（果樹學(xué)專業(yè)論文）山定子遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立.pdf

中文摘要 本實驗以山定子葉片為實驗材料，采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法，研究了抗生素及轉(zhuǎn)化過程中各因素對 轉(zhuǎn)化的影響，成功獲得轉(zhuǎn)化m m r t l 基因的山定子轉(zhuǎn)基因植株。建立了山定子轉(zhuǎn)化體系，為山定子 性狀的定向改良奠定基礎(chǔ)具體實驗結(jié)果如下； 研究了羧芐青霉素( c a x b ) 、頭孢霉素( c e o 、卡那霉素f r , a n ) 、潮霉素( i i y g ) 對山定子葉片愈傷 組織和不定芽誘導(dǎo)的影響結(jié)果表明，羧芐青霉素對山定子葉片再生有明顯的抑制作用，濃度低 于4 5 0 m 班的頭孢霉素對山定子葉片愈傷和不定芽誘導(dǎo)影響不大極低濃度的潮霉素即可導(dǎo)致山 定子葉片大面積褐化死亡，不適合做篩選抗性芽的抗生素k a n 濃度為4 0 m g l 時，恰好可完全 抑制不定芽再生而不使葉片死亡，可作為山定子葉片轉(zhuǎn)化過程中合適的篩選壓力濃度 通過比較在卡那霉素篩選培養(yǎng)基上的抗性芽百分率，研究激素配比、乙酰丁香酮、脯氨酸、 共培養(yǎng)時間、預(yù)培養(yǎng)時間、侵染時間、暗培養(yǎng)時間、培養(yǎng)基碳源及固化物對轉(zhuǎn)化的影響結(jié)果表 明：預(yù)培養(yǎng)不利于山定子葉片的轉(zhuǎn)化；菌液中添加乙酰丁香酮和脯氨酸對轉(zhuǎn)化無明顯影響；侵染 1 0 或1 5 m i n ，共培養(yǎng)3 天，暗培養(yǎng)2 或3 周得到的抗性芽百分率最高；轉(zhuǎn)化后葉片再生培養(yǎng)基的 最適碳源為葡萄糖或蔗糖，最適固化物為植物凝膠和g e l r i t e ，最佳激素配比為n a a l 0 m g l 4 - b a 2 m g l + t d z 4 m g l 抗性植株經(jīng)p c r 檢測，初步證明外源目的基因已整合到山定子基因組中 關(guān)鍵詞：山定子；葉片l 遺傳轉(zhuǎn)化；影響因素 a b s t r a c t u s i n gt h el e a v e sa st h em a t e r i a l ，d i f f e r e n ta n t i b i o t i c sa n d v i ：n l 白_ c | 【o 礙w h i c ha 丘e d 一驢口6 4 d 甜血肼 i i u n e f a c e n sm e d i a t e dg e mt r a n s f o r m a t i o no fm a l u sb a c e a t ab o r k h 懈i n v c s t i g a t e a t t h et r a n s g c n i c s h o o to f m a l u sb a c c a t ab o r k hw i t ht h et a r g e tg e n to f m x r t li n d i c a t e dt h a tg e n e t i cn a n s l 6 0 日n a n o 咀 s y s t e mo fm a l u sb a c c a t ab o r t d ah a db e e ne s t a b l i s h e d a l lo f 血i sl a y e daf o t m d i t i o no fu p g r a t i n gt h e c h a r a c t e r so f m a l u sb a c c a t ab o r k t h er e s u l t si s1 1 8b e l o w ： e f f e c t so fc a r b e n i e i l l i n , e e f o t a m x i m , k a n a m y e i na n dh y g r o m y e i no nc a l l u si n d u c t i o na n ds h o o t r e g e n e r a t i o nf i o mt h el e a v e so fm a l u sb a c c a t ab o r k hw i n v e s t i g a t e d t h er e s u l t ss h o w e dt h a t 洲e i l l i nr e s t r a i n e dt h el e a v e sr e g e n e r a t i o no f m a l u sb a c c a t ab o r l r j as l g n i r l e a n t l y c e f o t a r a x i m eh a d 1 1 0 i g n i f i m te f f e c l s0 nt h ec a l l u si n d u e l i o na r i ds h o o tr e g e n e r a t i o nw h e nt h cc o n c e n t r a t i o nw a sl e s s t h a n4 5 0 m g r t , i - i y g r o m y e i ni su m u i t a b l ct o ts a r e e n i n gt h ek a n a m y e i nr e s i s t a n ts h o o tb e c a u s el o w c o n c e n t r a t i o no fl a y g r o m y e i nb r o u g h t _ m a 鯧o fl e a v e s 幻d e a t h t h ec o n c e n t r a t i o no lk a n a m y e i na t 4 0 m e , le m p l c t c l yr e s t r a i n e dt h es h o o tr e g e n e r a t i o na n dw a so p i t a lt oo 口mt h ek a n a m y e i nr e s i s t a n t s h o o ti nt h eg e n e t i