健脾化瘀方促進小鼠肝癌休眠的作用及其免疫機制研究.docVIP

健脾化瘀方促進小鼠肝癌休眠的作用及其免疫機制研究 黃旭暉張曉文梁榮華郭葦陳燕鑾王昌俊 【摘要】目的通過建立小鼠肝癌休眠模型，并予健脾化瘀法干預，研究其促進腫瘤休眠的作用及其免疫機制。方法建立小鼠肝癌休眠模型。并隨機分為4組：空白對照組、化療對照組、中藥低劑量組、中藥高劑量組，分別給予生理鹽水、卡莫氟、中劑量健脾化瘀方及高劑量健脾化瘀方進行干預。處死小鼠后，接種部位取材，免疫組化染色檢測Ki-67、TGF-、IL-10等相關(guān)指標的表達。結(jié)果腫瘤組織休眠情況：在反復外傷刺激下，空白對照組休眠率為0?；煂φ战M休眠率為80.0%。中藥低劑量組和高劑量組休眠率均為86.7%；對Ki-67增殖指數(shù)的影響：化療對照組、中藥低劑量組、中藥高劑量組與空白對照組兩兩比較，其Ki-67增殖指數(shù)均低于空白對照組（p0.05）；中藥低劑量組、中藥高劑量組與化療對照組兩兩比較，均低于化療對照組（p0.05）；而中藥低劑量組及高劑量組間兩兩比較無明顯差異（p0.05）；對TGF-表達水平的影響：化療對照組、中藥低劑量組、中藥高劑量組與空白對照組兩兩比較，空白對照組TGF-表達水平明顯高于前三組（p0.05）；但化療對照組、中藥低劑量組與中藥高劑量治療組間兩兩比較，TGF-表達水平無明顯差異（p0.05）；對IL-10表達水平的影響：化療對照組、中藥低劑量組、中藥高劑量組與空白對照組兩兩比較，空白對照組IL-10表達水平明顯高于前三組（p0.05），但化療對照組、中藥低劑量治療組及高劑量治療組間兩兩比較，IL-10表達水平無明顯差異（p0.05）。結(jié)論健脾化瘀方有促進小鼠肝癌休眠的作用，其作用機制可能與其通過調(diào)節(jié)免疫抑制腫瘤細胞的TGF-、IL-10表達有關(guān)。 【關(guān)鍵詞】健脾化瘀腫瘤休眠免疫調(diào)節(jié) 基金項目：廣東省中醫(yī)藥局建設中醫(yī)藥強省科研課題（編號：xx1259） 黃旭暉陳燕鑾王昌?。簭V東省人民醫(yī)院/廣東省醫(yī)學科學院廣東廣州510080 張曉文：廣州市體育科學研究所廣東廣州510650 梁榮華郭葦：廣州中醫(yī)藥大學廣東廣州510405 黃旭暉王昌?。簭V東省老年醫(yī)學研究所廣東廣州510080 通訊作者：王昌俊 【Abstract】ObjectiveTostudytheeffectsofJianpiHuayuformulaonthepromotionoftumordormancyandtheimmunemechanisminmicewithhepaticcarcinomabybuildingtumordormancymodelofhepatomainmouseintervenedwithJianpiHuayuformula.Methods Atumordormancymodelofhepatomainmousewasestablished.Micewererandomlydividedintofourgroups：blankcontrolgroup，chemotherapycontrolgroup，low-dosageTraditionalChinesemedicine（TCM）group，high-dosageTCMgroup，intervenedwithnormalsaline，carmofur，middle-dosageJianpiHuayuformulaandhigh-dosageJianpiHuayuformularespectively.Afterthemiceweresacrificed，immunohistochemicalstainingwasperformedinthevainatedpartsextractedfrommicetodetecttheexpressionofrelevantindicatorsincludingki-67，TGF-andIL-10.Results