趙百孝灸法的創(chuàng)新應(yīng)用與臨床應(yīng)用研究.ppt

北京中醫(yī)藥大學(xué),艾蒿與艾灸生成物的成分及其效應(yīng)機(jī)制和安全性評(píng)價(jià)研究,灸法作用的基本原理與應(yīng)用規(guī)律研究,趙百孝,計(jì)劃任務(wù)完成情況,艾燃燒生成物的安全性評(píng)價(jià),第一部分：艾蒿及艾燃燒生成物的物質(zhì)基礎(chǔ)研究,課題組自從2007年起收集蘄艾，并于2009年起委托湖北蘄春縣李時(shí)珍工作辦公室負(fù)責(zé)在蘄艾生產(chǎn)和質(zhì)量體系建設(shè)試驗(yàn)示范基地，每年在端午前后2個(gè)月內(nèi)，由專人定期采集蘄艾艾葉。同時(shí)，在2010端午當(dāng)天年采集了全國20個(gè)不同產(chǎn)地的艾葉。經(jīng)北京市藥品檢驗(yàn)所藥用植物專家鑒定，辨別出湖北蘄春等16個(gè)產(chǎn)地的為正品艾葉（Artemisia argyi Levl.et Vant.），其它4個(gè)為偽品艾葉。 艾絨及艾條的收集與制備：用于艾絨揮發(fā)油成分及煙氣分析的艾絨由課題組自行制備，用于毒理學(xué)及臨床研究艾絨和艾條，委托河南南陽漢醫(yī)艾絨廠按要求制備。此外，還收集了市場(chǎng)上銷售的品質(zhì)不同的艾絨和艾條產(chǎn)品，用于對(duì)照研究。,艾葉及艾絨標(biāo)本的采集制備,第一部分：艾蒿及艾燃燒生成物的物質(zhì)基礎(chǔ)研究,艾葉與艾絨的植物性狀,艾葉為菊科植物艾Artemisia argyi Levl.et Vant.的干燥葉（中國藥典2010年版），也是艾絨的主要來源。完整葉片展平后呈卵狀橢圓形，羽狀深裂，裂片橢圓狀披針形，邊緣有不規(guī)則的粗鋸齒；上表面灰綠色或深黃綠色，有稀疏的柔毛和腺點(diǎn)；下表面密生灰白色絨毛。符合中國植物志對(duì)艾的描述。,艾葉與艾絨的植物性狀,第一部分：艾蒿及艾燃燒生成物的物質(zhì)基礎(chǔ)研究,顯微鏡下可見正品艾葉的顯微結(jié)構(gòu)：主葉脈橫切面的維管束上方均有厚壁細(xì)胞，艾葉主葉脈橫切面呈“D”型，且維管束個(gè)數(shù)較少。,艾葉與艾絨的植物性狀,第一部分：艾蒿及艾燃燒生成物的物質(zhì)基礎(chǔ)研究,光鏡下觀察可見，艾絨是由非腺毛、腺毛、殘損的維管束、細(xì)小的葉肉粉末、氣孔等構(gòu)成。其中主體部分是非腺毛（T型非腺毛居多）。,艾絨顯微結(jié)構(gòu),不同比例艾絨光鏡圖,第一部分：艾蒿及艾燃燒生成物的物質(zhì)基礎(chǔ)研究,通過GC-MS法分析2007-2009年份的蘄艾典型樣品中24種揮發(fā)油成分，從中鑒定了9個(gè)化合物：桉葉油醇、側(cè)柏酮、菊槐酮、樟腦、龍腦、4-萜烯醇、石竹烯、石竹素、刺柏腦 。,第一部分：艾蒿及艾燃燒生成物的物質(zhì)基礎(chǔ)研究,艾葉揮發(fā)油指紋圖譜研究,將各產(chǎn)地的艾葉揮發(fā)油色譜圖輸入中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2004版）共11個(gè)樣品生成共有指紋圖譜，正品相似度在81%-97%之間。,非正品艾葉揮發(fā)油與正品艾葉揮發(fā)油生成對(duì)照?qǐng)D譜比較,艾葉揮發(fā)油指紋圖譜匹配圖,第一部分：艾蒿及艾燃燒生成物的物質(zhì)基礎(chǔ)研究,研究發(fā)現(xiàn)年份越久，易揮發(fā)的成分(分子量小)相對(duì)含量越少，如桉葉油醇、側(cè)柏酮等；難揮發(fā)的成分（分子量大）相對(duì)含量較高，如刺柏腦、石竹烯、石竹素等。,第一部分：艾蒿及艾燃燒生成物的物質(zhì)基礎(chǔ)研究,不同年份、不同比例艾絨揮發(fā)油含量變化趨勢(shì)顯示，艾葉制成3:1艾絨后多種揮發(fā)性成分含量明顯降低，此后各比例艾絨揮發(fā)油含量趨于穩(wěn)定。提示3：1為艾絨加工的基礎(chǔ)比例，結(jié)合臨床研究*表明3年陳艾優(yōu)于1年艾。