《抗體制藥》PPT課件.ppt

第五章 抗體工程制藥,抗體藥物的生產(chǎn),傳統(tǒng)的方法抗血清 淋巴細(xì)胞的培養(yǎng) 如何獲得需要的淋巴細(xì)胞？如何體外培養(yǎng)淋巴細(xì)胞？,1997年全球抗體藥物銷售額為3.1億美元，同期全球藥品銷售額為3028億美元，市場份額為千分之一 到2008年，增長至400億美元，同期全部藥品銷售7730億美元，市場份額提升至5.2% 抗體藥物年銷售額復(fù)合增速高達(dá)56%，是總藥品銷售增速的6倍,2009年，美國FDA批準(zhǔn)的6項(xiàng)新的生物制品許可申請中，有4只產(chǎn)品屬于單抗藥物, 歐洲7個,2010年,強(qiáng)生的抗腫瘤壞死因子(TNF)-單克隆抗體Remicade銷量達(dá)74億美元 羅氏的Rituxan銷售額達(dá)到65億美元 羅氏的抗Her-2受體單克隆抗體赫賽汀 （Herceptin）銷售額達(dá)到51億美元,第一節(jié) 抗體藥物概念及其特點(diǎn),一、抗體藥物概念,通過細(xì)胞工程或基因工程生產(chǎn)的，用于診斷或治療的單克隆抗體、多克隆抗體、抗體片段、基因工程改造的抗體或免疫偶聯(lián)物統(tǒng)稱為抗體藥物,免疫偶聯(lián)物,生物導(dǎo)彈 是免疫導(dǎo)向藥物的形象稱呼 由單克隆抗體與藥物、酶、毒素或放射性同位素等配合而成,二、抗體藥物特點(diǎn),1. 特異性 1）與相關(guān)抗原的特異性結(jié)合 2）對靶細(xì)胞的選擇性 2. 多樣性 1）抗原多樣性 2）結(jié)構(gòu)多樣性 3）抗體活性的多樣性 4）免疫偶聯(lián)物和融合蛋白的多樣性,第二節(jié) 雜交瘤技術(shù)與單克隆抗體,1975年，德國學(xué)者Kohler和英國學(xué)者M(jìn)ilstein合作研究將經(jīng)綿羊紅細(xì)胞免疫后的小鼠脾細(xì)胞與小鼠骨髓瘤細(xì)胞融合，建立了能持續(xù)分泌抗棉樣細(xì)胞抗體的雜交瘤細(xì)胞，從而創(chuàng)立了具有劃時代意義的新技術(shù)，為此獲得了1984年醫(yī)學(xué)諾貝爾獎,一、抗體的種類,1. 多克隆抗體 多克隆抗體含有兩層意思：一是有含多個抗原位區(qū)的大分子刺激產(chǎn)生的、識別不同抗原位區(qū)的各種抗體；二是由體內(nèi)不同淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的、可針對同一抗原位區(qū)的多克隆抗體 2. 單克隆抗體 僅識別抗原分子上同一抗原位區(qū)的由同一克隆細(xì)胞產(chǎn)生的抗體為單克隆抗體,傳統(tǒng)抗血清,抗 原,免 疫,所有抗體混合,1,2,3,4,脾 臟,淋巴結(jié),B 細(xì)胞,二、雜交瘤及雜交瘤技術(shù),細(xì)胞雜交的含義包括同一細(xì)胞的自融合或是在誘導(dǎo)物的作用下不同細(xì)胞間的融合 淋巴細(xì)胞通過融合劑的作用和腫瘤細(xì)胞形成融合的雜交細(xì)胞稱雜交瘤細(xì)胞 通過腫瘤細(xì)胞和淋巴細(xì)胞的融合，用于某些細(xì)胞特性的研究和生產(chǎn)所期望的免疫分子，稱為雜交瘤技術(shù),目前雜交瘤技術(shù)在免疫學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用有兩種 B淋巴細(xì)胞雜交瘤，即用骨髓瘤細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞進(jìn)行融合而制備抗體，也是引用最廣泛的一種 T細(xì)胞雜交瘤技術(shù)，腫瘤細(xì)胞和T細(xì)胞融合而制備具有免疫活性的淋巴因子 通常人們所述的雜交瘤技術(shù)即知B淋巴細(xì)胞雜交瘤，也可稱為單克隆抗體技術(shù),三、單克隆抗體,單克隆抗體是由一個骨髓瘤細(xì)胞和一個具有分泌抗體能力的B淋巴細(xì)胞融合形成的雜交瘤細(xì)胞，通過無性繁殖形成的細(xì)胞系 而獲得的 這個細(xì)胞系的每個細(xì)胞均具有相同的特性且高度均一，這一細(xì)胞系分泌的抗體均一性極高，活性、亞基、親合力均相同,單克隆抗體的特點(diǎn),抗體結(jié)構(gòu)高度均一。抗體分子在結(jié)構(gòu)上高度均一，甚至在氨基酸的序列和空間結(jié)構(gòu)上都相同 高度特異性?？贵w識別的是抗原分子上單一的抗原位區(qū) 穩(wěn)定的生產(chǎn)特性。產(chǎn)生抗體的細(xì)胞是可以無性繁殖的細(xì)胞系,第三節(jié) 雜交瘤細(xì)胞系的建立,一、免疫B淋巴細(xì)胞的制備,1. 抗原 凡是能具有抗原性質(zhì)的物質(zhì)均可制備單克隆抗體，抗原可以是全病毒、亞單位或純化分子，也可以是蛋白質(zhì)、多糖、脂類等 用于制備單克隆抗體的抗原在理論上講，純度要求就可以不高，也可以使混合抗原,2. 