細胞凍存與細胞復蘇標準操作規(guī)程(SOP).doc

背景知識 ：細胞培養(yǎng)的傳代及日常維持過程中，在培養(yǎng)器具、培養(yǎng)液及各種準備工作方面都需大量的耗費，而且細胞一旦離開活體開始原代培養(yǎng)，它的各種生物特性都將逐漸發(fā)生變化并隨著傳代次數的增加和體外環(huán)境條件的變化而不斷有新的變化。因此及時進行細胞凍存十分必要。細胞冷凍儲存在-70冰箱中可以保存一年之久；細胞儲存在液氮中，溫度達-196，理論上儲存時間是無限的。原理 ：細胞凍存及復蘇的基本原則是慢凍快融，實驗證明這樣可以最大限度的保存細胞活力。目前細胞凍存多采用甘油或二甲基亞砜作保護劑，這兩種物質能提高細胞膜對水的通透性，加上緩慢冷凍可使細胞內的水分滲出細胞外，減少細胞內冰晶的形成，從而減少由于冰晶形成造成的細胞損傷。復蘇細胞應采用快速融化的方法，這樣可以保證細胞外結晶在很短的時間內即融化，避免由于緩慢融化使水分滲入細胞內形成胞內再結晶對細胞造成損傷。主體內容（操作步驟）：一、材料（一）儀器 1. 凈化工作臺 2. 離心機 3. 恒溫水浴箱 4. 冰箱（4、-20、-70） 5. 倒置相差顯微鏡 6. 培養(yǎng)箱 7. 液氮冰箱 易生物儀器庫：/yp/product-list-42.html（二）玻璃器皿 1. 吸管（彎頭、直頭） 2. 培養(yǎng)瓶 3. 玻璃瓶（250ml、100ml） 4. 廢液缸（三）塑料器皿 1. 吸頭 2. 槍頭 3. 膠塞 4. 移液管（10ml） 5. 15ml離心管 6. 凍存管（12ml）（四）其他物品 1. 微量加樣槍 2. 紅血球計數板 3. 記號筆 4. 醫(yī)用橡皮膏 5. 移液槍（五）試劑 1. D-Hanks液 2. 小牛血清 3. 培養(yǎng)液 4. 雙抗（青霉素、鏈霉素） 5. 胰蛋白酶（0.08%） 6. 1NHCl 7. 7.4%NaHCO3 8. DMSO（分析純）或無色新鮮甘油 易生物試劑庫：/yp/product-list-43.html二、操作步驟（一）細胞凍存 1. 配制含10%DMSO或甘油、1020%小牛血清的凍存培養(yǎng)液； 2. 取對數生長期的細胞，用胰蛋白酶把單層生長的細胞消化下來，懸浮生長的細胞則直接將細胞移至15ml離心管中、； 3. 離心1000rpm，5min； 4. 去除胰蛋白酶及舊的培養(yǎng)液，加入適量配制好的凍存培養(yǎng)液，用吸管輕輕吹打使細胞均勻，計數，調節(jié)凍存液中細胞的最終密度為5106/ml1107 /ml； 5. 將細胞分裝入凍存管中，每管11.5 ml； 6. 在凍存管上標明細胞的名稱，凍存時間及操作者； 7. 凍存：標準的凍存程序為降溫速率-1-2/ min；當溫度達-25以下時，可增至-5-10/ min；到-100時，則可迅速浸入液氮中。也可將裝有細胞的凍存管放入-20 冰箱2h ，然后放入-70冰箱中過夜，取出凍存管，移入液氮容器內。（二） 細胞復蘇 1. 從液氮容器中取出凍存管，直接浸入37溫水中，并不時搖動令其盡快融化。 2. 從37水浴中取出凍存管，打開蓋子，用吸管吸出細胞懸液，加到離心管并滴加10倍以上培養(yǎng)液，混勻； 3. 離心， 1000rpm，5min； 4. 