Tumordormancysituations：Afterrepeatedtraumaticstimulation，tumordormancyratesofblankcontrolgroupandchemotherapycontrolgroupwere0and80.0%respectively.Thetumordormancyratesoflow-dosageandhigh-dosageTCMgroupswereboth86.7%.EffectsonKi-67proliferationindex：Ki-67proliferationindexesofchemotherapycontrolgroup，low-dosageandhigh-dosageTCMgroupswerelowerthanthatofblankcontrolgroup（p0.05）.Ki-67proliferationindexesoflow-dosageandhigh-dosageTCMgroupswerelowerthanthatofchemotherapycontrolgroup（p0.05）.EffectsonexpressionsofTGF-：TheexpressionsofTGF-inchemotherapycontrolgroup，low-dosageandhigh-dosageTCMgroupsweresignificantlylowerthanthatinblankcontrolgroup（p0.05）.EffectsontheexpressionsofIL-10：TheexpressionsofIL-10inchemotherapycontrolgroup，low-dosageandhigh-dosageTCMgroupsweresignificantlylowerthanthatinblankcontrolgroup（p0.05）.ConclusionJianpiHuayuformulaplaysaroleinpromotingtumordormancyinmicewithhepaticcarcinomabyadjustingtheimmunityandsuppressingtheexpressionsofTGF-，IL-10intumorcells. 【Keywords】JianpiHuayu，Tumordormancy，Immunoregulation 【Authorsaddress】GuangdongProvincialPeoplesHospital/GuangdongAcademyofMedicalSciences/GuangdongInstituteofGerontology，Guangzhou510080，GuangdongProvince，China doi：10.3969/j.issn.1671-332X.xx.09.007 腫瘤治療的難點在于腫瘤治療后易發(fā)生復發(fā)轉(zhuǎn)移。目前研究認為，腫瘤治療后存在休眠的腫瘤細胞，其后在一定條件下，由于機體免疫功能降低，免疫監(jiān)視能力下降，腫瘤細胞通過免疫逃逸而打破休眠狀態(tài)，導致腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移和增殖1。腫瘤休眠現(xiàn)象在臨床上非常普遍，已經(jīng)被許多臨床及動物實驗證據(jù)所證實1-2。逆轉(zhuǎn)腫瘤細胞免疫逃逸和促進腫瘤細胞休眠方面的研究正成為近年來的研究熱點2。 健脾化瘀法在既往研究的體內(nèi)外實驗中均顯示出較好的抗肝癌效應。本研究擬通過建立小鼠肝癌休眠模型，并予健脾化瘀法干預，研究其促進腫瘤休眠的作用及其免疫機制，為其臨床應用及進一步研究促腫瘤休眠藥物提供依據(jù)。 