免疫,動物的選擇 目前常用的骨髓瘤細(xì)胞系來自BALB/c小鼠和Lou大鼠 免疫方法 A. 體內(nèi)免疫法 B. 脾內(nèi)免疫法 C. 體外免疫法,二、 骨髓瘤細(xì)胞的選擇,在B淋巴細(xì)胞雜交瘤技術(shù)中，主要是用多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞作為親本細(xì)胞，這種細(xì)胞是來自骨髓造血細(xì)胞的一種腫瘤，分泌單一抗體的漿細(xì)胞，并且衰變成不表達(dá)自身抗體或部分表達(dá) 常見的骨髓瘤親本細(xì)胞系有Sp2/0，NS-1，Y3，YB2,三、 免疫脾細(xì)胞的制備,經(jīng)免疫的BABL/c小鼠或Lou大鼠，摘眼球、斷頸等方法處死后，無菌摘取脾臟，研磨制取B淋巴細(xì)胞懸液，經(jīng)氯化銨破碎紅細(xì)胞后，洗滌并調(diào)整到（15）X107個ml濃度備用,四、 細(xì)胞融合,將免疫脾B淋巴細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞按照（510）：1混合后離心取上清，緩慢加入分子量在40006000的50PEG 1ml，間隔1分鐘后，緩慢加入無血清培養(yǎng)基，終止融合劑的作用，經(jīng)洗滌去除融合劑后加入細(xì)胞培養(yǎng)液，分種于96孔板中,五、特異雜交瘤細(xì)胞的選擇,1. 雜交瘤細(xì)胞的選擇 融合后，有雜交瘤細(xì)胞有骨髓瘤B淋巴細(xì)胞、B淋巴瘤細(xì)胞B淋巴瘤細(xì)胞、骨髓瘤細(xì)胞骨髓瘤細(xì)胞，還有未融合的骨髓瘤細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞 一般用HAT培養(yǎng)液進(jìn)行篩選,m,核酸補(bǔ)救合成,m,核酸從頭合成,核酸,氨甲喋呤(A),(-),次黃嘌呤(H)胸苷(T),TK,HGPRT,TK-,HGPRT-,磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶,2. 特異性抗體的篩選,篩選出的雜交瘤細(xì)胞并不是都能分泌所期望的抗體，所以還要對雜交瘤細(xì)胞做的二次篩選，即對所分泌的抗體進(jìn)行檢測 一般地，細(xì)胞培養(yǎng)的上清液中，抗體可以達(dá)到每毫升微克級的水平，目前檢測方法的靈敏度都可以達(dá)到。實(shí)驗(yàn)室常用的是酶聯(lián)免疫的方法，即ELISA方法,六、雜交瘤細(xì)胞的克隆和建株,1. 雜交瘤細(xì)胞的克隆化 2. 雜交瘤細(xì)胞系建株,七、單克隆抗體的制備,1. 動物體內(nèi)誘生法 2. 體外培養(yǎng)法,八、單克隆抗體生產(chǎn)的一般流程,體外培養(yǎng)的骨髓瘤細(xì)胞 免疫純系小鼠，取脾臟細(xì)胞 體外融合 HAT選擇培養(yǎng) 抗體檢測，陽性孔 克隆化培養(yǎng)，抗體檢測 陽性克隆擴(kuò)大培養(yǎng) 凍存細(xì)胞，建立細(xì)胞庫 體外法制備單克隆抗體 體內(nèi)法制備單克隆抗體腹水 抗體檢測,第四節(jié) 基因工程抗體,鼠單抗對人而言有較強(qiáng)得免疫原性，可以產(chǎn)生較強(qiáng)的人抗鼠抗體（HAMA）反應(yīng) 生產(chǎn)成本比較高，難以大規(guī)模普及應(yīng)用,基因工程抗體優(yōu)點(diǎn),降低抗體的免疫原性。通過基因工程改造技術(shù)，可以最大程度地降低抗體的鼠源性，降低甚至是消除人體對抗體的排斥反應(yīng) 穿透力強(qiáng)。基因工程抗體分子一般比較小，更容易到達(dá)病灶的核心部位 可以根據(jù)需要，制備多用途的新型抗體 成本降低?？刹捎迷思?xì)胞、低等真核細(xì)胞和植物等多種系統(tǒng)表達(dá),一、人鼠嵌合抗體,在基因水平上將鼠源單克隆抗體可變區(qū)和人抗體恒定區(qū)連接起來并在合適的宿主細(xì)胞中表達(dá)，這種抗體稱為人鼠嵌合抗體,二、鼠單抗可變區(qū)人源化抗體,1. 改行(型)抗體 將鼠單抗的CDR區(qū)移植到人單抗的骨架區(qū)，就可能使人單抗獲得同鼠一樣的抗體特異性，并可以最大限度地降低鼠單抗的異源性，這樣就得到了改行抗體。這種改造過的抗體也稱CDR移植抗體,2. 表面氨基酸殘基的人源化鑲面抗體 將鼠單抗可變區(qū)表面暴露的骨架區(qū)氨基酸殘基中改成人源的，就成為了鑲面抗體 3. 表位印跡選擇 表位印跡選擇是一種與高效篩選噬菌體抗體庫技術(shù)相結(jié)合的人源化抗體的方法，可以通過數(shù)輪篩選得到完全人源的抗體,三、 小分子抗體,小分子抗體是完整免疫球蛋白的一部分，分子量比較小。 1）Fab片段和重組Fab。Fab片段包括重鏈Fd段（可變區(qū)和第一恒定區(qū)）和