生物選修一_思考題答案.docx

專題1 傳統(tǒng)發(fā)酵技術(shù)的應(yīng)用課題1 果酒和果醋的制作實(shí)驗(yàn)案例制作葡萄酒和葡萄醋建議將實(shí)驗(yàn)安排在秋季的9月或10月進(jìn)行。在這段時間內(nèi)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，有如下優(yōu)點(diǎn)：（1）正值收獲季節(jié)，葡萄的價格便宜，品種多樣；（2）此時葡萄上的酵母菌數(shù)量多且生活力強(qiáng)，發(fā)酵釀酒的效果好；（3）溫度適宜，發(fā)酵現(xiàn)象非常明顯。實(shí)驗(yàn)的具體操作步驟如下。1.對發(fā)酵瓶、紗布、榨汁機(jī)、盛葡萄汁的器皿等實(shí)驗(yàn)用具進(jìn)行清洗并消毒。先用溫水反復(fù)沖洗幾次,再用體積分?jǐn)?shù)為75%的酒精擦拭消毒，晾干待用。2. 取葡萄500 g，去除枝梗和腐爛的子粒。3. 用清水沖洗葡萄12遍除去污物，注意不要反復(fù)多次沖洗。4. 用榨汁機(jī)榨取葡萄汁后，將其裝入發(fā)酵瓶中（裝置參見教材圖1-4b），或?qū)⑵咸汛虺蓾{后，用潔凈的紗布過濾至發(fā)酵瓶中，蓋好瓶蓋。如果沒有合適的發(fā)酵裝置，可以用500 mL的塑料瓶替代，但注入的果汁量不要超過塑料瓶總體積的2/3。5. 將發(fā)酵瓶置于適宜的溫度下發(fā)酵。6. 由于發(fā)酵旺盛期CO2的產(chǎn)量非常大，因此需要及時排氣，防止發(fā)酵瓶爆裂。如果使用簡易的發(fā)酵裝置，如瓶子（最好選用塑料瓶），每天要擰松瓶蓋24次，進(jìn)行排氣。7. 10 d以后，可以開始進(jìn)行取樣檢驗(yàn)工作。例如，可以檢驗(yàn)酒味、酒精的含量、進(jìn)行酵母菌的鏡檢等工作。8. 當(dāng)果酒制成以后，可以在發(fā)酵液中加入醋酸菌或醋曲，然后將裝置轉(zhuǎn)移至3035 的條件下發(fā)酵，適時向發(fā)酵液中充氣。如果找不到醋酸菌菌種或醋曲，可嘗試自然接種，但效果不是很好。如果沒有充氣裝置，可以將瓶蓋打開，在瓶口蓋上紗布，以減少空氣中塵土等的污染。課題成果評價（一）果酒的制作是否成功發(fā)酵后取樣，通過嗅味和品嘗進(jìn)行初步鑒定。此外，還可用顯微鏡觀察酵母菌，并用重鉻酸鉀檢驗(yàn)酒精的存在。如果實(shí)驗(yàn)結(jié)果不理想，請學(xué)生分析失敗原因，然后重新制作。（二）果醋的制作是否成功首先通過觀察菌膜的形成、嗅味和品嘗進(jìn)行初步鑒定，再通過檢測和比較醋酸發(fā)酵前后的pH作進(jìn)一步的鑒定。此外，還可以通過在顯微鏡下觀察發(fā)酵液中是否有醋酸菌，并統(tǒng)計(jì)其數(shù)量作進(jìn)一步鑒定。答案和提示（一）旁欄思考題1.你認(rèn)為應(yīng)該先沖洗葡萄還是先除去枝梗？為什么？答：應(yīng)該先沖洗，然后再除去枝梗，以避免除去枝梗時引起葡萄破損，增加被雜菌污染的機(jī)會。2.你認(rèn)為應(yīng)該從哪些方面防止發(fā)酵液被污染？提示：需要從發(fā)酵制作的過程進(jìn)行全面的考慮。例如，榨汁機(jī)、發(fā)酵裝置要清洗干凈；每次排氣時只需擰松瓶蓋、不要完全揭開瓶蓋等。3.制葡萄酒時，為什么要將溫度控制在1825 ？制葡萄醋時，為什么要將溫度控制在3035 ？答：溫度是酵母菌生長和發(fā)酵的重要條件。20 左右最適合酵母菌繁殖。因此需要將溫度控制在其最適溫度范圍內(nèi)。而醋酸菌是嗜溫菌，最適生長溫度為3035 ，因此要將溫度控制在3035 。4.制葡萄醋時，為什么要適時通過充氣口充氣？答：醋酸菌是好氧菌，在將酒精變?yōu)榇姿釙r需要氧的參與，因此要適時向發(fā)酵液中充氣。（二）資料發(fā)酵裝置的設(shè)計(jì)討論題請分析此裝置中的充氣口、排氣口和出料口分別有哪些作用。為什么排氣口要通過一個長而彎曲的膠管與瓶身連接？結(jié)合果酒、果醋的制作原理，你認(rèn)為應(yīng)該如何使用這個發(fā)酵裝置？答：充氣口是在醋酸發(fā)酵時連接充氣泵進(jìn)行充氣用的；排氣口是在酒精發(fā)酵時用來排出CO2的；出料口是用來取樣的。排氣口要通過一個長而彎曲的膠管與瓶身連接，其目的是防止空氣中微生物的污染，其作用類似巴斯德的鵝頸瓶。使用該裝置制酒時，應(yīng)該關(guān)閉充氣口；制醋時，應(yīng)將充氣口連接氣泵，輸入氧氣。（三）練習(xí)2.提示：大規(guī)模生產(chǎn)時需要進(jìn)行更為全面周詳?shù)目紤]，如原料的來源與選擇、菌種的培育與選擇、發(fā)酵的設(shè)備、發(fā)酵條件的自動化控制，以及如何嚴(yán)格控制雜菌污染；等等。此外，無論是葡萄酒或葡萄醋，實(shí)驗(yàn)時所檢測的發(fā)酵液，并非商品意義上的產(chǎn)品。在實(shí)際生產(chǎn)中還需沉淀過濾、滅菌裝瓶等獲得成品酒或醋。