,第一部分：艾蒿及艾燃燒生成物的物質(zhì)基礎(chǔ)研究,艾煙成分的分析,建立了固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)測(cè)定艾煙的方法，分離出61個(gè)峰，鑒定出26種成分。檢出物質(zhì)分三部分，0-10min為有呋喃結(jié)構(gòu)的物質(zhì)，10-40min基本為芳香族化合物，40-70min為酯類、烷烴或含羥基類化合物。其中芳香族化合物多為小分子芳香烴類，未檢出苯并吡等毒性物質(zhì)。,第一部分：艾蒿及艾燃燒生成物的物質(zhì)基礎(chǔ)研究,艾絨與其他可燃材料的煙氣成分比較,艾煙與其他材料-如香煙、棉花等燃燒煙氣成分有顯著差異，其中含有大量小分子芳香烴類物質(zhì)。,艾煙,香煙,棉花,第一部分：艾蒿及艾燃燒生成物的物質(zhì)基礎(chǔ)研究,不同處理方式煙氣成分分析,定量濾紙樣品和滴有甲醇提取液的定量濾紙樣品所含成分種類較少；滴有艾葉揮發(fā)油的定量濾紙樣品色譜峰顯示的都是艾葉的揮發(fā)性成分，推測(cè)是點(diǎn)燃的瞬間揮發(fā)油受熱揮發(fā)到空氣中；用甲醇提取揮干后的艾絨樣品成分種類與艾絨燃燒后的煙氣成分相同，只是含量有所減少提示甲醇提取物對(duì)艾煙的生成有貢獻(xiàn)，但不是主要影響因素。,艾絨煙氣總離子流圖,滴有艾葉揮發(fā)油的定量濾紙樣品煙氣 總離子流圖,用甲醇提取揮干后的艾絨樣品煙氣 總離子流圖,第一部分：艾蒿及艾燃燒生成物的物質(zhì)基礎(chǔ)研究,艾絨燃燒過程煙氣成分分析,結(jié)果表明加熱溫度到達(dá)60后，揮發(fā)性成分增多，于150后達(dá)到頂點(diǎn)，進(jìn)入燃點(diǎn)后，揮發(fā)性成分濃度快速減少至低值，其他成分成為煙氣主要組成。,第一部分：艾蒿及艾燃燒生成物的物質(zhì)基礎(chǔ)研究,實(shí)驗(yàn)室特定條件下，樣品燃燒產(chǎn)生的苯甲醛、苯酚、鄰位甲酚、萘的濃度在0.56-2.07、4.37-16.69、1.31-4.16、1.03-6.27mg/m之間； 臨床診室艾煙中四種成分的實(shí)測(cè)濃度為其1/9； 苯甲醛是一種天然的植物揮發(fā)油，常用于香精、香料等，無毒無害；而風(fēng)險(xiǎn)物質(zhì)苯酚、鄰位甲酚、萘的濃度大大低于國家限量標(biāo)準(zhǔn)。（10mg/m，10 mg/m，50 mg/m PC-TWA工作場(chǎng)所有害因素危害特性實(shí)用手冊(cè)）,艾煙中主要成分的含量測(cè)定,第一部分：艾蒿及艾燃燒生成物的物質(zhì)基礎(chǔ)研究,艾燃燒灰燼色譜分析,灰燼中殘留有機(jī)物質(zhì)量極少； 所含物質(zhì)為含共軛體系的烯烴或芳香族化合物。,第一部分：艾蒿及艾燃燒生成物的物質(zhì)基礎(chǔ)研究,艾煙指紋圖譜研究,研究建立了艾煙指紋圖譜。將各艾煙樣品色譜圖輸入中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2004版），生成共有指紋圖譜，相似度在88.7-99.7%之間，可以用于控制艾煙質(zhì)量。,艾煙指紋圖譜匹配圖,艾煙生成對(duì)照?qǐng)D譜,第一部分：艾蒿及艾燃燒生成物的物質(zhì)基礎(chǔ)研究,第一部分：艾蒿及艾燃燒生成物的物質(zhì)基礎(chǔ)研究,1 利用指紋和特征圖譜，通過matlab的主成分分析法，將不同精細(xì)度的艾絨分別聚類，結(jié)果與直觀分析結(jié)果基本一致； 2 南陽陳艾條艾絨、黃金艾絨等離散樣品，煙氣分析存在差異，提示其質(zhì)量存疑。,第一部分：艾蒿及艾燃燒生成物的物質(zhì)基礎(chǔ)研究,第一部分：艾蒿及艾燃燒生成物的物質(zhì)基礎(chǔ)研究,建立了艾葉揮發(fā)性成分指紋圖譜，可準(zhǔn)確區(qū)分正品與偽品，形成了艾葉質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)草案，填補(bǔ)了當(dāng)前艾葉質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)空白。 