ct t a t 僦o r m a t i o no i m a l u sb a e t ab o r k l l b yc o m p a r i n gr a t eo ft h ek a n a m y e i nr e s i s t a n ts h o o t , s e v e r a lf a c t o r sw h i e l aa f f e c ta g r o b a c t e r u m n u n e a d e n sm e d i a t e dg e n ei z a n s f o r m a t i o no fm a l u sb a e c a t ab o r l r hw mi n v e s t i g a t e d t h ef a c t o r s i n c l u d e dh o l l n o n l c o m b i n a t i o n , a e e t o s y r i n g o n c ( a s p r o l i n e o o - c t d t u r ct i l n c ，p r c - c u l t t t r e 血塢 i n 如c i 妯峨d a r kc u l t u r e 婦，c m j o o e is o u i c a n dc o n d e n s a t co fi n e d i l l m t h er e s u l 扛s h o w e dt h a t p r e - c u l t u r eo ft h el e a v e sw 私d j , s a d v a n l a g e o l l i s1 0 缸部嚙f ( 岫田越j(luò) o n ：t h 眥w 鴰n oe v i d e n ti n t l u e n e e l a a n d o r m a t i o nb ya d d i n ga sa n dp i oi n t ot h eb a c t e r i a l 翮s p s i 儺o rn o t ；i i f f e e t i o nf o r 加o r1 5 m i n i t e s n dc o - c u l t u r ei o r3d a y st h e nt h ec u l t u r ei n t h ed a r kf o ra b o u t2o r3w e e k so b t a i n e dt h el a i g h t e s tr a t eo f 曲幛r e s i s t a n ts h o o t ；t h eo p t i m a lc a r b o n9 0 i l r 溉o fl e a fr e g e n e r a t i o nl i l l x u u ma f t e rt z a n s f o r m a t i o l aw a s s u g a ra n dg i u 蝎p h ”a g da n dg e l r i t e 1 1 1 1 ：b e t t e rt h a n a g 缸 i t so 翻a d e m a t co ft h e m e d i u m n a a l o m g i a - b a 2m g l + t d z 4m g 兒i st h eb e s th o l r l l o l l ce o m b i n a t i o o t h ep 氓a n a l y s i s s h o w e dt h a tt h et a r g e tg e n ew a si n t e g r a t e di n t ot l a eg e n o m co f m a l u sb a c e a t ab o r k l l k e yw o r d ：m a l u sb a c c a t ab o r k h ；le a f ；g e n e t i ct r a n s f o r m a t i ；a f f e c t i n gf a c t o r 縮略詞 6 - b c n z y l a m i n o p u r i m a - n a p h t h a l e n ea c e t i c a c i d 1 扯d i a z u m n c e f o t a m x i m e r t f a m p m c a r b e n i c i u i n k a n a m y c i n h y g r o m y c i n m i c r o g r a m m i c r o l i t r e b a s ep a i r c o m p l e m e n t a r yd n a d i e t h y l - p y r o c a r b o n a t e d e o x y r i b o n u c l e i ca c i d e t h y l e n ed i n i u i l o t e t r a c e f i ca c i d l i u e m m i g i a m m 珊i l i t 盱 o p t i c a ld e n s i t y p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n r i b o n u c l e i ca c i d r o u n d sp e rm i n u t e s o d i u md o d e c y ls u l f a t e t r i s o y u 蛔x y m e t h y l ) a m i n o m e t h a n e 隊耋|馓：鎏蛐；驀腳哼肚陋一一一k蟛礎(chǔ)瞅慨氍耄|鱟 獨創(chuàng)i 生聲明 本人聲明所呈交的論文是我個人在導(dǎo)師指導(dǎo)下進(jìn)行的研究工作及取得的研究成 果。盡我所知，除了文中特別加以標(biāo)注和致謝的地方外，論文中不包含其他人已經(jīng)發(fā) 表或撰寫過的研究成果，也不包含為獲得中國農(nóng)業(yè)大學(xué)或其它教育機(jī)構(gòu)的學(xué)位或證書 而使用過的材料。與我一同工作的同志對本研究所做的任何貢獻(xiàn)均已在論文中作了明 確的說明并表示了謝意。 