 2 生長的影響m 1 6 3 1 1e c o l ik 1 2 的生長特性 3 1 2e c o l ik 1 2 的菌體形態(tài)1 6 3 1 3 有機溶劑對e c o k 1 2 生長的影響1 8 3 1 4 有機溶劑對王c o k 1 2 存活率的影響 3 1 5 有機溶劑對e c o k 1 2 菌體形態(tài)的影響2 l 3 1 6 有機溶劑對e c o k 1 2 代謝活性的影響 3 1 7 金屬陽離子與e c o k 1 2 的有機耐受性2 4 3 1 8 小結2 5 3 2 有機溶劑對e c o l ik 1 2 細胞膜的影響” 3 2 1 有機溶劑對e c o l ik 1 2 細胞膜電位的影響2 6 3 2 2 有機溶劑對e c o l ik 1 2 細胞膜通透性的影響“ 3 2 3d 、結2 7 3 - 3 有機溶劑對e c o l ik 1 2 細胞膜脂肪酸組成的影響 3 3 1 正己烷對e c o l ik 1 2 細胞膜脂肪酸組成的影響2 8 3 3 2 鄰苯二甲酸二乙酯對e c o l ik 1 2 細胞膜脂肪酸組成的影響3 1 3 3 3 四氯化碳對e c o l ik 1 2 細胞膜脂肪酸組成的影響3 3 3 3 4 甲苯對e c o l ik 1 2 細胞膜脂肪酸組成的影響3 5 3 3 5 小結”3 6 4 結論” 5 展望3 9 6 參考文獻o “4 0 7 攻讀碩士學位期間發(fā)表論文情況4 8 8 致謝- - - - - - - - - - - 4 9 n 5 0 1前言 1 1 生物轉(zhuǎn)化概述 1 1 1 生物轉(zhuǎn)化的概念 生物轉(zhuǎn)化( 亦稱為生物催化，b i o t r a n s f o r m a t i o n ，b i o c o n v e r s i o n , b i o c a t a l y s i s 等) ，指 利用酶或有機體( 細胞、細胞器) 作為催化劑實現(xiàn)化學轉(zhuǎn)化的過程，是生物體系( 包括 細菌、真菌、植物組織、動物組織培養(yǎng)系或生物體系的酶制劑) 對外源性底物進行結 構性修飾所發(fā)生的化學反應。其實質(zhì)是利用生物體系本身所產(chǎn)生的酶對外源化合物進 行酶催化反應。催化反應類型幾乎包括所有的體外有機化學反應，如：羥基化、氧化、 脫氫、氫化、還原、水解、水合、酯化、酯轉(zhuǎn)移、脫水、脫羧、酰化、胺化、異構化 和芳構化等。生物轉(zhuǎn)化大多是在室溫或中性環(huán)境中進行，具有無毒、無污染、低能耗、 高效率、高選擇性等優(yōu)點。生物轉(zhuǎn)化還可以合成化學上難以合成的物質(zhì)，特別是復雜 的天然活性物質(zhì)。 1 1 2 微生物生物轉(zhuǎn)化 生物轉(zhuǎn)化包括微生物生物轉(zhuǎn)化、植物培養(yǎng)物生物轉(zhuǎn)化等，研究、應用較多的是微 生物轉(zhuǎn)化。微生物生物轉(zhuǎn)化法是利用微生物中特定的酶將人工合成的非天然化合物進 行生物轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化液經(jīng)分離純化可得所需產(chǎn)品的過程。微生物在生物催化的手性合成 中有著重要的用途，它能提供廉價和多樣的生物催化劑酶，或以完整細胞直接進 行生物催化，后者又稱為微生物生物轉(zhuǎn)化。