1材料與方法 1.1材料 1.1.1腫瘤細胞液取68周齡的雄性昆明種小鼠，體重在2025g，予H22腹水型肝癌細胞株（由中山大學動物實驗中心提供）腹腔接種傳代，至第7天，在無菌條件下，抽取腹水3ml，顯微鏡下計數(shù)細胞數(shù)為1.0108/ml。取1ml腹水+9ml滅菌生理鹽水配制成濃度為1.0107/ml的接種用腫瘤細胞液。 1.1.2實驗動物選取68周齡的清潔級昆明種小鼠，體重在2025g，雌雄各半，共80只（由中山大學實驗動物中心提供，許可證號SYXK（粵）xx-0081）。 1.1.3藥物的制備中藥提取液：健脾化瘀方由莪術(shù)、白術(shù)、茯苓、苦參、佛手、白花蛇舌草等組成。按組方比例取藥，分別提取藥物的揮發(fā)油及水溶性成分，加入適量蒸餾水，充分混勻后制成中藥提取液，使每1.0ml中藥提取液相當于健脾化瘀方生藥1.0g，滅菌、低溫下密封保存?zhèn)溆?，每次使用前搖勻?？鞈乙海嚎℉CFU）標準品50mg（由廣東省藥檢所提供），研成均勻細末后，加入50ml蒸餾水，充分混勻后配制成混懸液，濃度為1.0mg/ml，滅菌、低溫下密封保存?zhèn)溆?，每次使用前搖勻。 1.2方法 1.2.1肝癌小鼠休眠模型的建立及分組按文中所述方法，建立肝癌小鼠休眠模型3。隨機選出60只肝癌休眠模型小鼠，并按隨機數(shù)字表法，將模型小鼠隨機分為4組：空白對照組、化療對照組、中藥低劑量組、中藥高劑量組，每組各15只模型小鼠。 1.2.2給藥方法空白對照組：分別取1.0ml生理鹽水予每只小鼠灌胃，每天1次；化療對照組：分別取0.6ml卡莫氟混懸液（用生理鹽水稀釋成1.0ml）予每只小鼠灌胃，每天1次；中藥低劑量組：分別取0.3ml中藥提取液（用生理鹽水稀釋成1.0ml）予每只小鼠灌胃，每天1次；中藥高劑量組：分別取0.5ml中藥提取液（用生理鹽水稀釋成1.0ml）予每只小鼠灌胃，每天1次；分組后第2天，全部小鼠開始給藥，同時，每2天截掉2mm長的一段尾巴作為外傷刺激，重復4次，共給藥21天。最后一次給藥后第2日，以頸椎脫臼法處死全部小鼠。 1.3標本檢測 1.3.1收集標本處死全部小鼠后，對每只小鼠進行解剖，觀察全身組織器官情況并記錄，取出模型小鼠的腋下接種處組織，制備成石蠟切片以用于檢測。 1.3.2觀察腋下腫瘤組織休眠情況每日對小鼠腋下腫瘤組織情況進行觀察并記錄，如肉眼觀察到腋下腫瘤組織生長，每日對荷瘤鼠腫瘤組織的最長徑（a）及與其垂直的最短徑（b）進行測量和記錄，對腫瘤瘤體的體積進行計算（體積公式v=1/2ab2）。 1.3.3檢測Ki-67增殖指數(shù)（PI）Ki-67染色陽性表達為細胞漿或核內(nèi)呈棕黃色或棕褐色。在低倍鏡下隨機選擇5個視野，在每個視野下?lián)Q用400倍顯微鏡，計數(shù)每個視野下腫瘤細胞總數(shù)及Ki-67陽性增生細胞數(shù)并進行記錄，每個切片至少計數(shù)1000個細胞，并按以下計算公式計算出每個切片Ki-67增殖指數(shù)，同一組取平均值，得出每組的增殖指數(shù)。Ki-67增殖指數(shù)按以下公式計算：Ki-67增殖指數(shù)（PI）=Ki-67陽性增生細胞數(shù)/腫瘤細胞總數(shù)100%。 1.3.4TGF-和IL-10的檢測陽性表達為細胞胞質(zhì)中染色呈棕黃色或棕褐色。在低倍鏡下隨機選擇5個視野，在每個視野下?lián)Q用200倍顯微鏡，計數(shù)每個視野下腫瘤細胞總數(shù)及陽性細胞數(shù)并進行記錄，按半定量方法進行評分。表達越高，其半定量分級水平越高。 1.4統(tǒng)計學分析 應用SPSS11.0統(tǒng)計軟件進行處理，各組間計數(shù)資料比較采用卡方檢驗，各組內(nèi)計量資料比較采用t檢驗，各組間計量資料比較采用方差分析，以p0.05為差異有統(tǒng)計學意義。 