棄去上清液，加入含10%小牛血清培養(yǎng)液重懸細胞，計數，調整細胞密度，接種培養(yǎng)瓶，37培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)； 5. 次日更換一次培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)。三、注意事項 1從增殖期到形成致密的單層細胞以前的培養(yǎng)細胞都可以用于凍存，但最好為對數生長期細胞。在凍存前一天最好換一次培養(yǎng)液； 2將凍存管放入液氮容器或從中取出時，要做好防護工作，以免凍傷； 3凍存和復蘇最好用新配制的培養(yǎng)液。四、細胞復蘇在細胞復蘇過程中，有多次復蘇失敗，最終在查閱了相關技術積累了足夠的復蘇技能后復蘇成功，現(xiàn)將細胞復蘇的操作程序和注意事項總結如下，望能為同行提供些參考?！静牧稀?.常規(guī)細胞培養(yǎng)儀器設備、恒溫水浴振蕩器。2.培養(yǎng)液（DMEM）胎牛血清（CBS）二甲基亞砜（DMSO）?！静僮鞒绦颉?.細胞實驗室進行常規(guī)消毒，紫外照射40min以上。2.培養(yǎng)液（DMEM）、0.25胰蛋白酶（Trypsin）恒溫水浴箱370C預熱20min，備用。3.二甲基亞砜（DMSO)在4度冰箱中冷藏30min，備用。4.從液氮保存罐中取出凍存管，立即放入40度水浴中，快速搖晃，直至凍存液完全融化。5.將細胞懸液移入15ml離心管，緩慢加入4ml培養(yǎng)液，離心（1000r/min，5min）。6.用培養(yǎng)液懸液混懸沉淀細胞，調整細胞濃度，放培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。7.記錄復蘇日期?！咀⒁馐马棥?. 取細胞的過程中注意帶好防凍手套，護目鏡。此項尤為重要，細胞凍存管可能漏入液氮，解凍時凍存管中的氣溫急劇上升，可導致爆炸。2. 凍存液的問題：凍存液的配置已是常識，在這里不作詳述，但二甲基亞砜（DMSO）對細胞不是完全無毒副作用，在常溫下，二甲基亞砜對細胞的毒副作較大，因此，必須在1-2min內使凍存液完全融化。如果復蘇溫度太慢，會造成細胞的損傷，二甲基亞砜（DMSO）最好選擇進口產品。3. 離心前須加入少量培養(yǎng)液。細胞解凍后二甲基亞砜濃度較高，注意加入少量培養(yǎng)液可稀釋其濃度，以減少對細胞的損傷。4. 離心問題：目前主要有兩種見解。一種是解凍后的細胞懸液直接吹打均勻后分裝到培養(yǎng)瓶中進行培養(yǎng)，第二天換液。因為離心的目的是兩個，去除DMSO，去除死細胞，這個是標準流程，但對一般人來說，把握不好離心轉速和時間，轉的不夠活細胞沉底的少，細胞就全被扔掉了，轉過了活細胞會受壓過大，死亡。此外在操作過程中容易污染，所以不推薦。另一種說法為細胞懸液中含有二甲基亞砜（DMSO），DMSO對細胞有一定的毒副作用，所以須將離心后的液體前倒凈，且一定倒干凈。我在試驗中按照常規(guī)的離心分裝的方法進行復蘇，結果無異常。5. 細胞貼壁少的問題：教科書中說明凍存細胞解凍時1ml細胞液要加10ml15m培養(yǎng)液，而在我的試驗中的經驗總結為培養(yǎng)基越少細胞越容易貼附。6. 復蘇細胞分裝的問題：試驗中我的經驗總結為復蘇1管細胞一般可分裝到1-2只培養(yǎng)瓶中，分裝過多，細胞濃度過低，不利于細胞的貼壁。7. 加培養(yǎng)基的量放入問題：這個量的多少的把握主要涉及到的問題是DM