艾絨中揮發(fā)性成分隨著儲(chǔ)存時(shí)間延長(zhǎng)和加工比例提高，含量明顯減少，組成比例發(fā)生改變，提示傳統(tǒng)艾絨加工方式主要是減少揮發(fā)油含量，調(diào)整組成。表明3:1是艾絨加工的基礎(chǔ)比例。 艾煙分析結(jié)果表明，其穩(wěn)定組成包括大量的小分子芳香類化合物、少量的揮發(fā)油類物質(zhì)。該組成與其他煙氣相比具有特征性。 首次建立了艾煙的指紋圖譜和數(shù)字特征圖譜，可用于控制和評(píng)價(jià)煙氣質(zhì)量，形成穩(wěn)定的煙氣化學(xué)模型，為課題研究提供質(zhì)控方法。,小 結(jié),計(jì)劃任務(wù)完成情況,艾燃燒生成物的安全性評(píng)價(jià),第二部分：艾燃燒生成物的安全性評(píng)價(jià),第二部分：艾燃燒生成物的安全性評(píng)價(jià),艾煙2729mg/m3組未發(fā)現(xiàn)毒性反應(yīng)；中、高劑量組均出現(xiàn)體重降低、肺功能cdyn下降；高劑量組引起WBC和PLT等降低、Tbill升高及肺臟病理改變。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：低劑量組（2729mg/m3）為無毒性反應(yīng)劑量；中劑量（160180mg/m3）、高劑量組（380400mg/m3）出現(xiàn)毒性反應(yīng)，主要表現(xiàn)為可逆性的血液細(xì)胞減少反應(yīng)和呼吸系統(tǒng)慢性炎癥反應(yīng)伴肺功能降低。 本實(shí)驗(yàn)中的低、中、高三種濃度，分別相當(dāng)于臨床診室艾煙濃度的10倍，60倍，130倍。,長(zhǎng)期毒性實(shí)驗(yàn),第二部分：艾燃燒生成物的安全性評(píng)價(jià),第二部分：艾燃燒生成物的安全性評(píng)價(jià),細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)：CHO細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度IC50為0.087 mg/ml。 染色體畸變實(shí)驗(yàn)：樣品濃度為0.01mg/ml時(shí)致CHO細(xì)胞染色體畸變?cè)黾? 微核細(xì)胞實(shí)驗(yàn)：樣品濃度為0.01mg/ml時(shí)致CHO細(xì)胞染色體斷裂增加; 鼠傷寒沙門氏菌回復(fù)突變(Ames)：陽性。,特殊毒理實(shí)驗(yàn),第二部分：艾燃燒生成物的安全性評(píng)價(jià),低劑量（2.53.5mg/m3 ）艾煙對(duì)小鼠精神神經(jīng)系統(tǒng)無明顯影響，但中（8.010.0mg/m3 ）、高劑量(27.029.0mg/m3 )對(duì)小鼠有一定的鎮(zhèn)靜催眠作用。,第二部分：艾燃燒生成物的安全性評(píng)價(jià),艾煙未引起豚鼠全身過敏反應(yīng)。,艾煙未引起家兔的眼刺激性反應(yīng)，對(duì)眼無刺激性。,艾煙樣品未引起豚鼠皮膚過敏反應(yīng),艾煙的過敏和刺激性實(shí)驗(yàn)研究,呼吸道刺激性實(shí)驗(yàn),艾煙未引起家兔的呼吸道刺激性反應(yīng)，對(duì)呼吸道無刺激性。,第二部分：艾燃燒生成物的安全性評(píng)價(jià),長(zhǎng)期毒性（6個(gè)月，20min/天）實(shí)驗(yàn)表明，臨床艾煙濃度60倍時(shí)方出現(xiàn)毒性反應(yīng)。 長(zhǎng)期毒理實(shí)驗(yàn)（3個(gè)月，200min/天）表明艾煙濃度在艾灸診室的平均濃度、3倍濃度、9倍濃度時(shí)未見毒性反應(yīng)。