葡萄酒還需在一定設(shè)施和條件下（如橡木桶和地窖）進(jìn)行后續(xù)發(fā)酵，以獲得特定的風(fēng)味和色澤。3.提示：需考慮廠房、設(shè)備投資、原材料采購、工人人數(shù)及工資、產(chǎn)品種類、生產(chǎn)周期、銷售渠道、利潤等問題。課題2 腐乳的制作實(shí)驗(yàn)案例制作腐乳實(shí)驗(yàn)的具體操作步驟如下。1.將豆腐切成3cm3cm1cm的若干塊。所用豆腐的含水量為70左右，水分過多則腐乳不易成形。水分測定方法如下。精確稱取經(jīng)研缽研磨成糊狀的樣品510 g (精確到0.02mg )，置于已知重量的蒸發(fā)皿中，均勻攤平后，在100105 電熱干燥箱內(nèi)干燥4 h，取出后置于干燥器內(nèi)冷卻至室溫后稱重，然后再烘30 min，直至所稱重量不變?yōu)橹?。樣品水分含量?）計(jì)算公式如下。(烘干前容器和樣品質(zhì)量-烘干后容器和樣品質(zhì)量)/烘干前樣品質(zhì)量2.將豆腐塊平放在鋪有干粽葉的盤內(nèi)，粽葉可以提供菌種，并能起到保溫的作用。每塊豆腐等距離排放，周圍留有一定的空隙。豆腐上面再鋪上干凈的粽葉。氣候干燥時，將平盤用保鮮膜包裹，但不要封嚴(yán)，以免濕度太高，不利于毛霉的生長。3.將平盤放入溫度保持在1518 的地方。毛霉逐漸生長，大約5 d后豆腐表面叢生著直立菌絲。4.當(dāng)毛霉生長旺盛，并呈淡黃色時，去除包裹平盤的保鮮膜以及鋪在上面的粽葉，使豆腐塊的熱量和水分能夠迅速散失，同時散去霉味。這一過程一般持續(xù)36 h以上。5.當(dāng)豆腐涼透后，將豆腐間連接在一起的菌絲拉斷，并整齊排列在容器內(nèi)，準(zhǔn)備腌制。6.長滿毛霉的豆腐塊（以下稱毛坯）與鹽的質(zhì)量分?jǐn)?shù)比為51。將培養(yǎng)毛坯時靠近平盤沒長直立菌絲的一面統(tǒng)一朝向玻璃瓶邊，將毛坯分層盤立擺放在容器中。分層加鹽，并隨層加高而增加鹽量，在瓶口表面鋪鹽厚些，以防止雜菌從瓶口進(jìn)入。約腌制8 d。7.將黃酒、米酒和糖，按口味不同而配以各種香辛料（如胡椒、花椒、八角茴香、桂皮、姜、辣椒等）混合制成鹵湯。鹵湯酒精含量控制在12左右為宜注。注酒精含量的高低與腐乳后期發(fā)酵時間的長短有很大關(guān)系。酒精含量越高，對蛋白酶的抑制作用也越大，使腐乳成熟期延長；酒精含量過低，蛋白酶的活性高，加快蛋白質(zhì)的水解，雜菌繁殖快，豆腐易腐敗，難以成塊。8.將廣口玻璃瓶刷干凈后，用高壓鍋在100 蒸汽滅菌30 min。將腐乳咸坯擺入瓶中，加入鹵湯和輔料后，將瓶口用酒精燈加熱滅菌，用膠條密封。在常溫情況下，一般六個月可以成熟。課題成果評價（一）是否完成腐乳的制作學(xué)生是否完成腐乳的制作依據(jù)是：能夠合理地選擇實(shí)驗(yàn)材料與用具；前期發(fā)酵后豆腐的表面長有菌絲，后期發(fā)酵制作基本沒有雜菌的污染。（二）腐乳質(zhì)量的評價制作成功的腐乳應(yīng)該具有以下特點(diǎn)：色澤基本一致、味道鮮美、咸淡適口、無異味、塊形整齊、厚薄均勻、質(zhì)地細(xì)膩、無雜質(zhì)。（三） 能否總結(jié)不同條件對腐乳風(fēng)味和質(zhì)量的影響。學(xué)生能從鹽、酒的用量、發(fā)酵的溫度、發(fā)酵時間的長短，以及香辛料等因素中的某一因素來說明其對腐乳風(fēng)味或質(zhì)量的影響。答案和提示（一）旁欄思考題1.你能利用所學(xué)的生物學(xué)知識，解釋豆腐長白毛是怎么一回事？答：豆腐上生長的白毛是毛霉的白色菌絲。嚴(yán)格地說是直立菌絲，在豆腐中還有匍匐菌絲。2.王致和為什么要撒許多鹽，將長毛的豆腐腌起來？答：鹽能防止雜菌污染，避免豆腐腐敗。3.我們平常吃的豆腐，哪種適合用來做腐乳？答：含水量為70%左右的豆腐適于作腐乳。用含水量過高的豆腐制腐乳，不易成形。4.吃腐乳時，你會發(fā)現(xiàn)腐乳外部有一層致密的“皮”。這層“皮”是怎樣形成的呢？它對人體有害嗎？它的作用是什么？答：“皮”是前期發(fā)酵時在豆腐表面上生長的菌絲（匍匐菌絲），它能形成腐乳的“體”，使腐乳成形?！捌ぁ睂θ梭w無害。（二）練習(xí)1.答：越接近瓶口，雜菌污染的可能性越大，因此要隨著豆腐層的加高增加鹽的用量，在接近瓶口的表面，鹽要鋪厚一些，以有效防止雜菌污染。課題3 制作泡菜并檢測亞硝酸鹽含量課題成果評價（一）泡菜腌制的質(zhì)量如何可以根據(jù)泡菜的色澤和風(fēng)味進(jìn)行初步的評定，還可以在顯微鏡下觀察乳酸菌形態(tài)，比較不同時期泡菜壇中乳酸菌的含量。（二）亞硝酸鹽含量的測定配制的亞硝酸鹽標(biāo)準(zhǔn)使用液與樣品液顯色后，目測比色效果如何，是否與標(biāo)準(zhǔn)液的濃度相吻合。如果不吻合，還應(yīng)在已知濃度范圍內(nèi)，改變濃度梯度，進(jìn)一步配制標(biāo)準(zhǔn)使用液。