研究生簽名：馬志，拇 時間： 聊7 年6 月d 日 關(guān)于論文使用授權(quán)的說明 本人完全了解中國農(nóng)業(yè)大學(xué)有關(guān)保留、使用學(xué)位論文的規(guī)定，即：學(xué)校有權(quán)保留 送交論文的復(fù)印件和磁盤，允許論文被查閱和借閱，可以采用影印、縮印或掃描等復(fù) 制手段保存、匯編學(xué)位論文。同意中國農(nóng)業(yè)大學(xué)可以用不同方式在不同媒體上發(fā)表、 傳播學(xué)位論文的全部或部分內(nèi)容。 ( 保密的學(xué)位論文在解密后應(yīng)遵守此協(xié)議) 研究生簽名： 導(dǎo)師簽名： 馬毛搏 翮參 時間：a a 驢2 年b n ，。日 時間：矽礦年6 月b 日 中國農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文第一章前言 第一章前言 1 1 果樹轉(zhuǎn)基因研究進(jìn)展 植物遺傳轉(zhuǎn)化( g e n e t i ct r a n s f o r m a t i o n ) 是指利用重組d n a 技術(shù)和植物細(xì)胞組織培養(yǎng)技術(shù)， 將外源基因?qū)胫参锸荏w細(xì)胞進(jìn)行無性繁殖，使外源基因在受體細(xì)胞表達(dá)，從而產(chǎn)生人類所需的 轉(zhuǎn)基因植株果樹轉(zhuǎn)基因研究始于2 0 世紀(jì)年代末期，m c g r a n a h a n 等于1 9 8 8 年獲得轉(zhuǎn)基因核 桃植株，是世界上首例轉(zhuǎn)基因果樹，隨后蘋果、柑橘、梨、葡萄、草莓、獼猴桃、桃、李、杏、 番木瓜、芒果和香蕉等果樹也相繼成功實現(xiàn)了遺傳轉(zhuǎn)化( l e ej ，1 9 9 8 ；y a m a m o t ot ，2 0 0 0 ；b e l l r l ，1 9 9 9 ：s c o r z ar ，1 9 9 1 ；l a i m e r ，1 9 9 2 ；f i t c h ，1 9 9 3 ) 蘋果轉(zhuǎn)基因研究成就尤為顯著，自 1 9 8 6 年獲得“綠袖”的轉(zhuǎn)基因植株以來，已有m 2 6 、金冠、綠袖、新喬納金、皇家嘎拉、元帥、富 士，王林，e h t a r 、粉紅佳人等品種和砧木獲得轉(zhuǎn)基因植株( 程家勝，1 9 9 4 ；張志宏，1 9 9 7 ；j a m e s d j ，1 9 8 9 ；d a n d e k a r a m ，1 9 9 0 ：c l a u d el ，1 9 9 2 ；s u t t e re g ，1 9 9 3 ：n o r e l l ij l , 1 9 9 3 ；a n n ah o l e f o r s ， 1 9 9 7 ) ，部分已進(jìn)入大田試驗階段 1 1 1 果樹遺傳轉(zhuǎn)化的方法 1 農(nóng)桿菌介導(dǎo)法 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化具有操作簡單、成本低、導(dǎo)入d n a 片段較大等優(yōu)點，因此是目前應(yīng) 用最廣泛的一種方法( 王關(guān)林等，1 9 9 6 ；m i n g 等，1 9 9 7 ) 果樹轉(zhuǎn)化成功的例子中，8 0 以上是 采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法( 曾黎輝，2 0 0 2 ) 農(nóng)桿菌介導(dǎo)法的轉(zhuǎn)化原理，主要得益于農(nóng)桿菌侵染植物受傷部位，產(chǎn)生冠癭瘤的過程在致 瘤菌株感染植物過程中，1 i 質(zhì)粒的一段d n a 序列整合到植物基因組中并與植物基因組d n a 一 起復(fù)制表達(dá)，這段序列稱為轉(zhuǎn)移d n a ( t - - d n a ) t - d n a 上有兩類基因：致瘤基因( o n c o g e n e ， o n c ) 和冠癭瘤合成酶基因除刊d n a 外，面質(zhì)粒上還有致毒區(qū)( v i r u l e n c e ，、 i r ) ，以及冠癭瘤 代謝、接合轉(zhuǎn)移、d n a 復(fù)制、不相容性等功能區(qū)段已有的實驗證明，t - d n a 的左右邊界區(qū)， v i r 區(qū)以及農(nóng)桿菌染色體上的染色體致毒區(qū)( c h r o m o s o m ev l n f l e n c e ，c h v ) 在t - d n a 轉(zhuǎn)移和整合過 程中起關(guān)鍵作用農(nóng)桿菌染色體致病區(qū)( 曲v ) 分為c h v a 和c h v b 兩個基因位點主要起決定農(nóng)桿 菌能否附著到寄主植物細(xì)胞表面的作用農(nóng)桿菌表面的脂多糖和植物細(xì)胞壁上的果膠是農(nóng)桿菌附 著的感受器。一旦附著，相互作用的結(jié)果是農(nóng)桿菌合成纖維素小絲，把農(nóng)桿菌固定在植物細(xì)胞壁 上，并把其他農(nóng)桿菌聚在一起，以便于t - d n a 的轉(zhuǎn)移毒性區(qū)v t r d 2 蛋白基因具有兩個明顯的 核定位信號，起激活t - d n a 在植物細(xì)胞核中定位的作用( 夏英武等，1 9 9 4 ) 野生型農(nóng)桿菌不適合作為基因工程載體因為其質(zhì)粒龐大，很難找到單一t - d n a 區(qū)限制性酶 切位點，誘瘤基因?qū)е轮参镌偕щy于是人們對農(nóng)桿菌株系進(jìn)行選育并對砸質(zhì)粒進(jìn)行改進(jìn)：( 1 ) 去處某些非必須序列在t - d n a 區(qū)去掉誘瘤，基因只保留其左右邊界和n o s 基因，并成功地感 染植物表達(dá)胭脂堿，并誘導(dǎo)出植株，是農(nóng)桿菌作為轉(zhuǎn)基因工具的一大突破z e m b r y s k i 用p b r 3 2 2 中國農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文第一章前言 代替p t i c 5 8 的一個t - d n a ( 只保留左右邊界和n o s 基因) ，構(gòu)建成新的質(zhì)粒p o v 3 8 5 0 ，用含有 該質(zhì)粒的農(nóng)桿菌侵染植物得到胭脂堿表達(dá)；( 2 ) 構(gòu)建篩選外源基因的嵌合基因。s h i m a m o t o 在 t - d n a 中構(gòu)建了n o s 和。