2結(jié)果 2.1腫瘤組織休眠情況 可以觀察到，在外傷刺激下，空白對照組小鼠腋下接種處從第9天開始肉眼可觀察到腫瘤包塊，至第16天，空白對照組全部15只小鼠肉眼可觀察到腋下接種處腫瘤包塊。而化療對照組共觀察到有3只小鼠重新出現(xiàn)腋下接種處腫瘤包塊，腫瘤休眠率為80.0%。而中藥低劑量組、中藥高劑量組各有2只小鼠重新出現(xiàn)腋下接種處腫瘤包塊，腫瘤休眠率均為86.7%，見表1。此提示經(jīng)反復外傷刺激，肝癌休眠模型小鼠體內(nèi)休眠的腫瘤細胞，可再度激活并發(fā)生重新增殖，從而導致腫瘤復發(fā)，而對于促進和維持腫瘤細胞的休眠狀態(tài)，化療對照組及中藥低劑量組、中藥高劑量組均有作用。 2.2健脾化瘀方對Ki-67增殖指數(shù)表達的影響 化療對照組、中藥低劑量組、中藥高劑量組與空白對照組兩兩比較，其Ki-67增殖指數(shù)均低于空白對照組（p0.05）；中藥低劑量組、中藥高劑量組與化療對照組兩兩比較，均低于化療對照組（p0.05）；而中藥低劑量組及高劑量組間兩兩比較無明顯差異（p0.05）；此提示，化療對照組、中藥低劑量組及高劑量組均有抑制腫瘤細胞增殖的作用，與化療對照組比較，中藥低劑量組及高劑量組抑制腫瘤細胞增殖的作用較強，但抑制腫瘤細胞增殖的作用兩中藥治療組之間差異不明顯，見表2、圖1。 2.3健脾化瘀方對TGF-表達水平的影響 化療對照組、中藥低劑量組、中藥高劑量組與空白對照組兩兩比較，其TGF-表達水平均低于空白對照組（p0.05）；中藥低劑量組、中藥高劑量組與化療對照組兩兩比較，其TGF-表達水平無明顯差異（p0.05）。此提示，對于腫瘤細胞TGF-的表達水平，化療對照組、中藥低劑量治療組及高劑量治療組均有抑制作用，但三組之間兩兩比較，其抑制作用無明顯差異，見表3、圖2。 表3各組小鼠TGF-表達水平（n，%） 2.4健脾化瘀方對IL-10表達水平的影響 化療對照組、中藥低劑量組、中藥高劑量組與空白對照組兩兩比較，其IL-10表達水平均低于空白對照組（p0.05）；中藥低劑量組、中藥高劑量組與化療對照組兩兩比較，其IL-10表達水平無明顯差異（p0.05）。此提示，對于腫瘤細胞IL-10的表達水平，化療對照組、中藥低劑量治療組及高劑量治療組均有抑制作用，但三組之間兩兩比較，其抑制作用無明顯差異。見表4、圖3。 3討論 人體在腫瘤發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移過程中形成了免疫微環(huán)境。機體免疫微環(huán)境可以有效監(jiān)視腫瘤，產(chǎn)生腫瘤免疫反應，殺傷腫瘤細胞，抑制腫瘤的生長。但腫瘤細胞可通過對自身表面抗原的修飾及分泌多種抑制性細胞因子，逃避機體免疫系統(tǒng)的監(jiān)視和殺傷，誘導腫瘤細胞免疫逃逸和耐受的發(fā)生。目前認為轉(zhuǎn)化生長因子（TGF-）和白介素-10（IL-10）是其中最重要的兩種抑制性細胞因子。 在腫瘤進展期，腫瘤細胞合成大量TGF-，隨著TGF-表達水平的升高，TGF-主要表現(xiàn)為促腫瘤生長作用4。其原因考慮與TR、TR受體的缺失、突變和/或表達水平的降低，還有TGF-/Smads信號通路的調(diào)節(jié)障礙有關(guān)。一方面，腫瘤細胞對TGF-抗增殖作用因受體和信號通路系統(tǒng)的突變產(chǎn)生抵抗，同時，TGF-本身可廣泛抑制機體免疫系統(tǒng)，阻斷淋巴細胞的正常增殖和分化，介導腫瘤細胞免疫逃逸，從而促進腫瘤的生長增殖5-6。另一方面，通過增加腫瘤細胞與胞外基質(zhì)間的作用、激活腫瘤微血管生成等，TGF-具有促進腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的作用7-8。