（三）是否進(jìn)行了及時細(xì)致的觀察與記錄在實(shí)驗(yàn)進(jìn)行過程中，應(yīng)及時對泡菜中亞硝酸鹽含量進(jìn)行鑒定，比較不同時期亞硝酸鹽含量的變化及其對泡菜質(zhì)量的影響。答案和提示（一）旁欄思考題1.為什么含有抗生素的牛奶不能發(fā)酵成酸奶？答：酸奶的制作依靠的是乳酸菌的發(fā)酵作用?？股啬軌驓⑺阑蛞种迫樗峋纳L，因此含有抗生素的牛奶不能發(fā)酵成酸奶。2.為什么日常生活中要多吃新鮮蔬菜，不吃存放時間過長、變質(zhì)的蔬菜？答：有些蔬菜，如小白菜和蘿卜等，含有豐富的硝酸鹽。當(dāng)這些蔬菜放置過久發(fā)生變質(zhì)（發(fā)黃、腐爛）或者煮熟后存放太久時，蔬菜中的硝酸鹽會被微生物還原成亞硝酸鹽，危害人體健康。3.為什么泡菜壇內(nèi)有時會長一層白膜？你認(rèn)為這層白膜是怎么形成的？答：形成白膜是由于產(chǎn)膜酵母的繁殖。酵母菌是兼性厭氧微生物，泡菜發(fā)酵液營養(yǎng)豐富，其表面氧氣含量也很豐富，適合酵母菌繁殖。（二）練習(xí)2.答：果酒的制作主要利用的是酵母菌的酒精發(fā)酵，果醋的制作利用的是醋酸菌將酒精轉(zhuǎn)變?yōu)榇姿岬拇x，腐乳的制作利用的主要是毛霉分泌的蛋白酶等酶類，泡菜的制作利用的是乳酸菌的乳酸發(fā)酵。傳統(tǒng)發(fā)酵技術(shù)都巧妙地利用了天然菌種，都為特定的菌種提供了良好的生存條件，最終的發(fā)酵產(chǎn)物不是單一的組分，而是成分復(fù)雜的混合物。專題2 微生物的培養(yǎng)與應(yīng)用課題1 微生物的實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)課題成果評價（一）培養(yǎng)基的制作是否合格如果未接種的培養(yǎng)基在恒溫箱中保溫12 d后無菌落生長，說明培養(yǎng)基的制備是成功的，否則需要重新制備。（二）接種操作是否符合無菌要求如果培養(yǎng)基上生長的菌落的顏色、形狀、大小基本一致，并符合大腸桿菌菌落的特點(diǎn)，則說明接種操作是符合要求的；如果培養(yǎng)基上出現(xiàn)了其他菌落，則說明接種過程中，無菌操作還未達(dá)到要求，需要分析原因，再次練習(xí)。（三）是否進(jìn)行了及時細(xì)致的觀察與記錄培養(yǎng)12 h與24 h后的大腸桿菌菌落的大小會有明顯不同，及時觀察記錄的同學(xué)會發(fā)現(xiàn)這一點(diǎn)，并能觀察到其他一些細(xì)微的變化。這一步的要求主要是培養(yǎng)學(xué)生良好的科學(xué)態(tài)度與習(xí)慣。答案和提示（一）旁欄思考題1.無菌技術(shù)除了用來防止實(shí)驗(yàn)室的培養(yǎng)物被其他外來微生物污染外，還有什么目的？答：無菌技術(shù)還能有效避免操作者自身被微生物感染。2.請你判斷以下材料或用具是否需要消毒或滅菌。如果需要，請選擇合適的方法。（1） 培養(yǎng)細(xì)菌用的培養(yǎng)基與培養(yǎng)皿（2） 玻棒、試管、燒瓶和吸管（3） 實(shí)驗(yàn)操作者的雙手答：（1）、（2）需要滅菌；（3）需要消毒。（二）倒平板操作的討論1.培養(yǎng)基滅菌后，需要冷卻到50 左右時，才能用來倒平板。你用什么辦法來估計(jì)培養(yǎng)基的溫度？提示：可以用手觸摸盛有培養(yǎng)基的錐形瓶，感覺錐形瓶的溫度下降到剛剛不燙手時，就可以進(jìn)行倒平板了。2.為什么需要使錐形瓶的瓶口通過火焰？答：通過灼燒滅菌，防止瓶口的微生物污染培養(yǎng)基。3.平板冷凝后，為什么要將平板倒置？答：平板冷凝后，皿蓋上會凝結(jié)水珠，凝固后的培養(yǎng)基表面的濕度也比較高，將平板倒置，既可以使培養(yǎng)基表面的水分更好地?fù)]發(fā)，又可以防止皿蓋上的水珠落入培養(yǎng)基，造成污染。4.在倒平板的過程中，如果不小心將培養(yǎng)基濺在皿蓋與皿底之間的部位，這個平板還能用來培養(yǎng)微生物嗎？為什么？答：空氣中的微生物可能在皿蓋與皿底之間的培養(yǎng)基上滋生，因此最好不要用這個平板培養(yǎng)微生物。（三）平板劃線操作的討論1.為什么在操作的第一步以及每次劃線之前都要灼燒接種環(huán)？在劃線操作結(jié)束時，仍然需要灼燒接種環(huán)嗎？為什么？答：操作的第一步灼燒接種環(huán)是為了避免接種環(huán)上可能存在的微生物污染培養(yǎng)物；每次劃線前灼燒接種環(huán)是為了殺死上次劃線結(jié)束后，接種環(huán)上殘留的菌種，使下一次劃線時，接種環(huán)上的菌種直接來源于上次劃線的末端，從而通過劃線次數(shù)的增加，使每次劃線時菌種的數(shù)目逐漸減少，以便得到菌落。劃線結(jié)束后灼燒接種環(huán)，能及時殺死接種環(huán)上殘留的菌種，避免細(xì)菌污染環(huán)境和感染操作者。2.在灼燒接種環(huán)之后，為什么要等其冷卻后再進(jìn)行劃線？答：以免接種環(huán)溫度太高，殺死菌種。3.