微生物可產(chǎn)生多種酶，能催化多種非天然 有機物發(fā)生轉(zhuǎn)化反應，有些反應是化學法難以或不可能完成的化學反應。微生物生物 轉(zhuǎn)化法的優(yōu)點是不需要酶的分離純化和輔酶再生，缺點是副產(chǎn)物可能較多，產(chǎn)物的分 離純化比較麻煩。微生物生物轉(zhuǎn)化法已在一些有機酸、氨基酸、核苷酸、抗生素、維 生素和甾體激素等方面實現(xiàn)了工業(yè)化生產(chǎn)。 1 1 3 生物轉(zhuǎn)化在藥物合成中的應用 1 1 3 1 手性藥物的合成n 1 手性藥物是指只含單一對映體的藥物。手性是自然界的本質(zhì)屬性之一，作為生命 活動重要基礎的生物大分子，如核酸、蛋白質(zhì)、多糖等分別由具有手性的d - d n a 、 l - 氨基酸、d - 單糖構成，載體、酶、受體等也都具有手性，它們一起構成了人體內(nèi)高 度復雜的手性環(huán)境。藥物在進入體內(nèi)后，其藥理作用是通過與體內(nèi)這些靶分子之間的 嚴格手性匹配和分子識別能力而實現(xiàn)的。立體結構相匹配的藥物通過與體內(nèi)酶、核酸 等大分子中固有的結合位點產(chǎn)生誘導契合，從而抑制( 或激活) 該大分子的生理活性， 達到治療的目的。目前手性藥物的生產(chǎn)主要分為化學法和生物學法。化學方法手性拆 分難度大，試劑昂貴，且造成資源浪費和環(huán)境污染，不利于工業(yè)化生產(chǎn)；生物轉(zhuǎn)化法 較化學合成具有明顯優(yōu)勢。生物轉(zhuǎn)化實質(zhì)是酶促反應，酶促反應具有化學選擇性、區(qū) 域選擇性和對映體選擇性，利用酶的這些性質(zhì)可以合成手性藥物。合成手性藥物的生 1 前言 物轉(zhuǎn)化反應大致可分為兩類：一類是把外消旋體拆分為兩個光活性的對映體；另一類 是從外消旋體或前手性的前體出發(fā)，通過催化反應得到不對稱的光學活性產(chǎn)物。 1 1 3 2 天然藥物的合成 天然藥物一般是指來源于植物、動物、微生物、海洋生物、礦物的藥物。植物藥 是天然藥物的主要組成部分。我國天然藥物的生產(chǎn)主要是從天然原料中提取或化學方 法合成，這樣就會導致原始資源存量減少、破壞生態(tài)環(huán)境，而且提取和化學合成的程 序繁瑣、效率低、成本高。而采用生物轉(zhuǎn)化的方法則可以克服這些弊端。與傳統(tǒng)方法 相比，生物轉(zhuǎn)化有以下幾個優(yōu)勢叨： ( 1 ) 生物轉(zhuǎn)化可以為急需開發(fā)針對特定有效成分或組分的天然藥物的生產(chǎn)技術提 供一條便捷途徑，替代傳統(tǒng)提取的方法。 ( 2 ) 就天然資源來講，某種植物中不可能僅含有一種活性成分，往往有一些生源 關系相近或結構類似的化合物。單純依靠從天然資源中提取分離費時、費力、浪費資 源。因此，可以以生物轉(zhuǎn)化為途徑，尋找合適的反應器，以期獲得具有更好生理活性 的化合物。 ( 3 ) 生物轉(zhuǎn)化屬于綠色化學，能耗低，污染少，保護環(huán)境，符合可持續(xù)發(fā)展的要 求。 