,小 結(jié),特殊毒理實(shí)驗(yàn)的體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果陽性應(yīng)結(jié)合長(zhǎng)期的生殖毒性試驗(yàn)和哺乳動(dòng)物長(zhǎng)期致癌試驗(yàn)進(jìn)一步研究。 根據(jù)大鼠與人的劑量換算關(guān)系得出人體的無毒性反應(yīng)濃度為27mg/m3。實(shí)測(cè)診室平均濃度為2.53.5mg/m3，說明艾灸診室煙氣濃度在安全范圍內(nèi)。,計(jì)劃任務(wù)完成情況,艾燃燒生成物的安全性評(píng)價(jià),第三部分：艾燃燒生成物的效應(yīng)機(jī)制研究,第三部分：艾燃燒生成物的效應(yīng)機(jī)制研究,艾灸與香煙灸（神闕穴）對(duì)高脂血癥模型大鼠影響的比較研究,香煙灸,大鼠毛色深黃色，體型偏小，體重明顯減輕。,升高血脂TC、LDL-C含量，升高全血和血漿粘度,香煙組肝細(xì)胞體積增大，中度脂肪變性，大量肝細(xì)胞空泡化，肝細(xì)胞腫脹明顯,炎癥細(xì)胞浸潤(rùn),(艾煙濃度為臨床診室濃度10倍),(香煙濃度與艾煙濃度相同),第三部分：艾燃燒生成物的效應(yīng)機(jī)制研究,艾煙樣品可以提高大鼠肺泡巨噬細(xì)胞NR8383的吞噬功能。 NR8383細(xì)胞的ROS隨著艾煙冷凝物濃度的升高而呈現(xiàn)出降低的趨勢(shì)。 隨著艾煙樣品染毒濃度的增加和時(shí)間的增長(zhǎng)，NR8383 細(xì)胞的增殖出現(xiàn)先增強(qiáng)后抑制的現(xiàn)象。,艾煙樣品對(duì)大鼠肺泡巨噬細(xì)胞NR8383 的活性研究,第三部分：艾燃燒生成物的效應(yīng)機(jī)制研究,艾煙對(duì)健康人群心率變異性的影響,臨床觀察發(fā)現(xiàn)試驗(yàn)組與對(duì)照組受試者在受試期間皆出現(xiàn)心率變異性各項(xiàng)指標(biāo)升高現(xiàn)象。 試驗(yàn)組各項(xiàng)指標(biāo)改變率顯著高于對(duì)照組 提示：艾煙具有提高心率變異性，調(diào)整自主神經(jīng)功能的作用。,第三部分：艾燃燒生成物的效應(yīng)機(jī)制研究,艾煙對(duì)高脂血癥大鼠的脂質(zhì)代謝有一定的良性調(diào)節(jié)作用。 艾煙樣品對(duì)巨噬細(xì)胞NR8383的吞噬功能隨著艾煙樣品濃度的升高而呈現(xiàn)出增強(qiáng)的趨勢(shì)，而NR8383細(xì)胞的ROS隨著艾煙樣品濃度的升高而呈現(xiàn)出降低的趨勢(shì)。 艾煙可以健康人群心率變異性，對(duì)植物神經(jīng)功能具有一定的調(diào)節(jié)作用。,小 結(jié),研究水平與創(chuàng)新性,首次研究并形成了艾煙的指紋圖譜和數(shù)字特征圖譜，建立了艾燃燒生成物的化學(xué)評(píng)價(jià)與控制模型。,通過系統(tǒng)研究證明艾燃燒生成物是艾灸作用機(jī)制之一。從而證實(shí)了課題提出的“艾燃燒生成物是艾灸效應(yīng)中的一個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)”的研究假說。,闡明艾絨的制備和儲(chǔ)藏目的在于減少艾葉中揮發(fā)性成分，改變組成比例。揭示了艾絨傳統(tǒng)加工、儲(chǔ)存方式的科學(xué)內(nèi)涵。,首次明確了艾燃燒生成物主要是煙氣，主要來自特定植物組織的燃燒，揮發(fā)性成分的貢獻(xiàn)較少。含有大量小分子芳香族化合物是艾煙特征。,首次開展系統(tǒng)的艾煙毒理學(xué)研究，證明了在臨床艾灸環(huán)境的安全性。解除了長(zhǎng)期以來民眾對(duì)艾煙安全性的擔(dān)憂。,1,2,3,4,5,操作繁瑣，費(fèi)時(shí)費(fèi)力,溫度不穩(wěn)定，容易造成燙傷,艾灸煙霧的安全性問題,現(xiàn)代針灸發(fā)展中面臨很大危機(jī)（理療、艾灸本身的缺陷）,器械研發(fā)不足，技術(shù)落后,艾灸療法的創(chuàng)新,各種艾灸用具,日本 韓國,各種艾