在作第二次以及其后的劃線操作時，為什么總是從上一次劃線的末端開始劃線？答：劃線后，線條末端細(xì)菌的數(shù)目比線條起始處要少，每次從上一次劃線的末端開始，能使細(xì)菌的數(shù)目隨著劃線次數(shù)的增加而逐步減少，最終能得到由單個細(xì)菌繁殖而來的菌落。（四）涂布平板操作的討論涂布平板的所有操作都應(yīng)在火焰附近進(jìn)行。結(jié)合平板劃線與系列稀釋的無菌操作要求，想一想，第2步應(yīng)如何進(jìn)行無菌操作？提示：應(yīng)從操作的各個細(xì)節(jié)保證“無菌”。例如，酒精燈與培養(yǎng)皿的距離要合適、吸管頭不要接觸任何其他物體、吸管要在酒精燈火焰周圍；等等。（五）練習(xí)1.提示：可以從微生物生長需要哪些條件的角度來思考。例如，微生物的生長需要水、空氣、適宜的溫度，食品保存可以通過保持干燥、真空的條件，以及冷藏等方法來阻止微生物的生長。2.提示：可以從這三種培養(yǎng)技術(shù)的原理、操作步驟等方面分別進(jìn)行總結(jié)歸納。例如，這三種培養(yǎng)技術(shù)都需要為培養(yǎng)物提供充足的營養(yǎng)，但無土栽培技術(shù)的操作并不需要保證無菌的條件，而其他兩種技術(shù)都要求嚴(yán)格的無菌條件。3.提示：這是一道開放性的問題，答案并不惟一，重點(diǎn)在于鼓勵學(xué)生積極參與，從不同的角度思考問題。例如，正是由于證明了微生物不是自發(fā)產(chǎn)生的，微生物學(xué)才可能發(fā)展成為一門獨(dú)立的學(xué)科；巴斯德實(shí)驗(yàn)中用到的加熱滅菌的方法導(dǎo)致了有效的滅菌方法的出現(xiàn)，而這一滅菌原理也適用于食品的保存等。課題2 土壤中分解尿素的細(xì)菌的分離與計(jì)數(shù)實(shí)驗(yàn)案例土壤中某樣品細(xì)菌的分離與計(jì)數(shù)實(shí)驗(yàn)的具體操作步驟如下。1.土壤取樣 從肥沃、濕潤的土壤中取樣。先鏟去表層土3 cm左右，再取樣，將樣品裝入事先準(zhǔn)備好的信封中。2.制備培養(yǎng)基 準(zhǔn)備牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基和選擇培養(yǎng)基將菌液稀釋相同的倍數(shù)，在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上生長的菌落數(shù)目應(yīng)明顯多于選擇培養(yǎng)基上的數(shù)目，因此，牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基可以作為對照，用來判斷選擇培養(yǎng)基是否起到了選擇作用。由于初次實(shí)驗(yàn)，對于稀釋的范圍沒有把握，因此選擇了一個較為寬泛的范圍：稀釋倍數(shù)為103107。每個稀釋度下需要3個選擇培養(yǎng)基，1個牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，因此共需要15個選擇培養(yǎng)基，5個牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基。此外，還需要準(zhǔn)備8個滅菌的試管和1個滅菌的移液管。3.微生物的培養(yǎng)與觀察 參考課本中圖2-7的實(shí)驗(yàn)流程示意圖，將10 g土樣加入盛有90 mL無菌生理鹽水的錐形瓶中（錐形瓶體積為250 mL），充分搖勻，吸取上清液1 mL，轉(zhuǎn)移至盛有9 mL的生理鹽水的無菌大試管中，依次等比稀釋至107稀釋度，并按照由107103稀釋度的順序分別吸取0.1 mL進(jìn)行平板涂布操作。按照濃度從低到高的順序涂布平板，不必更換移液管。將涂布好的培養(yǎng)皿放在30 溫度下培養(yǎng)。隨著培養(yǎng)時間的延長，會有不同的菌落產(chǎn)生。比較牛肉膏培養(yǎng)基和選擇培養(yǎng)基中菌落的數(shù)量、形態(tài)等，并做好記錄。挑選選擇培養(yǎng)基中不同形態(tài)的菌落接入含酚紅培養(yǎng)基的斜面中，觀察能否產(chǎn)生如課本中圖2-10的顏色反應(yīng)。4.細(xì)菌的計(jì)數(shù) 當(dāng)菌落數(shù)目穩(wěn)定時，選取菌落數(shù)在30300的平板進(jìn)行計(jì)數(shù)。在同一稀釋度下，至少對3個平板進(jìn)行重復(fù)計(jì)數(shù)，然后求出平均值，并根據(jù)平板所對應(yīng)的稀釋度計(jì)算出樣品中細(xì)菌的數(shù)目。課題成果評價（一）培養(yǎng)物中是否有雜菌污染以及選擇培養(yǎng)基是否篩選出菌落對照的培養(yǎng)皿在培養(yǎng)過程中沒有菌落生長，說明培養(yǎng)基沒有被雜菌污染。牛肉膏培養(yǎng)基的菌落數(shù)目明顯大于選擇培養(yǎng)基的數(shù)目，說明選擇培養(yǎng)基已篩選出一些菌落。