1 1 4 生物轉(zhuǎn)化中的新技術、新領域 i i 4 1 雙水相系統(tǒng) 雙水相生物轉(zhuǎn)化技術主要應用于不溶底物的轉(zhuǎn)化或是有產(chǎn)物抑制的反應，因為它 可以將細胞限于一相而產(chǎn)物迅速萃取到另一相中，這樣可以減少產(chǎn)物抑制或者縮短產(chǎn) 物在細胞附近的停留時間來阻止產(chǎn)物的降解，即使產(chǎn)物是高毒性或高度不穩(wěn)定的，雙 水相系統(tǒng)中的反應也是專一的，而且還可以使細胞回收，實現(xiàn)連續(xù)發(fā)酵，這將有可能 擴大到工業(yè)化水平。 1 1 4 2 分子定向進化技術 分子定向進化技術又稱分子進化法、體外進化法和直接進化法。與自然進化不同 的是，定向進化技術是在人為引發(fā)條件下發(fā)生，并通過選擇突變后的突變種群來保留 某一方向的進化而排除其他方向突變，整個進化過程完全是被事先定向的。酶的定向 進化是對酶進行修飾的最新方法，它不僅能使酶演化出非天然特性，還能定向進化某 一代謝途徑，而且可以改善酶的穩(wěn)定性、底物特異性、對映體選擇性等，并在抗體庫、 d n a 結合位點定向進化、抗輻射性等方面也有廣泛的應用，極大地拓展了蛋白質(zhì)工 程學的研究范圍，為指導應用( 如藥物設計等) 奠定了理論基礎。分子定向進化技術已 被用于上百個酶的進化。如枯草桿菌蛋白酶e 在有機溶液中( 6 0 9 6 d 眥) 的活性提高了 1 7 0 倍；b 一內(nèi)酰胺酶的耐抗菌素c e f o - - - t a x i m c 濃度提高了3 2 0 0 0 倍啷。 i i 4 3 酶和細胞的固定化技術 酶和細胞的固定化技術是指利用化學或物理的手段將游離的細胞或酶定位在有 天津科技大學碩士學位論文 限的空間中并保持其活性的一種手段。在生物轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的反應中，要求催化劑不但要 穩(wěn)定而且能夠重復使用，實現(xiàn)連續(xù)性操作。應用固定化技術不但可以滿足這一要求， 而且可以提高催化劑的穩(wěn)定性、有利于簡化操作和產(chǎn)物的分離。在采用非水相介質(zhì)的 生物轉(zhuǎn)化中，可以利用酶和細胞的固定化，使生物催化劑在有機溶劑中發(fā)揮更高的催 化效率，并且使有機溶劑引起的酶變性抗性顯著增強。l l a n e s 等h 1 研究了硅藻土固 定化分枝桿菌( m y c o b a c t e r i u ms p ) n r r l b - 3 8 0 5 細胞對谷甾醇的側(cè)鏈降解，考察了 不同的硅藻土材料和顆粒大小對轉(zhuǎn)化率的影響。姜忠義喳1 等對催化劑的膜固定化技術 進行了研究。 除以上技術外，有機溶劑水兩液相體系以及濁點系統(tǒng)在生物轉(zhuǎn)化中的應用、基 因工程菌構建技術、超臨界流體技術、抗體酶、反膠束酶、交聯(lián)酶晶體等新技術和方 法的發(fā)展及完善，都大大推動了生物轉(zhuǎn)化的研究和應用。尤其是非水相生物轉(zhuǎn)化，目 前已成為人們研究的最大熱點。 1 2 有機介質(zhì)中的完整細胞生物轉(zhuǎn)化 在非水相生物轉(zhuǎn)化和涉及有機溶劑的環(huán)境生物技術中，許多過程都與有機溶劑和 細胞或酶的相互作用有關。在完整細胞生物轉(zhuǎn)化過程中，有機溶劑對細胞的毒性則成 為有機相催化的重大障礙。1 9 8 4 年，z a k s 等阻1 報道了脂酶在有機相中的活性。