岱啟動子+ a p t i i + t n o s ( p o l y a ) 的嵌合基因并使其帶有了選擇標(biāo)記基因， 是農(nóng)桿菌作為轉(zhuǎn)基因工具的第二個里程碑；( 3 ) 構(gòu)建中間載體。即將t - d n a 亞克隆到一個方便 操作的小的p b r 3 2 2 系列的大腸桿菌質(zhì)粒中，外源d n a 可方便插入包含有t - d n a 區(qū)的質(zhì)粒，然 后導(dǎo)入農(nóng)桿菌中，用于植物轉(zhuǎn)化( 4 ) 構(gòu)建雙元質(zhì)粒載體和超雙元質(zhì)粒載體。即在農(nóng)桿菌中引入 一個含有外源基因的小質(zhì)粒與農(nóng)桿菌的原始質(zhì)粒構(gòu)成雙元或超雙元質(zhì)粒，使含有重組外源d n a 的髓質(zhì)粒更方便快捷地導(dǎo)入農(nóng)桿菌，同時使得轉(zhuǎn)化效率也大大提高( 徐明良，1 9 9 6 ) 。 果樹主要采用葉圓盤法，直接利用葉片、莖段、愈傷組織和懸浮細(xì)胞等具有再生能力的外植 體作為轉(zhuǎn)化受體。如蘋果的轉(zhuǎn)化主要以葉片為受體，柑橘類主要采用莖段、胚軸和子葉而葡萄則 利用胚性培養(yǎng)物來轉(zhuǎn)化( s c h e l l ，1 9 9 6 ；陳善春，1 9 9 7 n o r e l l i 等，1 9 9 4 ；趙政陽等，1 9 9 6 ) 木本果樹還可以采用活體接種法進(jìn)行轉(zhuǎn)化。活體接種法一般采用田問樹體為外植體，在整體植株 上造成創(chuàng)傷后把農(nóng)桿菌接種在刨傷面上，或用針頭直接將農(nóng)桿菌注射到植株體內(nèi)使其侵染轉(zhuǎn)化 李衛(wèi)等( 1 9 9 7 ) 用此方法感染沙田柚葉腋，并將轉(zhuǎn)化腋芽離體擴(kuò)繁，成功得到轉(zhuǎn)基因植株洪勇 等( 2 0 0 0 ) 將農(nóng)桿菌菌液直接浸入柑橘實生苗幼芽切口處，包纏傷口后誘導(dǎo)再生芽，錦橙、新會 橙和沙田柚的轉(zhuǎn)化效率分別達(dá)到4 6 3 。9 5 和4 3 7 2 基因槍法 基因槍法又稱彈轟擊法，基本原理是將外源d n a 包被在微小的金?；蜴u粒表面，高壓作用下 微粒被高速射入受體細(xì)胞或組織，使微粒上的外源d n a 整合到植物基因組d n a 中并得到表達(dá)，從 而實現(xiàn)基因轉(zhuǎn)化( 董云洲，1 9 9 3 ) 1 9 8 7 年，k l e i n 等首次用基因槍法將煙草花葉病毒c r m v ) 成功 轉(zhuǎn)入洋蔥表皮細(xì)胞( j a m e s 等，1 9 9 5 ) ，基因槍法無宿主限制，受體廣泛，( h e b e n ，1 9 9 3 ) 用包裹 質(zhì)粒的鎢彈轟擊葡萄細(xì)胞懸浮系，獲得了轉(zhuǎn)化的愈傷組織s c o r z a 等( 1 9 9 6 ) 結(jié)合農(nóng)桿菌介導(dǎo)法和 基因槍法轉(zhuǎn)化葡萄胚，提高了轉(zhuǎn)化率目前利用基因槍轉(zhuǎn)化獲得轉(zhuǎn)基因植株的果樹有番木瓜、桃、 葡萄，蔓越橘等( m i n g r 等，2 0 0 1 ；趙彬等，1 9 9 8 ；安韓冰等，1 9 9 7 ) 3 其它轉(zhuǎn)化方法 果樹遺傳轉(zhuǎn)化主要以上述兩種方法為主，但其它方法也有成功報道v a r d i 等( 1 9 9 0 ) 用p e g 法 轉(zhuǎn)化檸檬原生質(zhì)體獲得轉(zhuǎn)基因植株，o l i v e r a ( 1 9 9 6 ) 用電擊法及p e g 法轉(zhuǎn)化獼猴桃原生質(zhì)體獲得 成功，趙慧等( 1 9 9 8 ) 用微激光束穿刺法將菜豆幾丁酶基因?qū)胩O果葉片，獲得了轉(zhuǎn)基因植株 1 1 2 果樹遺傳轉(zhuǎn)化受體系統(tǒng) 轉(zhuǎn)基因植株的獲得依賴于合適的轉(zhuǎn)化受體及轉(zhuǎn)化細(xì)胞的有效再生，因此應(yīng)選擇易于再生的外 植體進(jìn)行轉(zhuǎn)化，其次，具有再生能力的細(xì)胞要對農(nóng)桿菌敏感劉慶忠等( 2 0 0 0 ) 最初轉(zhuǎn)化皇家嘎 拉白化莖段獲得轉(zhuǎn)基因植株，分析發(fā)現(xiàn)作為新梢再生起源的表皮和下表皮細(xì)胞中沒有g(shù) u s 基因 的表達(dá)，o u s 基因表達(dá)集中于形成層和維管束周圍的皮層細(xì)胞。 轉(zhuǎn)化效率還與外植體的發(fā)育階段有關(guān)。程家勝( 1 9 9 2 ) 認(rèn)為以生根培養(yǎng)1 個月的蘋果上部 2 中國農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文第一章前言 幼嫩葉片作為基因轉(zhuǎn)移的受體材料最好農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化對植物細(xì)胞具有選擇性，只轉(zhuǎn)化處于 代謝活躍或分裂期的細(xì)胞，因此，在果樹轉(zhuǎn)化中經(jīng)常采用預(yù)培養(yǎng)、頻繁繼代、創(chuàng)傷外植體等辦法 調(diào)整外植體的狀態(tài)，以獲得合適的轉(zhuǎn)化受體，提高轉(zhuǎn)化效率。 果樹常用的轉(zhuǎn)化受體為莖段，葉片，在柑橘中。來源于珠心胚的胚軸和子葉也是常用的轉(zhuǎn)化 受體。方宏筠等( 1 9 9 9 ) 認(rèn)為莖尖轉(zhuǎn)化系統(tǒng)再生能力強(qiáng)，對侵染損傷及卡那霉素的耐受力強(qiáng)，轉(zhuǎn) 化頻率較高，莖尖不經(jīng)脫分化過程直接分化出芽變異少，且超小剝離的莖尖再生后具有脫毒效果， 他們以莖尖為轉(zhuǎn)化受體成功轉(zhuǎn)化了櫻桃矮化砧木這些組織化程度較高的外植體對農(nóng)桿菌的敏感 性不如懸浮細(xì)胞及原生質(zhì)體，但耐受性好，操作簡單，是果樹上理想的轉(zhuǎn)化受體 另一類常用的受體是胚性培養(yǎng)物，包含合子胚、體胚、胚性愈傷組織、懸浮細(xì)胞等許多果 樹使用這種外植體獲得轉(zhuǎn)化成功，如核桃、桃，李、杏、番木瓜、葡萄等( 曾黎輝，2 0 0 2 ) 胚 性細(xì)胞具有很強(qiáng)的接受外源d n a 的能力，繁殖量大，嵌合體少，轉(zhuǎn)化率較高。