BMPsⅡ型突變受體真核表達載體的構(gòu)建與鑒定.docVIP

BMPs型突變受體真核表達載體的構(gòu)建與鑒定【關(guān)鍵詞】BMPs型突變受體關(guān)鍵詞:BMPs型突變受體；真核表達載體0引言骨形成蛋白（BMPs）不僅在骨，軟骨及與骨骼有關(guān)的結(jié)締組織的形成上有重要作用，而且起著十分重要的調(diào)控作用1.與其他TGF-超家族成員一樣，BMPs在細胞表面與BMP的，型受體相互作用，型受體可以和過量的配體結(jié)合，而型受體與配體的結(jié)合則是特異性的2.tBRK3k為BMPs型突變受體，其可以阻斷BMP的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，這樣，BMP就無法發(fā)揮其骨誘導(dǎo)及在胚胎發(fā)育，器官形成及細胞分化中的作用.因此，為研究BMPs信號轉(zhuǎn)導(dǎo)在組織發(fā)育和細胞分化中的作用，我們構(gòu)建了BMPs型突變受體的真核表達載體，為此方面研究的開展奠定了基礎(chǔ).1材料和方法1.1材料pSP64TL-tBRK3k質(zhì)粒為含有BMPs型突變受體cDNA的克隆質(zhì)粒，由日本的Nohno教授（Kawasaki醫(yī)學(xué)院分子生物所）提供.真核表達載體pCDNA3（neo）購自本校生物化學(xué)教研室.限制性內(nèi)切酶及T4DNA連接酶均購自華美公司.DNA回收純化試劑盒購自原平公司.1.2酶切鑒定及回收3將pSP64TL-tBRK3k和pCDNA3（neo）用Hind和Xba雙酶切，經(jīng)0.8%瓊脂糖凝膠電泳分別得到0.6，2.9和5.4kb的片段，用試劑盒回收純化0.6kb和5.4kb的片段.1.3連接、轉(zhuǎn)化和克隆篩選3取上述tBRK3k片段5L和pCDNA3（neo）片段各2L，加入T4DNA連接酶、緩沖液和無菌水各1L，16連接過夜.制備大腸桿菌DH5的感受態(tài)并轉(zhuǎn)化.挑取單個菌落，液體LB培養(yǎng)基37振搖過夜，小提質(zhì)粒，酶切鑒定篩選出陽性克隆，命名為pC-4.2結(jié)果2.1pSP64TL-tBRK3k和pCDNA3的酶切鑒定pSP64TL-tBRK3k質(zhì)粒經(jīng)雙酶切后，得到2.9kb和0.6kb兩個片段；pCDNA3（neo）經(jīng)雙酶切后，得到一個5.4kb的片段，符合二者的物理圖譜（圖1）.圖1略2.2pC-4的酶切鑒定pC-4經(jīng)Hind和Xba雙酶切后，得到0.6kb和5.4kb兩個片段，證明tBRK3k基因已成功連入到pCDNA（neo）中（圖1）.3討論TGF-超家族的成員都結(jié)合二種特異受體發(fā)揮作用，分別叫做型受體（約5055KD）和型受體（約7080KD）4.和其他TGF-超家族成員一樣，BMPs在細胞表面與，型受體相互作用.型受體可以和過量的配體結(jié)合，而型受體與配體的結(jié)合則是特異性的.因此，為研究BMPs信號轉(zhuǎn)導(dǎo)在機體發(fā)育中的作用，我們將突變型BMPs型受體（tBRK3k）定向克隆到pCDNA3（neo）表達載體中（圖2）.圖2略pCDNA3（neo）可用于在哺乳動物細胞系表達外源基因，全長5.4kb.其表達系統(tǒng)構(gòu)件包括:CMV啟動子，SV40復(fù)制起始點，SV40polyA，SV405端和3端剪切序列等，多聚接頭有11個可供利用的單一酶切位點.pC-4真核細胞表達載體可用于研究BMPs信號對間充質(zhì)細胞分化的調(diào)控，對于研究和闡明BMPs在機體發(fā)育中的作用有重要意義.參考文獻:1WozneyJM，RosenV.Bonemorphogeneticproteinandmorpho-geneticgenefamilyinboneformationandrepairJ.ClinOr-thop，1998；346:26-37.2EstevezM，AttisanoL，WranaJLetal.Thedaf-4geneencodsabonemorphogeneticproteinreceptorcontrollingc.elegansdauerlarvadevelopmentJ.Nature，1993；365:644-649.3J.薩姆布魯克，EF.弗里奇，T.曼尼阿蒂斯.分子克隆實驗指南M.第2版.北京:科學(xué)技術(shù)出版社，1992:34-56.4HeldinCH，MiyazonoK，TenDijkeP.T