1 9 8 9 年，a l i mi n o u e 等忉發(fā)現(xiàn)了一株可以在高濃度的甲苯存在下存活的假單胞茵 ( p s e u d o m o n a sp u t i 脅) ，這兩個發(fā)現(xiàn)改變了細胞和酶在有機介質(zhì)中不能存活和保持活 力的觀點，從而引起了人們對有機溶劑毒害機理和細胞溶劑耐受性研究的關注。 眾多研究方法和技術的出現(xiàn)及應用，極大推動了生物催化的研究和應用，尤其是 非水相生物催化，已成為目前本研究領域的熱點研究方向之一。 利用完整細胞進行生物轉(zhuǎn)化，利于解決輔酶再生的問題。在完整細胞中，不僅各 種酶比較豐富，并且有完備的輔助因子再生系統(tǒng)，實際上，完整細胞本身就是有別于 酶的生物催化劑。 1 2 1 完整細胞生物轉(zhuǎn)化的形式 利用完整細胞進行生物轉(zhuǎn)化，其形式可以分為幾種： ( 1 ) 利用培養(yǎng)中的細胞。將底物加入到培養(yǎng)到一定時期的細胞培養(yǎng)液中，采用 單批次或流加的方式進行反應。 ( 2 ) 利用休眠細胞。把培養(yǎng)到一定時期酶活最高時的細胞處理為休眠態(tài)，細胞 不生長，但具有生長活性，細胞內(nèi)部的大部分酶都保持了較高的活性。與生長細胞相 比，它們可以懸浮在各種溶劑包括有機溶劑中進行催化反應。這種方式在保持高催化 活性的同時，產(chǎn)物更易分離，可以避免其他代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生，達到很高的細胞濃度。 ( 3 ) 利用干細胞。一定條件下，微生物細胞干燥脫水后，仍可保留酶的活性和 生長活性，脂酶、酸胺酶、氧化還原酶、蛋白酶和脫氫酶等都能經(jīng)受細胞干燥脫水過 程。常用的制備方法是冷凍干燥法和丙酮干粉法。利用干細胞，制備簡單，可以確保 1 前言 實驗的重復性，另外在操作時，不需要無菌操作哺1 。 1 2 2 有機相催化的優(yōu)勢和缺點 有機溶劑體系可以分為三類叫：t k 有機溶劑( 可溶于水) ，雙相系統(tǒng)，單一有機溶 劑體系。g e r a r das e l l e k 和j u l i a nbc h a u d h u d n 帕將其細劃分為四類，并對每一種溶劑 體系進行了詳細的闡述，即( 1 ) 含有小于2 0 ( 體積比) 有機溶劑的水溶液，( 2 ) 含有大 于2 0 ( 體積比) 有機溶劑的水溶液，( 3 ) 雙相系統(tǒng)，水有機溶劑、有機溶劑水和水 有機溶劑水，( 4 ) 單一有機溶劑體系。嚴格講，利用不含水的有機溶劑體系才稱為有 機溶劑介質(zhì)。 利用有機溶劑作為反應介質(zhì)，除了能很好的解決底物的不溶性問題外，還有一些 催化上的其他優(yōu)點，但不可否認，也存在一些缺點，其優(yōu)缺點分述如下n 1 1 習： 利用有機溶劑作為反應介質(zhì)的優(yōu)點：( 1 ) 提高反應物質(zhì)的溶解性；( 2 ) 影響反應的 選擇性( 底物選擇性、區(qū)域選擇性、立體選擇性) ；( 3 ) 降低水活度( 改變水解平衡) ； ( 4 ) 減少在水相中可能發(fā)生的副反應；( 5 ) 有利于產(chǎn)物的分離，提高得率；( 6 ) 非極性 溶劑中增強酶的穩(wěn)定性。 利用有機溶劑作為反應介質(zhì)的缺點：( 1 ) 對生物催化劑有毒性，降低活性；( 2 ) 要 求與傳統(tǒng)催化的不同裝置；( 3 ) 需要控制水活度；( 4 ) 增加了反應系統(tǒng)的復雜性。 