葡萄體胚來源于 葉片，且通過次生胚再生起源于單細(xì)胞，是優(yōu)于葉片的轉(zhuǎn)化受體，轉(zhuǎn)化率可達(dá)1 3 農(nóng)桿菌侵染 荔枝、龍眼胚性愈傷組織，發(fā)現(xiàn)愈傷組織對農(nóng)桿菌敏感，但耐受性差，一些品種與農(nóng)桿菌共培養(yǎng) 后會發(fā)生白化愈傷組織和懸浮細(xì)胞是基因槍轉(zhuǎn)化中常用的受體c a b m r a - p o n c e 等( 2 0 0 2 ) 以番 木瓜合子胚和胚性愈傷組織作為粒子轟擊的靶細(xì)胞，胚性愈傷組織的轉(zhuǎn)化率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于合子胚目 前已經(jīng)在多種果樹上利用原生質(zhì)體再生出植株( 鄧秀新等，2 0 0 3 ) ，為采用原生質(zhì)體為受體的基 因轉(zhuǎn)化奠定了基礎(chǔ) 1 1 3 導(dǎo)入的外源基因 1 抗病蟲基因果樹病害主要由病毒及類病毒，真菌和細(xì)菌引起來自蘇云金桿菌的b t 蛋白 基因及來自植物的豇豆胰蛋白酶抑制劑基因等成為果樹抗蟲轉(zhuǎn)基因的目的基因。 ( s o a r z a ，1 9 9 1 。1 9 9 4 ；o u e m a d a h 等，1 9 9 0 ) 。且前幾乎所有已實現(xiàn)遺傳轉(zhuǎn)化的果樹均培育出抗病 蟲轉(zhuǎn)基因植株( 陳善春等，1 9 9 6 ；d a n c e k a r 等，1 9 9 8 ；湯浩茹等，2 0 0 1 ；h i 嘣d ac a m a r am a c h a d o 等，1 9 9 9 ；l i u 等，1 9 9 9 ) 2 抗逆基因通過轉(zhuǎn)基因手段提高植株抗逆性已取得階段性成果，轉(zhuǎn)s o d 基因的葡萄和轉(zhuǎn) 徹基因的草莓在田問試驗中均表現(xiàn)出比未轉(zhuǎn)化植株具有更強(qiáng)的抗冷能力，通過促進(jìn)甜菜堿或 山梨醇的積累也獲得了抗鹽的轉(zhuǎn)基因柿和草莓植株，c | 撇a 等( 2 0 0 0 ) 將酵母h a l 2 基因?qū)敫?橘獲得了抗鹽植株；抗除草劑的轉(zhuǎn)基因草莓和歐洲栗也己獲得( 楊莉等，2 0 0 3 ) w a n g 等從冷誘導(dǎo)的柑橘中分離出a o c 厶成酶基因并將其反義導(dǎo)入甜橙和枳，大大減少了冷誘導(dǎo) 乙烯量，使果實更易儲藏( y a o 。1 9 9 9 ) 3 縮短童期r e n a 等( 2 0 0 1 ) 將擬南芥u 執(zhí)f y 和a p l 基因?qū)胩鸪群丸壮?，轉(zhuǎn)化植株開花比 未轉(zhuǎn)化植株提早3 - 5 年開花，該性狀在后代得到穩(wěn)定遺傳和表達(dá)，從轉(zhuǎn)基因果實中取出的種子經(jīng)播 種后，童期也明顯縮短 4 促進(jìn)樹體矮化、分枝與生根通過野生型根癌農(nóng)桿菌感染將細(xì)胞分裂素合成酶基因?qū)胩?已經(jīng)獲得樹體矮化、分枝多的轉(zhuǎn)基因植株通過發(fā)根農(nóng)桿菌感染將r o l a ，m 或r o l e 基因?qū)?蘋果、枳、梨和獼猴桃，既可促進(jìn)樹體矮化和分枝，還可促進(jìn)生根( s m i g o c k e 等，1 9 9 1 ) 5 增強(qiáng)果實耐貯性在躍變型果實中，一般通過減少乙烯合成的基因工程達(dá)到延緩果實成熟 中國農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文 第一章前言 m 的目的，非躍變型果實則采取抑制乙烯生成和降低細(xì)胞壁降解酶類達(dá)到目的。目前己獲得乙烯生 成受抑制的轉(zhuǎn)基因香蕉和果膠裂解酶活性下降的草莓果實，轉(zhuǎn)基因蘋果，桃和番木瓜的特性尚在 觀察中( 楊莉，2 0 0 3 ) 6 促進(jìn)單性結(jié)實或少籽通過轉(zhuǎn)基因誘導(dǎo)單性結(jié)實已經(jīng)在葡萄( m e z z e t t i ，2 0 0 2 1 和草莓 ( m e z z e t t i ，1 9 9 2 1 上獲得成功，已經(jīng)獲得了旨在減少種子的柑轉(zhuǎn)基因植株( i j ，2 0 0 2 ) 7 改善果實鮮食或加工品質(zhì)m u r a t a 等反義導(dǎo)入該基因，獲得了抗褐變的蘋果愈傷組織，后 續(xù)研究仍在進(jìn)行；現(xiàn)已獲得提高糖含量的轉(zhuǎn)基因葡萄及草莓；通過轉(zhuǎn)基因提高類胡蘿h 素含量的 嘗試已經(jīng)柑橘上展開；轉(zhuǎn)入酸性轉(zhuǎn)化酶基因的葡萄果實風(fēng)味得到改善，利于鮮食，轉(zhuǎn)入黃烷酮醇 還原酶基因的葡萄褐色素積累減少，提高了葡萄酒品質(zhì)( 楊莉，2 0 0 3 1 1 1 4 選擇標(biāo)記基因與轉(zhuǎn)化細(xì)胞的篩選 轉(zhuǎn)化細(xì)胞的有效再生除要求受體材料具有高效穩(wěn)定的再生能力外，選擇合適的選擇標(biāo)記基 因、恰當(dāng)?shù)目股胤N類及濃度對轉(zhuǎn)化細(xì)胞篩選也十分重要。果樹上最常用的選擇標(biāo)記是新霉素磷 酸轉(zhuǎn)移酶基因( n p t i i ) ，n p t l i 基因的表達(dá)可使轉(zhuǎn)化細(xì)胞對含有氨基塘苷鍵的抗生素( 卡那霉素， 新霉素等1 產(chǎn)生抗性，潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶( 研) 基因、抗除草劑基因b a r 基因等選擇標(biāo)記基因在 果樹遺傳轉(zhuǎn)化中也有使用。 m u l i i n s ( 1 9 8 8 1 用高濃度的k a n 為選擇壓獲得葡萄轉(zhuǎn)基因植株a l d w i n c i d e 等( 1 9 9 3 ) 報道 紅樹莓遺傳轉(zhuǎn)化用韌f 比用n p t l i 更為有效。不同的轉(zhuǎn)化受體篩選方法也有所不同，蘋果轉(zhuǎn)化體的 獲得采用選擇和非選擇交替培養(yǎng)或僅對再生芽進(jìn)行篩選，對杏有效的篩選是在共培養(yǎng)2 1 天后才 進(jìn)入篩選培養(yǎng)。 