（二）樣品的稀釋操作是否成功如果得到了2個或2個以上菌落數(shù)目在30300的平板，則說明稀釋操作比較成功，并能夠進(jìn)行菌落的計(jì)數(shù)。（三）重復(fù)組的結(jié)果是否一致如果學(xué)生選取的是同一種土樣，統(tǒng)計(jì)的結(jié)果應(yīng)該接近。如果結(jié)果相差太遠(yuǎn)，教師需要引導(dǎo)學(xué)生一起分析產(chǎn)生差異的原因。答案和提示（一）旁欄思考題1.想一想，如何從平板上的菌落數(shù)推測出每克樣品中的菌落數(shù)？答：統(tǒng)計(jì)某一稀釋度下平板上的菌落數(shù)，最好能統(tǒng)計(jì)3個平板，計(jì)算出平板菌落數(shù)的平均值，然后按課本旁欄的公式進(jìn)行計(jì)算。2.為什么分離不同的微生物要采用不同的稀釋度？測定土壤中細(xì)菌的總量和測定土壤中能分解尿素的細(xì)菌的數(shù)量，選用的稀釋范圍相同嗎？答：這是因?yàn)橥寥乐懈黝愇⑸锏臄?shù)量（單位：株/kg）是不同的，例如在干旱土壤中的上層樣本中：好氧及兼性厭氧細(xì)菌數(shù)約為2 185萬，放線菌數(shù)約為477萬，霉菌數(shù)約為23.1萬。因此，為獲得不同類型的微生物，就需要按不同的稀釋度進(jìn)行分離，同時還應(yīng)當(dāng)有針對性地提供選擇培養(yǎng)的條件。（二）練習(xí)2.提示：反芻動物的瘤胃中含有大量的微生物，其中也包括分解尿素的微生物。由于瘤胃中的微生物多為厭氧菌，接觸空氣后會死亡，因此分離其中能分解尿素的微生物除了需要準(zhǔn)備選擇培養(yǎng)基外，還應(yīng)參照厭氧菌的培養(yǎng)方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。課題3 分解纖維素的微生物的分離實(shí)驗(yàn)案例土壤中纖維素分解菌的分離實(shí)驗(yàn)的具體操作步驟如下。1.土樣采集 土樣采集的方法與本專題課題2類似。土樣的采集要選擇富含纖維素的環(huán)境，這是因?yàn)樵诶w維素含量豐富的環(huán)境，通常會聚集較多的分解纖維素的微生物。如果找不到合適的環(huán)境，可以將濾紙埋在土壤中，過一個月左右也會有能分解纖維素的微生物生長。2.選擇培養(yǎng) 選擇培養(yǎng)需要的儀器有：250 mL錐形瓶、無菌稱量瓶、藥匙、1 mL和10 mL的移液管、天平、搖床、溫度計(jì)等。培養(yǎng)基的制備參照課本旁欄中的比例配制。在250 mL錐形瓶中裝入30 mL培養(yǎng)基，用8層紗布做成瓶塞，將瓶口塞緊，再在瓶塞外包裹兩層包裝紙（或報(bào)紙），用線繩扎緊，在121 下高壓蒸汽滅菌20 min。選擇培養(yǎng)的操作：稱取土樣20 g，在無菌條件下加入裝有30 mL培養(yǎng)基的搖瓶中。將搖瓶置于搖床上，在30 下振蕩培養(yǎng)12 d，至培養(yǎng)基變混濁。此時可以吸取0.1 mL培養(yǎng)液進(jìn)行梯度稀釋和涂布平板，也可以按課本中所述，重復(fù)選擇培養(yǎng)的步驟一次，然后再進(jìn)行梯度稀釋和涂布平板。3.剛果紅染色法分離 纖維素分解菌這一步所需要的儀器有：無菌培養(yǎng)皿、涂布器、1 mL移液管，裝有9mL無菌水的20 mL大試管，溫箱等。培養(yǎng)基的制備參照課本旁欄中的比例配制。在500 mL三角瓶中裝入200 mL培養(yǎng)基，在121 下高壓蒸汽滅菌20 min。倒平板操作：將滅菌后的固體培養(yǎng)基熔化，按無菌操作的要求，在無菌的培養(yǎng)皿中倒入1520 mL培養(yǎng)基，凝固后待用。制備菌懸液：按照本專題課題1的稀釋操作方法，將選擇培養(yǎng)后的培養(yǎng)基進(jìn)行等比稀釋，稀釋最大倍數(shù)至106。涂布平板：將稀釋度為104106的菌懸液各取0.1 mL，滴加在平板培養(yǎng)基上，用涂布器將菌液涂布均勻，在30 倒置培養(yǎng)，至菌落長出。每個稀釋度下需涂布3個平板，并注意設(shè)置對照。剛果紅染色的具體操作步驟參照課本資料三。課題成果評價（一）培養(yǎng)基的制作是否合格以及選擇培養(yǎng)基是否篩選出菌落：對照的培養(yǎng)基在培養(yǎng)過程中沒有菌落生長則說明培養(yǎng)基制作合格。如果觀察到產(chǎn)生透明圈的菌落，則說明可能獲得了分解纖維素的微生物。（二）分離的結(jié)果是否一致：由于在土壤中細(xì)菌的數(shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于真菌和放線菌的數(shù)量，因此最容易分離得到的是細(xì)菌。但由于所取土樣的環(huán)境不同，學(xué)生也可能得到真菌和放線菌等不同的分離結(jié)果。答案和提示（一）旁欄思考題1.本實(shí)驗(yàn)的流程與課題2中的實(shí)驗(yàn)流程有哪些異同？