1 2 3 有機溶劑的選擇 兩液相培養(yǎng)中，關鍵是確定合適的有機溶劑。其最重要的要求有兩點，一是對細 胞不產(chǎn)生毒性且不影響細胞的生長；二是對代謝產(chǎn)物有較大的萃取能力，以發(fā)揮有機 溶劑的作用，減少有機溶劑在反應器中所占的體積。實際上高分配系數(shù)和好的生物相 容性往往不可兼得。 有機溶劑對微生物活性的影響( 稱為抗菌性) 一般采用l 0 9 p ( 溶劑在辛醇和水 的混合物中的分配系數(shù)的對數(shù)) 來表示n 羽，一般l 0 9 p 值大于4 的有機溶劑對生物催 化劑活性無影響，因此是生物相容的；l o g l 值小于2 的有機溶劑對生物催化劑活性 影響很大，因此是生物非相容的；而l 0 9 p 值介于2 至4 之間的有機溶劑對生物催化 劑活性影響適中，可能是生物相容的，也可能是非生物相容的。l 0 9 p 值和有機溶劑 在微生物細胞膜的緩沖系統(tǒng)之間有一定的相關性，許多研究成果已經(jīng)證實有機溶劑在 細胞膜內(nèi)的積累是造成溶劑對微生物毒害作用的主要原因，有機溶劑溶解在膜內(nèi)會破 壞膜的完整性，影響膜作為屏障和能量轉(zhuǎn)換的功能n 蛔 用i j d g p 值來反映有機溶劑與生物相容性的關系己被大家廣泛接受。嚴格講，該 參數(shù)反映的是溶劑的疏水性，并不等于極性。但實際的研究表明，生物活性保持和 l o g p 值之間有一定的關系：l o g p 4 的溶劑，一般都適合作 為生物催化的介質(zhì)。c o l j ai a a n e 等n 叼詳細敘述了各種溶劑l 0 9 p 值的計算方法，并探 討了一些機理。實際上可以這樣理解，細胞在有機溶劑中實際是處于一種微水環(huán)境狀 天津科技大學碩士學位論文 態(tài)，這種環(huán)境確保了該細胞基本活性或某些方面的活性，l 0 9 p 值越小，疏水性越差， 相反親水性就越強，而過強的親水性會將細胞的微水環(huán)境破壞，從而使細胞失活。 深入研究有機溶劑選擇規(guī)律，確定細胞兩液相培養(yǎng)合適的有機溶劑，一般認為n 刀： 一是根據(jù)有機溶劑的l 0 9 p 值初步確定一定數(shù)量的不同有機溶劑；二是在這些有機溶 劑中，測定代謝產(chǎn)物在有機溶劑和培養(yǎng)液中的分配系數(shù)，去掉分配系數(shù)小的有機溶劑； 三是研究在細胞兩液相培養(yǎng)過程中，留下的不同有機溶劑對細胞生長和催化的影響。 因此要確定細胞兩液相培養(yǎng)合適的有機溶劑是研究中難度很大的一項工作，所以有必 要根據(jù)細胞的生理生化特性和有機溶劑特性，對有機溶劑選擇規(guī)律作深入的研究，探 索更簡便、針對性更強的選擇方法。 1 3 有機溶劑對微生物的影響 1 3 1 有機溶劑對細胞毒害機理的研究 許多有機溶劑對細胞有毒害作用n 蝴1 ，這也是應用微生物轉(zhuǎn)化的一個重要障礙。 但有機溶劑對細胞毒害機理的研究還非常少，還不是非常透徹，廣泛接受的觀點是溶 劑對膜脂的作用，會引起細胞膜通透性的增加，使細胞膜的基本功能喪失，膜蛋白酶 失活，質(zhì)子梯度破壞，運輸系統(tǒng)崩潰，或者高濃度時直接使細胞裂解，從而將細胞殺 死。普遍認為，溶劑在膜中的積累直接導致了對膜的破壞，導致生理功能的喪失。一 旦溶劑溶解于細胞膜中，就會破壞膜的完整性。目前，還沒有一種單一的技術可以非 常清楚的監(jiān)測溶劑對膜結構的影響 從溶劑的深層次毒害機理來看，它在細胞膜中的濃度基本決定了毒性的大小。 