1 1 5 轉(zhuǎn)基因植株的驗證 植物遺傳轉(zhuǎn)化中，經(jīng)常會有假轉(zhuǎn)化體出現(xiàn)，因此，必須對轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行鑒定目前轉(zhuǎn)基因 植物的鑒定方法主要有三類；選擇標(biāo)記基因，分子檢測、免疫技術(shù) 一、選擇標(biāo)記基因 選擇標(biāo)記基因也稱報告基因( r e p o r tg e n e ) ，是一種片段較小，表達(dá)產(chǎn)物易于被檢測，能迅速 報告細(xì)胞、組織、器官或植株是否被轉(zhuǎn)化的基因選擇標(biāo)記基因多數(shù)是一些酶的基因，主要包括 三類：一、雙子葉植物農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化中常用農(nóng)桿堿合成酶類，這類報告基因都是合成農(nóng)桿堿的特異 酶類基因，檢測時加入相應(yīng)前體，利用其酶活性，將其催化為對應(yīng)的農(nóng)桿堿，然后以標(biāo)準(zhǔn)農(nóng)桿堿 作對照，進(jìn)行紙層析，經(jīng)呈色反應(yīng)，即可判斷該植株是否轉(zhuǎn)化；二，抗生素轉(zhuǎn)化酶類，這類報告 酶將底物抗生素乙?；蛄姿峄?，底物進(jìn)行放射性標(biāo)記，便可判斷是否轉(zhuǎn)化；三、產(chǎn)物具有光學(xué) 性質(zhì)的酶類，利用帶有光學(xué)活性基因的前體作底物( 李強(qiáng)，1 9 9 5 ) ，在報告酶的作用下，產(chǎn)生光 學(xué)活性物質(zhì)，經(jīng)過比色，熒光檢測即可判斷是否成功轉(zhuǎn)化應(yīng)用最廣泛的報告基因主要有b - 葡萄 糖苷酸酶基因( g u s ，8 - 半乳糖苷酶基因，熒光素酶基因( 王永飛，2 0 0 4 ) 侯學(xué)文等( 1 9 9 7 ) 發(fā)現(xiàn)一種集選擇與篩選于一體的綠色熒光蛋白( g f p ) ，它沒有種屬依賴性，不需要加入底物和輔 助因子，只需暴露在3 9 5 n m 或4 9 0 r i m 的光下便會激發(fā)出綠光。 4 中國農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文第一章前言 為了抑制非轉(zhuǎn)化細(xì)胞的生長，必須在培養(yǎng)基中添加一定濃度的選擇壓對外植體進(jìn)行選擇， 目前最常用的是抗生素抗性基因，如卡那霉素抗性標(biāo)記基因印f ，潮霉素抗性標(biāo)記基因枷和 氯霉素抗性標(biāo)記基因f ；除草劑抗性基因，如具p p t 抗性的b a r 基因；藥物抗性基因，如氨甲 喋呤抗性基因m t x l 其原理是抗性基因編碼的的蛋白( 酶) 對抗生素藥物進(jìn)行乙酰化、腺苷化， 磷酸化等化學(xué)修飾或水解，從而破壞了抗菌素的作用，從而使轉(zhuǎn)基因植株產(chǎn)生相應(yīng)的抗性可根 據(jù)不同植物的敏感程度選擇恰當(dāng)?shù)臉?biāo)記基因 二、分子檢測 轉(zhuǎn)基因植株的分子檢測主要包括分子標(biāo)記和分子雜交 分子標(biāo)記常用的方法有p c r 、r f l p 、r a p d 以及d n a 指紋技術(shù)，這些都是d n a 水平的 鑒定，而真核生物基因表達(dá)調(diào)控的程序復(fù)雜，通過分子標(biāo)記確定已經(jīng)整合到受體基因組上的外源 目的基因，極有可能在轉(zhuǎn)錄水平受抑從而使外源目的基因無法在轉(zhuǎn)錄水平檢測到即使轉(zhuǎn)錄水 平正常，但由于大量r n a 存在，r n a 所依賴的r n a 聚合酶被激活，形成r n a 雙鏈，被r n a s 降解，造成轉(zhuǎn)錄后水平的抑制，翻譯及蛋白質(zhì)水平上的調(diào)控，也會影響外源目的基因的表達(dá)，所 以僅在d n a 水平的檢測是遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠的，隨后出現(xiàn)了分子雜交技術(shù)。 分子雜交是鑒定轉(zhuǎn)基因植株在各調(diào)控水平上是否整合或表達(dá)的重要方法，主要包括s o u t h e r a 雜交，n o r m e m 雜交及w e s t e r a 雜交s o u t h e m 雜交，是外源目的基因序列作探針與轉(zhuǎn)化植株的 總的d n a 進(jìn)行雜交，是d n a 水平上的分子鑒定方法：n o n h e m 雜交是外源目的基因序列作探針 與r n a 雜交，是轉(zhuǎn)錄水平上的分子鑒定方法w e s t e m 雜交則是在翻譯或蛋白質(zhì)水平上進(jìn)行的分 子鑒定方法( m i n gx t j 0 0 0 ；朱常香，2 0 0 0 ；t a n gk x 2 0 0 0 ) ，。 三、免疫技術(shù) 免疫技術(shù)是一種蛋白質(zhì)水平上的檢測技術(shù)。常用的主要有酶聯(lián)免疫法( e n z y m e - l i n k e d h n m u n o s o d k m a s s a y , e h s a ) 和免疫熒光技術(shù)( h n m u n o f l u o r e s c e n c e ) 目前利用e l l s a 法從不同作物中檢測到了b t 、p a t 、e p s p s 等蛋白( u i b a n e k 等，2 0 0 3 ； r o g a n 等，1 9 9 9 ：i j 即等j 0 0 0 ) e l l s a 還可應(yīng)用于檢測報告基因刪表達(dá)的蛋白歐盟1 3 個 國家3 8 個實驗室用e u s a 對轉(zhuǎn)基因大豆樣品中的e p s p s 進(jìn)行檢測難確率高達(dá)9 9 ( u 坤等， 2 0 ) 目前常用的轉(zhuǎn)基因檢測方法是p c r 與豇船a 結(jié)合起來的i c r - e l i s a 法，亞匕方法結(jié)合了 i c r 的高效性與e u s a 的高特異- 靈敏度可達(dá)0 1 此外，也有利用生物鑒定方法、統(tǒng)計方法和細(xì)胞形態(tài)學(xué)等進(jìn)行轉(zhuǎn)基因鑒定的方法 1 1 6 影響果樹基因轉(zhuǎn)化的因素 果樹遺傳轉(zhuǎn)化個主要的問題就是轉(zhuǎn)化效率很低，探索影響蘋果遺傳轉(zhuǎn)化效率的因素，以達(dá) 到良好的轉(zhuǎn)化效果，就成為果樹基因工程研究領(lǐng)域的重要內(nèi)容目前研究認(rèn)為，影響果樹轉(zhuǎn)化效 率的因素主要有： 1 受體基因型及生理狀態(tài)果樹基因轉(zhuǎn)化頻率與再生效率之間聯(lián)系密切。