答：本實(shí)驗(yàn)流程與課題2的流程的區(qū)別如下。課題2是將土樣制成的菌懸液直接涂布在以尿素為惟一氮源的選擇性培養(yǎng)基上，直接分離得到菌落。本課題通過選擇培養(yǎng)，使纖維素分解菌得到增殖后，再將菌液涂布在選擇培養(yǎng)基上。其他步驟基本一致。2.為什么要在富含纖維素的環(huán)境中尋找纖維素分解菌？答：由于生物與環(huán)境的相互依存關(guān)系，在富含纖維素的環(huán)境中，纖維素分解菌的含量相對提高，因此從這種土樣中獲得目的微生物的幾率要高于普通環(huán)境。3.將濾紙埋在土壤中有什么作用？你認(rèn)為濾紙應(yīng)該埋進(jìn)土壤多深？答：將濾紙埋在土壤中能使纖維素分解菌相對聚集，實(shí)際上是人工設(shè)置纖維素分解菌生存的適宜環(huán)境。一般應(yīng)將紙埋于深約10 cm左右腐殖土壤中。4.想一想，這兩種方法各有哪些優(yōu)點(diǎn)與不足？你打算選用哪一種方法？提示：參看本課題參考資料的內(nèi)容。5.為什么選擇培養(yǎng)能夠“濃縮”所需的微生物？答：在選擇培養(yǎng)的條件下，可以使那些能夠適應(yīng)這種營養(yǎng)條件的微生物得到迅速繁殖，而那些不適應(yīng)這種營養(yǎng)條件的微生物的繁殖被抑制，因此可以起到“濃縮”的作用。（二）練習(xí)2.答：流程圖表示如下。土壤取樣選擇培養(yǎng)（此步是否需要，應(yīng)根據(jù)樣品中目的菌株數(shù)量的多少來確定）梯度稀釋將菌懸液涂布到有特定選擇作用的培養(yǎng)基上挑選單菌落發(fā)酵培養(yǎng)專題3 植物的組織培養(yǎng)技術(shù)課題1 菊花的組織培養(yǎng)課題成果評價（一）對接種操作中污染情況的分析接種34 d后，在接種操作中被雜菌污染的培養(yǎng)物會表現(xiàn)出被污染的現(xiàn)象。請學(xué)生適時統(tǒng)計(jì)污染率，分析接種操作是否符合無菌要求。（二）是否完成了對植物組織的脫分化和再分化觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果，看看是否培養(yǎng)出了愈傷組織，記錄多長時間長出愈傷組織。統(tǒng)計(jì)更換培養(yǎng)基后愈傷組織進(jìn)一步分化成根和芽的比例和時間。（三）是否進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)、對照與記錄做好統(tǒng)計(jì)和對照，填好結(jié)果記錄表，培養(yǎng)嚴(yán)謹(jǐn)?shù)目茖W(xué)態(tài)度。從實(shí)驗(yàn)的第一步開始就要求學(xué)生做好實(shí)驗(yàn)記錄，可以讓學(xué)生分組配制不同培養(yǎng)基，如誘導(dǎo)愈傷或直接分化叢芽的培養(yǎng)基，然后做不同配方的比較。（四）生根苗的移栽是否合格生根苗移栽技術(shù)的關(guān)鍵是既要充分清洗根系表面的培養(yǎng)基，又不能傷及根系。一般使用無土栽培的辦法。培養(yǎng)基質(zhì)要提前消毒，可以向培養(yǎng)基質(zhì)噴灑質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的高錳酸鉀，并用塑料薄膜覆蓋12 h。掀開塑料薄膜后24 h才能移栽。新移栽的組培苗要在溫室過渡幾天，等壯苗后再定植大田或進(jìn)行盆栽。學(xué)生可以在課后統(tǒng)計(jì)自己移栽的成活率，看看移栽是否合格。答案和提示（一）旁欄思考題1.你能說出各種營養(yǎng)物質(zhì)的作用嗎？同專題2中微生物培養(yǎng)基的配方相比，MS培養(yǎng)基的配方有哪些明顯的不同？答：微量元素和大量元素提供植物細(xì)胞生活所必需的無機(jī)鹽；蔗糖提供碳源，同時能夠維持細(xì)胞的滲透壓；甘氨酸、維生素等物質(zhì)主要是為了滿足離體植物細(xì)胞在正常代謝途徑受到一定影響后所產(chǎn)生的特殊營養(yǎng)需求。微生物培養(yǎng)基以有機(jī)營養(yǎng)為主。與微生物的培養(yǎng)不同，MS培養(yǎng)基則需提供大量無機(jī)營養(yǎng)，無機(jī)鹽混合物包括植物生長必須的大量元素和微量元素兩大類。2.你打算做幾組重復(fù)？你打算設(shè)置對照實(shí)驗(yàn)嗎？答：教師可以安排學(xué)生分組，做不同的材料或配方，最后分別匯報(bào)成果。但每種材料或配方至少要做一組以上的重復(fù)。設(shè)置對照實(shí)驗(yàn)可以取用一個經(jīng)過滅菌的裝有培養(yǎng)基的錐形瓶，與接種操作后的錐形瓶一同培養(yǎng)，用以說明培養(yǎng)基制作合格，沒有被雜菌污染。（二）練習(xí)1.答：植物組織培養(yǎng)所利用的植物材料體積小、抗性差，對培養(yǎng)條件的要求較高。