h e i p i e p e r l 2 l 】等認為，膜中的實際濃度是引起細胞毒性的重要參數(shù)，i s k e n 等啪1 人的研 究證實，甲苯、乙苯、環(huán)己胺的存在引起假單胞菌( p s e u d o m o n a s p u t i d a ) s 1 2 生物量 降低的程度依賴于它們在膜中的實際濃度，而和它們的結構不相關。對于某些有機溶 劑，是由它們的化學特性所決定的，一般來說疏水性的有機溶劑對微生物細胞毒性較 大，這往往與該溶劑的物理化學特征如分子表面積、分子量、極性等有關嘲。另外， 有機溶劑在膜中的濃度在一定程度上和其l d g p 值密切相關，也就是說，可以用這一 參數(shù)來表征有機溶劑對細胞的毒性。 1 3 1 1 有機溶劑種類對細胞毒性的影響 在兩液相培養(yǎng)的微生物發(fā)酵中，許多研究者探索了有機溶劑的分子毒性，認為有 機溶劑的功g p 值能很好地表征有機溶劑對細胞的毒性影響，但得出有機溶劑對細胞 毒性隨有機溶劑的l o g p 值變化規(guī)律不完全一樣。h o c k n a l lmd 等嘲1 認為l o g p 4 的有機溶劑則無毒性；v c r m u em 等啪3 認為l o g p 5 的有 機溶劑則無毒性。b r u c el 等嗍認為l o g p 6 的有機溶劑則無毒性。這些研究者實驗所用的有機溶劑有不同的飽和烴、 烯烴、氟代烴、醇、脂、醚和芳香烴等。 為了定量研究有機溶劑對生物催化劑活性的影響，l a n n cc 等口刀考察了1 0 7 種有 機溶劑的介電常數(shù)、偶極矩、氫鍵、極化強度和h g p 值等參數(shù)，認為只有i j d g p 值能 很好預測生物相容性。但這只是一個經(jīng)驗性的結論，l o g p 值相近的溶劑可能對微生物 的影響完全不同，如腸沙門氏菌( s a l m o n e l l ae n t e r i c a ) 和大腸桿菌( e s c h e r i c h i ac o l i ) 可以在正己烷( 1 0 9 p ，3 5 ) 存在的環(huán)境中存活，卻不能在環(huán)己胺( 1 0 9 p ，3 2 ) 存在 下保持活性。 1 3 1 2 有機溶劑處理條件對細胞毒害的影響 吳兆亮等囪舯1 在紅豆杉細胞兩液相培養(yǎng)中，研究了有機溶劑的加入時間對細胞生 長的影響，結果表明東北紅豆杉、南方紅豆杉，有機溶劑在細胞的生長對數(shù)期中期至 末期加入使細胞的濕重、干重和細胞水含量下降較小。因此為減少有機溶劑對細胞的 毒性，在培養(yǎng)過程中應在細胞的生長對數(shù)期中期至末期加入對細胞生長影響最小。吳 兆亮等在紅豆杉細胞兩液相培養(yǎng)中，也研究了有機溶劑的加入量對細胞生長影響，結 果表明東北紅豆杉、南方紅豆杉在有機溶劑油酸、鄰苯二甲酸二丁脂存在時，隨著有 機溶劑體積分數(shù)增加，細胞的濕重、干重和細胞水含量逐漸下降，有機溶劑對細胞毒 性增加。因此為減少有機溶劑對細胞毒性，有機溶劑加入量越少越好，但有機溶劑加 入量太少又起不到萃取作用，有機溶劑加入量需要有一個最佳值。 