通常適合轉(zhuǎn)化的受 體系統(tǒng)首先是一個高效的再生體系，目前許多果樹用葉片、莖段等外植體再生困難，制約了果樹 基因轉(zhuǎn)化的進(jìn)程受體的生理狀態(tài)也很重要，b n n d t 等( 1 9 9 6 ) 用繼代培養(yǎng)2 0 - 4 0 d 的試管苗幼嫩 葉進(jìn)行轉(zhuǎn)化，才能獲得最高的轉(zhuǎn)化效率，d a n d e k a r 等( 1 9 9 0 ) 取靠近頂端部位的2 3 片嫩葉為試 5 中國農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文第一章前言 材，轉(zhuǎn)化效率最高。 2 農(nóng)桿菌菌株及載體的影響農(nóng)桿菌分三大類菌系，即胭脂堿型o p a l i t y p e , n o p ) 、章魚 堿型( o c o p j 丑ct y p e ，o c t ) 及農(nóng)桿菌堿型( a g r o p i u et y p e ) ，亦稱琥珀堿型( s u c c i n e n u ，p i n et y p e , s u c ) 。n o p 型菌株生長速度快，不結(jié)球、易操作，常用的工程菌株有c 5 8 、p g v 3 8 5 0 、a 2 0 8 s e 等； o c t 型菌株生長慢，菌株培養(yǎng)過程中結(jié)球，操作困難，共培養(yǎng)后不易洗掉，常用的工程菌株有l(wèi) b a 4 4 0 4 、l b a l 0 4 ；s u e 型菌株具有n o p 型菌株的特點，常用的工程菌為e h a1 0 1 和e h a1 0 5 。這 兩種菌株的侵染能力都很強(qiáng)( j a c q 等，1 9 9 3 ；s a r m e n t o 等，1 9 9 2 ；v e l u th a m b i 等，1 9 8 9 ) 。通過 在多種果樹上菌株種類的侵染能力比較，認(rèn)為e h a1 0 5 是果樹基因工程中理想的轉(zhuǎn)化載體，利用 該菌株己成功獲得了蘋果、櫻桃、草莓等多種果樹轉(zhuǎn)基因植株。 3 農(nóng)桿菌v i r 基因的活化西質(zhì)粒上的v i r 區(qū)有v i r a 、b 、c 、d 、e 、f 、g 、h 7 個操縱子共 2 4 個基因，共同起調(diào)控作用，控制t - d n a 的加工和轉(zhuǎn)移v i r 區(qū)基因活化增強(qiáng)可提高農(nóng)桿菌侵染 能力，常用的v i r 區(qū)基因誘導(dǎo)物是乙酰丁香酮( g o d w i n ，1 9 9 1 ) 也有實驗認(rèn)為a s 對轉(zhuǎn)化效率影 響不大蘋果葉片轉(zhuǎn)化中發(fā)現(xiàn)，與a s 同時加入誘導(dǎo)穩(wěn)定劑甜菜堿或脯氨酸。對v i r 基因活化有協(xié) 同作用( j a m e s ，1 9 9 3 ) p h 值對v 證區(qū)的活化影響明顯，章魚堿型和農(nóng)桿菌堿型菌系比胭脂堿型 需要更低的p h 值植物組織培養(yǎng)基中的p h 值一般為5 8 ( g o d w m 等，1 9 9 1 ；h o l f o r d 等。1 9 9 2 ) ， 利于v i r 基因的活化。v i r 基因活化還受溫度的影響。v i r d 及v i t g 的活化必須低于2 8 ；培養(yǎng)基 中的糖或高濃度的肌醇可促進(jìn)v 缸基因表達(dá)( m a y e r h o f e r 等，1 9 9 1 ) 4 侵染時間和共培養(yǎng)時問合適的侵染時間和共培養(yǎng)時問，有利于t - d n a 充分切割、轉(zhuǎn)移和 整合，提高轉(zhuǎn)化效率，同時還能兼顧到后續(xù)培養(yǎng)過程中的除菌工作蘋果對農(nóng)桿菌較為敏感，侵 染時間多在5 1 0r a i n ，共培養(yǎng)時間一般為2 - 4 d 5 激素配比共培養(yǎng)時，培養(yǎng)基用高濃度細(xì)胞分裂素要比用高濃度生長素轉(zhuǎn)化效果好( 張士宏 等，1 9 9 8 ) ，人工合成的細(xì)胞分裂素t d z 誘導(dǎo)不定芽分化比z t 、b a 、z i p 等有效，但并不能提高 蘋果的轉(zhuǎn)化頻率( w e l a n d e r 。1 9 9 8 ) 6 碳源和固化劑果樹轉(zhuǎn)化時常用3 0 9 - l - 1 蔗糖作為碳源b o n d t 等( 1 9 9 6 ) 轉(zhuǎn)化蘋果，用 2 0 9 l - 1 的果糖、半乳糖、蔗糖，葡萄糖、山梨醇作為篩選培養(yǎng)基碳源，發(fā)現(xiàn)果糖和半乳糖對轉(zhuǎn) 化效率有明顯的抑制作用蔗糖和葡萄糖能獲得較高的轉(zhuǎn)化頻率，丙山梨醇的效果則不及后兩者 好遺傳轉(zhuǎn)化中，用瓊脂固化培養(yǎng)基，葉片有時容易褐化用z 5r l 1 g e l r i t e 代替7g - u 1 a g a r 獲得 了較好的效果( y a o ，1 9 9 9 ) b o l a r 等( 1 9 9 9 ) 用5 2 9 - l l a g a r + 0 1 9 l 1 g e l r i t e 或3 5g l a a g a r + 1 2 g l - 1 g e l f i t e 做固化劑，在蘋果上獲得1 2 的轉(zhuǎn)化頻率 1 1 7 轉(zhuǎn)基因果樹產(chǎn)業(yè)化現(xiàn)狀 全球農(nóng)作物基因工程正在進(jìn)入一個飛速發(fā)展的時期，越來越多的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品正在進(jìn)入市場， 并逐步產(chǎn)生巨大的經(jīng)濟(jì)效益由于果樹轉(zhuǎn)化存在一些技術(shù)上的困難，與現(xiàn)在種植面積廣泛的轉(zhuǎn)基 因農(nóng)作物相比，目前獲得商品化生產(chǎn)的轉(zhuǎn)基因果樹很少美國研究者分離出番木瓜環(huán)斑病病毒外 殼蛋白基因，并用基因槍將這一基因?qū)敕竟现?