用于植物組織培養(yǎng)的培養(yǎng)基同樣適合于某些微生物的生長，如一些細(xì)菌、真菌等的生長。而培養(yǎng)物一旦受到微生物的污染，就會導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)前功盡棄，因此要進(jìn)行嚴(yán)格的無菌操作。2.答：外植體的生理狀態(tài)是成功進(jìn)行組織培養(yǎng)的重要條件之一。生長旺盛的嫩枝生理狀況好，容易誘導(dǎo)脫分化和再分化。課題2 月季的花藥培養(yǎng)課題成果評價（一）選材是否恰當(dāng)選材是否成功是花藥培養(yǎng)成功的關(guān)鍵。學(xué)生應(yīng)學(xué)會通過顯微鏡觀察處于適宜發(fā)育期的花粉。（二）無菌技術(shù)是否過關(guān)如果出現(xiàn)了污染現(xiàn)象，說明某些操作步驟，如培養(yǎng)基滅菌、花蕾消毒或接種等有問題。（三）接種是否成功如果接種的花藥長出愈傷組織或釋放出胚狀體，花藥培養(yǎng)的第一步就成功了。要適時轉(zhuǎn)換培養(yǎng)基，以便愈傷組織或胚狀體進(jìn)一步分化成再生植株。答案和提示（一）旁欄思考題為什么花瓣松動會給材料的消毒帶來困難？答：花瓣松動后，微生物就可能侵入到花藥，給材料的消毒帶來困難。（二）練習(xí)1.答：F2代紫色甜玉米的基因型組成可能為Aasusu或AAsusu。如果運(yùn)用常規(guī)育種方法，將F2代中的紫色甜玉米與白色甜玉米（aasusu）進(jìn)行測交，可以選擇出基因型為AAsusu純種紫色甜玉米。但這種方法比較繁瑣，耗時也較長，需要至少三年的選種和育種時間。如果利用花藥培養(yǎng)的技術(shù)，在F1代產(chǎn)生的花粉中就可能有Asu的組合，再將花粉植株進(jìn)行染色體加倍，就可以直接得到紫色甜玉米的純合體（AAsusu）。這種方法可以大大縮短育種周期。2.答：植物組織培養(yǎng)技術(shù)與花藥培養(yǎng)技術(shù)的相同之處是：培養(yǎng)基配制方法、無菌技術(shù)及接種操作等基本相同。兩者的不同之處在于：花藥培養(yǎng)的選材非常重要，需事先摸索時期適宜的花蕾；花藥裂開后釋放出的愈傷組織或胚狀體也要及時更換培養(yǎng)基；花藥培養(yǎng)對培養(yǎng)基配方的要求更為嚴(yán)格。這些都使花藥培養(yǎng)的難度大為增加。專題4 酶的研究與應(yīng)用課題1 果膠酶在果汁生產(chǎn)中的作用課題成果評價本課題評價的重點(diǎn)應(yīng)放在對學(xué)生探究報(bào)告的評價上。報(bào)告的主要內(nèi)容應(yīng)該包括：根據(jù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)繪制出的溫度和pH對果膠酶活性影響的曲線圖；不同果膠酶用量對出汁量影響的曲線圖（在濃度和體積相同的條件下）；并最終得到果膠酶最適溫度、pH以及果膠酶的最適用量。答案和提示（一）旁欄思考題1為什么在混合蘋果泥和果膠酶之前，要將果泥和果膠酶分裝在不同的試管中恒溫處理？提示：將果泥和果膠酶分裝在不同的試管中恒溫處理，可以保證底物和酶在混合時的溫度是相同的，避免了果泥和果膠酶混合時影響混合物的溫度，從而影響果膠酶活性的問題。2在探究溫度或pH的影響時，是否需要設(shè)置對照？如果需要，又應(yīng)該如何設(shè)置？為什么？提示：需要設(shè)置對照實(shí)驗(yàn)，不同的溫度梯度之間或不同的pH梯度之間就可以作為對照，這種對照稱為相互對照。3A同學(xué)將哪個因素作為變量，控制哪些因素不變？為什么要作這樣的處理？B同學(xué)呢？ 提示：A同學(xué)將溫度或pH作為變量，控制不變的量有蘋果泥的用量、果膠酶的用量、反應(yīng)的時間和過濾的時間等。只有在實(shí)驗(yàn)中保證一個自變量，實(shí)驗(yàn)結(jié)果才能說明問題。B同學(xué)對于變量的處理應(yīng)該與A同學(xué)相同，只是觀察因變量的角度不同。4想一想，為什么能夠通過測定濾出的蘋果汁的體積大小來判斷果膠酶活性的高低？提示：果膠酶將果膠分解為小分子物質(zhì)，小分子物質(zhì)可以通過濾紙，因此蘋果汁的體積大小反應(yīng)了果膠酶的催化分解果膠的能力。在不同的溫度和pH下，果膠酶的活性越大，蘋果汁的體積就越大。5當(dāng)探究溫度對果膠酶活性的影響時，哪個因素是變量，哪些因素應(yīng)該保持不變？提示：溫度是變量，應(yīng)控制果泥量、果膠酶的濃度和用量、水浴時間和混合物的pH等所有其他條件不變。只有這樣才能保證只有溫度一個變量對果膠酶的活性產(chǎn)生影響。（二）練習(xí)答：大規(guī)模生產(chǎn)與實(shí)驗(yàn)室制備的主要不同點(diǎn)是：1.有兩次瞬間高溫滅菌；2.酶處理的時間相對較長；3.有離心分離步驟和濃縮步驟。