1 3 2 細胞對有機溶劑耐受機理的研究及進展 1 3 2 1 細胞對有機溶劑的耐受機理 非水相生物轉(zhuǎn)化和涉及有機溶劑的環(huán)境微生物技術中，有機溶劑對微生物細胞的 毒性使相關的研究和應用受到制約，這些有機分子進入到細胞膜中，破壞膜的完整性、 增加膜的通透性，使細胞死亡；但在一些情況下，某些微生物可以通過自身的抗性機 制在有機溶劑中存活，而微生物對有機溶劑的耐受性主要取決于物理障礙、細胞膜水 平、主動泵出系統(tǒng)三個層次上相應的生理生化作用洲。 一些學者認為細胞要對有機溶劑產(chǎn)生抗性，就必須對抗由溶劑引起的細胞膜通透 性的增加，在該水平上，微生物主要通過h o m c o v i c o u sa d a p t a t i o n 機制( 簡稱h a 機 制) 嘲和膜脂中脂肪酸的異構化來實現(xiàn)，是對有機溶劑抗性反應的最簡單的方式。這 種方式是微生物通過調(diào)整膜中脂肪酸的飽和度和脂酞基的長度來維持膜原有的流動 性：通過這種機制，微生物可以產(chǎn)生一定的抗性；在有機溶劑存在的情況下，微生物 可以非常迅速的通過特殊的方式，改變順式脂肪酸和反式脂肪酸兩者的比例，來對抗 細胞膜通透性的增加，特別是在微生物不支持脂肪酸從頭合成的情況下，雙鍵的異構 化機制可以使它適應高濃度的毒性。除了這些被動的機制外，有些微生物還有主動的 抗性機制，將有機溶劑從細胞膜中泵出來。 關于微生物在有機溶劑中的耐受機制目前有以下幾種說法嗍： ( 1 ) 細胞質(zhì)膜的適應機制：脂肪酸飽和度的改變，改變膜的透性和穩(wěn)定性，適應 天津科技大學碩士學位論文 有機溶劑的存在。 。 ( 2 ) 外膜水平的適應機制：革蘭氏陰性菌細胞壁有特有的外膜結構。一些離子能 增強外膜組成的穩(wěn)定性和促使脂多糖組成的改變，從而提高對有機溶劑的耐受性。 ( 3 ) 有機溶劑的改變和排出：有一些微生物通過對有機溶劑的改變和降解或迅速、 及時的排出從而提高微生物對有機溶劑的耐性。 另外，研究發(fā)現(xiàn)革蘭氏陰性菌對有機溶劑的耐受性比革蘭氏陽性菌強一1 ，主要 因為革蘭氏陰性菌有一個外膜結構，能夠通過外膜脂多糖、脂肪酸的改變及膜上泵出 系統(tǒng)的調(diào)節(jié)，降低有機溶劑對細胞的毒害洲。與革蘭氏陰性菌相比，革蘭氏陽性菌缺 少這樣一層外膜，所以只有少數(shù)幾種革蘭氏陽性菌表現(xiàn)一定的有機耐受性。 1 3 2 2 細胞對有機溶劑耐受機理的研究進展 盡管有機溶劑對微生物有毒害作用，但還是發(fā)現(xiàn)一些對有機溶劑有耐性的微生 物，研究較多的是假單胞菌( p p u t i d a ) 和大腸桿菌( e c o l i ) 。有學者從深海環(huán)境里分 離出對有機溶劑有耐性的革蘭氏陽性菌，如一些桿菌類，l i n d s e ye h 0 1 等從油蠅幼蟲體 內(nèi)分離出有耐性的溶血性葡萄球菌( s t a p h y l o c o c c u sh a e m o l y t i c u s ) 和腸球菌 ( e n t e r o c o c c u s ) 。另外，可以誘變一些本不耐有機溶劑的菌株來獲得有耐性的突變株， 如大腸桿菌( ec o ) k 1 2 。大多數(shù)對有機溶劑有耐性的細菌是革蘭氏陰性菌，只有少 數(shù)革蘭氏陽性菌( b a c i l l u s , 尉t z o d o c o c c u s ，e n t e r o c o c c u s 等) 對有機溶劑表現(xiàn)出耐受性h h 蜘 鄭曉東，梅樂和等在酵母對有機溶劑耐性的研究一文中闡述了酒精酵母比其他 酵母抗非極性溶劑的能力更強。