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淋巴細(xì)胞的分離與淋巴細(xì)胞活性檢測,淋巴細(xì)胞的分離與淋巴細(xì)胞活性檢測,【實驗?zāi)康摹?.學(xué)習(xí)單個核細(xì)胞分離的基本方法，熟悉本實驗的原理與用途。2.熟悉E玫瑰花環(huán)形成的原理；了解E玫瑰花環(huán)形成的實驗方法。,外周血單個核細(xì)胞包括淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞，可根據(jù)其與其他細(xì)胞形態(tài)、體積和密度的不同進(jìn)行分離。利用聚蔗糖泛影葡胺分層液作密度梯度離心，可將不同比重的血液組分按其密度不同作相應(yīng)密度梯度分布，達(dá)到分離目的，收集到淋巴細(xì)胞。正常人和動物的T淋巴細(xì)胞表面具有能與紅細(xì)胞（RBC）表面糖肽相結(jié)合的受體（E受體），即CD2分子，是T細(xì)胞所特有的表面標(biāo)志。在體外一定條件下T細(xì)胞能直接與RBC結(jié)合，形成玫瑰花樣細(xì)胞團，稱為E玫瑰花環(huán)。常用于檢測T細(xì)胞的數(shù)量、活性及分離T細(xì)胞。,【實驗原理】,【實驗器材】略,【實驗方法】,1.小鼠摘眼球取血0.5ml，滴入裝有0.5ml肝素的試管A內(nèi)搖勻，Hanks液對倍稀釋。2.將上述抗凝血用吸管慢慢加到有2ml淋巴細(xì)胞分離液的試管B中，確保沿管壁流下的血液與分離液形成明顯的界面。3.配平試管A、B，2000rpm離心15min，小心取出。4.小心吸取B試管內(nèi)中間區(qū)域的白色霧狀薄層，移入試管C。,5.Hanks液洗2次（加Hanks液對倍稀釋,2000rpm離心10min，對半棄上清液，重復(fù)一次）。6.洗完后留下管底0.1ml液體，即為淋巴細(xì)胞懸液。7.加入0.1mlSRBC,500rpm離心5min。低速離心后能迅速形成E花環(huán)，稱為Ea花環(huán)（activeTrosette）。8.小心吸去上清，留0.1ml，輕輕吹勻，加0.8%戊二醛2滴混勻后固定2-3min。,9.取1滴懸液涂片，晾干后加瑞氏染液1滴，蓋上蓋玻片，鏡檢。10.結(jié)果判斷：凡能結(jié)合3個以上SRBC者即為E花環(huán)陽性細(xì)胞。計數(shù)200個淋巴細(xì)胞，算出花環(huán)形成細(xì)

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