近年來研究表明，TGF-是介導肝癌細胞免疫逃逸的主要免疫抑制因子之一，與腫瘤特別是肝癌的發(fā)生發(fā)展有著密切的關(guān)系9-10。 而IL-10在幾乎所有惡性腫瘤中表達都增強，是在腫瘤免疫中發(fā)揮著顯著作用的免疫抑制性細胞因子11-12。其主要通過抗原提呈細胞（APC），尤其是淋巴細胞而發(fā)揮其效應13。IL-l0的作用機制可能與以下因素有關(guān)：抑制T細胞，阻止CD4+T細胞的增殖，將腫瘤細胞轉(zhuǎn)化為CTL-抗性表型，使CTL失去免疫功能14；通過阻止單核細胞分化成DC，促進DC凋亡，從而減少DC的生成和表達而抑制免疫。 同時，調(diào)節(jié)性T細胞（Treg）可以與TGF-、IL-10產(chǎn)生惡性自分泌循環(huán)，具有協(xié)同效應。一方面，TGF-可促進Treg細胞的擴增，而擴增的Treg細胞又可反過來進一步促進TGF-、IL-10的分泌15-16，加強抑制效應T細胞和樹突狀細胞（DCs）的功能，如此反復循環(huán)，從而加重腫瘤免疫抑制狀態(tài)。 臨床上不同種類的腫瘤雖表現(xiàn)為脾虛濕阻、氣滯血瘀、熱毒內(nèi)蘊、氣血兩虛等不同證型，但脾虛、血瘀這一基本病機貫穿不同類型腫瘤病程的始終。以健脾益氣，化瘀散結(jié)為法的中藥復方制劑對于防治腫瘤復發(fā)和轉(zhuǎn)移在臨床和動物實驗中均具有確切的療效，顯示出較好的抗肝癌效應17-20。 本研究通過對肝癌術(shù)后休眠模型小鼠給予健脾化瘀方進行干預，同時予外傷截尾刺激以打破腫瘤細胞休眠狀態(tài)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)健脾化瘀方可抑制腫瘤細胞增殖，有促進和維持腫瘤細胞的休眠狀態(tài)的作用。而經(jīng)過健脾化瘀方干預后，中藥低劑量治療組及高劑量治療組其TGF-和IL-10表達明顯降低，說明健脾化瘀方能調(diào)節(jié)腫瘤免疫，抑制腫瘤細胞免疫抑制性細胞因子TGF-、IL-10的表達。而健脾化瘀方促進與維持腫瘤休眠的作用機制可能與其調(diào)節(jié)免疫的作用有關(guān)。 參考文獻 1戴聰.腫瘤細胞休眠與轉(zhuǎn)移的生物學特性J.國際腫瘤學雜志，xx，35（2）：142-145. 2王愛云，樊賢超，陸茵，等.以中藥誘導腫瘤休眠作為腫瘤防治策略的探討J.中草藥，xx，42（3）：598-601. 3黃旭暉，王昌俊，林舉擇，等.小鼠肝癌休眠模型的建立J.中華腫瘤防治雜志，xx，20（19）：1484-1486. 4來延奇，林森森，孫立，等.TGF對EMT的誘導及EMT抑制劑研究進展J.現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學，xx，20（8）：1746-1749. 5WAKEFIELDLM，ROBERTSABTGF-betasignaling：positiveandnegativeeffectsontumorigenesisJCurtOpinGeDev，xx，12（1）：22-29 6ROBERTSAB，WAKEFIELDLMThetwofacesoftransforminggrowthfactorbetaincarcinogenesisJProcNatlAcadSci，xx，100（15）：8621-8623 7XUZ，JIANGY，STEEDH，etalTGFandEGFsynergisticallyinduceamoreinvasivephenotypeofepithelialovariancancercellsJBiochemBiophysResCommun，xx，401（3）：376-381 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