酵母對有機溶劑的抗性不僅與溶劑的極性、毒性、劑 量范圍有關，而且與酵母細胞膜的成分、生長培養(yǎng)基、溫度等有關。當生長培養(yǎng)基中 的m 礦濃度提高兩倍時，多數(shù)菌株對有機溶劑的抗性沒有影響。溫度對所檢測酵母的 生長及對溶劑的抗性都有一定的影響。 a n a n d akg h o s h 等1 4 4 發(fā)現(xiàn)釀酒酵母( s a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a e ) 在有機溶劑刺激 下i c t l p 大量表達，i c t l p 與磷脂酸的合成有關，磷脂酸又與磷脂的合成有關，而膜磷 脂的增加是釀酒酵母( s a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a e ) 耐有機溶劑的機制之一。 j a c o br 掣4 5 l 對丙酮丁醇梭菌( c l o s t r i d i u ma c e t o b u t y l i c u m ) a t c c8 2 4 與有機溶 劑耐受性相關的基因進行了系列研究，以便更好的理解有機溶劑耐性基因的調(diào)控表達 機制。 對有機溶劑耐受性較強的假單胞菌( p p u t i d a ) ，許多學者進行了大量研究，并得 到很多有價值的發(fā)現(xiàn)。h o l t w i c k 等【蛔認為膜脂肪酸的順反異構化，增強了細胞膜的 強度，降低滲透性，從而改變假單胞菌對有機溶劑等逆境的適應能力。另外，磷脂合 成的增加、抗生的泵出系統(tǒng)等被認為有利于增強假單胞菌( p p u t i d a ) 對有機的耐受能 力 4 7 1 。e s t r e h ad u q u e 等【船l 認為假單胞菌( p p u t i d a ) 編碼2 0 個e c f s ( e x t r a c y t o p l a s m i c s i g m af a c t o r s ) ，并研究了其中一個e c t - p p l 2 ，編碼該e c f 的基因稱為r p o t ，發(fā)現(xiàn)r p o t 在有機耐受性中扮演重要角色。 1 前言 還有學者研究了腸沙門氏茵( s a l m o n e l l ae n t e r i c a ) 的流出泵基因a c r b 和操縱子 m a r a 和s o x s ，得出結論認為腸沙門氏菌( s a l m o n e l l ae n t e r i c a ) 對環(huán)己胺的耐受性與 a c r b 基因有關【鉀刪。 1 4 大腸桿菌對有機溶劑的耐受機理研究進展 r i k i z o a o n o 掣5 1 】研究了有機溶劑耐性菌株e c o l ik 1 2 突變株的細胞表面特征，認 為e c o l ik 1 2 突變株有機溶劑耐性提高的細胞較親本疏水性弱，可能是脂多糖增加的 原因，另外，突變株o m p f 合成受到抑制，o m p c 合成得到表達，發(fā)現(xiàn)表明有機溶劑 分子可以通過o m p fp o r i n ；o m p f 的缺失可以直接減少有機溶劑的通道數(shù)目也間接增 加細胞表面l p s 序列可用區(qū)域，從而改變e c o l ik 1 2 的耐性。 n o g u e h i 等【5 2 】人認為培養(yǎng)環(huán)境中氧濃度提高有利于增強e c o l i 對有機溶劑的