，? 9 9 2 年培育出抗病的番木瓜品種( f i c h m m ，1 9 9 2 ) ，并于1 9 9 7 年獲得美國國家環(huán)保局和國家食品與藥品管理局登記，這是全球首例進(jìn) 入商品化應(yīng)用的多年生轉(zhuǎn)基因果樹品種，成為繼大豆、玉米、棉花、油菜、馬鈴薯和南瓜之后的 6 中國農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文第一章前言 第七大轉(zhuǎn)基因作物，但其總面積仍沒有超過1 0 萬h m 2 。 許多轉(zhuǎn)基因果樹正處于田問試驗階段，包括抗病蟲的蘋果、葡萄、菠蘿，李，樹莓、草莓、 蔓越橘和核桃；抗除草劑的草莓和歐洲栗；導(dǎo)入m 基因改進(jìn)農(nóng)藝性狀的獼猴桃、草莓和李，改善 貯藏性能的蘋果、番木瓜、草莓、樹莓和菠蘿，改變成花特性及提早開花的菠蘿和蘋果；導(dǎo)入生 長素基因以改善加工性狀的葡萄、草莓和樹莓；反義導(dǎo)入多酚氧化酶基因旨在減輕果實褐變的葡 萄；導(dǎo)入甜蛋白基因的菠蘿等( 楊莉，2 0 0 3 ) 總體來說，轉(zhuǎn)基因果樹的商品化生產(chǎn)仍處起步階段，今后的應(yīng)加強(qiáng)果樹遺傳轉(zhuǎn)化體系的研究， 提高轉(zhuǎn)化率；加強(qiáng)果實風(fēng)味等果樹特有性狀的遺傳基礎(chǔ)研究，分離相應(yīng)基因；提倡科學(xué)研究與產(chǎn) 業(yè)化推廣相結(jié)合，積極把科研成果推向生產(chǎn)，解決生產(chǎn)中可能出現(xiàn)的問題 1 2 m x l r t l 基因 鐵是植物生長發(fā)育所必需的微量元素之一，在植物體的光合作用、呼吸作用、蛋白質(zhì)和核酸 的合成等諸多生理代謝過程中發(fā)揮著極為重要的作用( t h o i r 等，1 9 9 7 ) 缺鐵可導(dǎo)致植物葉片 黃化，光合作用降低，最終造成產(chǎn)量和品質(zhì)的下降。在我國許多區(qū)域都存在果樹缺鐵問題。特別 是在干旱和半干旱的石灰性土壤區(qū)，土壤的鈣化導(dǎo)致可被果樹吸收利用的可溶性鐵的含量極低， 很多果樹表現(xiàn)出缺鐵失綠癥，給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成極大的經(jīng)濟(jì)損失，因此尋求矯治缺鐵失綠癥的各種 途徑和方法也越來越重要 m x r t l 基因是本實驗室從鐵高效型蘋果砧木小金海棠中克隆得到的( ) 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因 ( g e a b a a k 登錄號 a y l 9 3 8 8 6 ) ，e d n a 全長為1 3 9 s ，編碼區(qū)為1 0 9 s b p 該基因與玉米z 刪r n t 基因片段、擬南芥a t n i l 基因、番茄和豌豆中的該家族基因分別具有7 4 ，6 3 、7 1 和6 9 的同源性，該基因與蘋果中鐵的吸收轉(zhuǎn)運(yùn)有關(guān)( 戚金亮，2 0 0 3 ) ，期望通過基因重組的方法將此 基因轉(zhuǎn)入山定子，改善山定子容易缺鐵失綠的性狀 1 3 研究目的和意義 蘋果是重要的落葉果樹，其童期長，雜合程度高，以營養(yǎng)繁殖為主，因此其常規(guī)育種存在工 作量大，周期長，效率低等缺點，采用基因轉(zhuǎn)移技術(shù)獲得轉(zhuǎn)基因植株已經(jīng)逐漸成為蘋果育種的重 要手段由于蘋果葉片取材容易，細(xì)胞間隙大，容易由單細(xì)胞直接誘導(dǎo)分化不定芽。因此成為蘋 果遺傳轉(zhuǎn)化中主要的受體材料 本實驗受體材料山定子( m a l mb c a t ab o r k h ) 是一種重要的蘋果砧木，在我國華北和東北 地區(qū)廣為分布，具有抗寒性強(qiáng)、根系發(fā)達(dá)等優(yōu)良性狀，但在缺鐵脅迫下極易黃化，以山定子為砧 木的蘋果患黃葉病現(xiàn)象也較為普遍( 張凌云，2 0 0 2 ) ，因此通過基因工程改良山定子性狀顯得十 分重要本實驗室已建立的山定子葉片再生體系，再生率可達(dá)以上，在此基礎(chǔ)上，本實驗通 過研究農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤法轉(zhuǎn)化山定子過程中的相關(guān)因素，建立了山定子遺傳轉(zhuǎn)化體系，為山定 子生物學(xué)性狀的定向改良莫定了基礎(chǔ) 7 中國農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文 第二章材科與方法 2 1 實驗材料和試劑 2 1 1 植物材料 第二章材料和方法 山定子( 朋硝b a c mb o f l 【h ) ，來源于本實驗室保存的無菌試管苗 2 1 2 菌株和質(zhì)粒 質(zhì)粒由本實驗室保存質(zhì)粒為p b h i ( 圖2 1 ) ，含抗卡那霉素( k a n a m y c m ，l 【| m ) 的新霉素 磷酸轉(zhuǎn)移酶( n p t h ) 基因r f g h f 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因( m x 療1 ) ( 王憶，2 0 0 5 ) ，供試質(zhì)粒采用化轉(zhuǎn) 法( 金東燕，1 9 9 5 ) 轉(zhuǎn)入根癌農(nóng)桿菌臼g m k 礎(chǔ)慨n o n 咖c 婦囝魄1 0 5 中 2 1 3 試劑 圖2 - 1 檀物表達(dá)載體p b h i 結(jié)構(gòu)葡圖 f i n a l s t m c t m eo f p l a m v e c t o r p b m b a 、i a a 、n a a 及t d z 等激素購自鼎國生物試劑公司；k a n ，h y g 、o f 、c a r b 、r f f 等抗生素購自s i g m a 公司；d n t p 溶液、t a q d n a 聚合酶等生化試劑均購自s i g m a 公司 2 2 常用培養(yǎng)基和溶液配制 2 2 1 培養(yǎng)基的配制 m s 培養(yǎng)基( 1 l ) ：m s 大量元素、微量元素、有機(jī)物，3 0 9 蔗糖，7