課題2 探討加酶洗衣粉的洗滌效果實(shí)驗(yàn)方案的設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)材料：添加了復(fù)合酶的洗衣粉，大小相同的白棉布4塊（在上面分別滴加4滴同種的植物油，放置至干燥）。水溫、水質(zhì)及水量：水溫的溫度梯度為5 、15 、25 和35 （其中5 可以通過冰箱冷藏室來控制，其他溫度可以通過水浴控制）；水質(zhì)為自來水；水量為500 mL。實(shí)驗(yàn)儀器：1 000 mL的燒杯、玻璃棒等。子課題二不同種類的洗衣粉對同一污漬或不同污漬洗滌效果的比較比較子課題一與子課題二：在子課題一中，水溫是變量，其他因素在實(shí)驗(yàn)中保持不變；而在子課題二中，水溫則應(yīng)保持不變。在實(shí)施子課題二時，通常應(yīng)采用當(dāng)?shù)氐某?，如果是冬季水溫過低，就應(yīng)采用水浴的方法，使溫度達(dá)到25 35 。市場中的洗衣粉有多種類型，應(yīng)選擇不同種類的加酶洗衣粉和普通洗衣粉。污物的選擇也應(yīng)該多樣化，只有這樣才具有實(shí)踐指導(dǎo)意義。表4-2的選擇供參考，表中的“”號表示可以進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。此外，學(xué)生也可以針對污漬相同、布料（如化纖或棉布）的不同情況，探究不同種類洗衣粉的洗滌效果。不同種類的洗衣粉對同一污漬或不同污漬洗滌效果的列表比較污染物蛋白酶洗衣粉復(fù)合酶洗衣粉普通洗衣粉油漬血漬奶漬果汁漬課題成果評價本課題的評價可以分為三個方面：一是設(shè)計(jì)的實(shí)驗(yàn)方案是否思路清晰、科學(xué)性和操作性強(qiáng)；二是實(shí)驗(yàn)報(bào)告是否全面，是否涵蓋了本課題所要求達(dá)到的目標(biāo)；三是能否根據(jù)自己的探究成果，結(jié)合生活中的實(shí)際情況，設(shè)計(jì)一份宣傳板報(bào)或有關(guān)加酶洗衣粉的使用說明材料，供家人或本校的教職員工參考。學(xué)生完成課題后，應(yīng)該得出以下三方面的結(jié)論。1加酶洗衣粉與普通洗衣粉洗滌效果的比較分析。2各種不同品牌的加酶洗衣粉對油漬、血漬和奶漬等污物的不同的洗滌效果分析。3使用加酶洗衣粉時應(yīng)注意的一些事項(xiàng)。答案和提示（一）旁欄思考題1查閱資料，看看普通洗衣粉中包含哪些化學(xué)成分？提示：普通洗衣粉中通常包含有：表面活性劑、水軟化劑、堿劑、漂白劑等成分，有的洗衣粉中還含有增白劑、香精和色素，以及填充劑等。2在本課題中你打算使用什么方法和標(biāo)準(zhǔn)判斷洗滌效果？提示：可在洗滌后比較污物的殘留狀況，如：已消失、顏色變淺、面積縮小等，最好能進(jìn)行定量的比較。（二）練習(xí)1.答：列表比較如下。普通洗衣粉加酶洗衣粉相同點(diǎn)表面活性劑可以產(chǎn)生泡沫，可以將油脂分子分散開；水軟化劑可以分散污垢；等等。不同點(diǎn)酶可以將大分子有機(jī)物分解為小分子有機(jī)物，小分子有機(jī)物易于溶于水，從而與纖維分開。2.答：不合適。因?yàn)榻z綢的主要成分是蛋白質(zhì)，它會被加酶洗衣粉中的蛋白酶分解，損壞衣物。課題3 酵母細(xì)胞的固定化課題成果評價（一）觀察凝膠珠的顏色和形狀如果制作的凝膠珠顏色過淺、呈白色，說明海藻酸鈉的濃度偏低，固定的酵母細(xì)胞數(shù)目較少；如果形成的凝膠珠不是圓形或橢圓形，則說明海藻酸鈉的濃度偏高，制作失敗，需要再作嘗試。（二）觀察發(fā)酵的葡萄糖溶液利用固定的酵母細(xì)胞發(fā)酵產(chǎn)生酒精，可以看到產(chǎn)生了很多氣泡，同時會聞到酒味。教師不僅要對學(xué)生制作的固定化酵母細(xì)胞進(jìn)行評價，還要對學(xué)生的操作過程進(jìn)行評價。此外，對酵母細(xì)胞固定化原理和實(shí)驗(yàn)操作方法的理解，也應(yīng)是評價的有機(jī)組成部分。答案和提示練習(xí)1.答：直接使用酶、固定化酶和固定化細(xì)胞催化的優(yōu)缺點(diǎn)如下表所示。類型優(yōu)點(diǎn)不足直接使用酶催化效率高，低耗能、低污染等。對環(huán)境條件非常敏感，容易失活；溶液中的酶很難回收，不能被再次利用，提高了生產(chǎn)成本；反應(yīng)后酶會混在產(chǎn)物中，可能影響產(chǎn)品質(zhì)量。固定化酶酶既能與反應(yīng)物接觸，又能與產(chǎn)物分離，同時，固定在載體上的酶還可以被反復(fù)利用。一種酶只能催化一種化學(xué)反應(yīng)，而在生產(chǎn)實(shí)踐中，很多產(chǎn)物的形成都通過一系列的酶促反應(yīng)才能得到的。固定化細(xì)胞成本低，操作更容易。固定后的酶或細(xì)胞與反應(yīng)物不容易接近，可能導(dǎo)致反應(yīng)效果下降等。3.提示：可以從酶的結(jié)構(gòu)的多樣性，對理化條件的敏感程度等角度思考。專題5 DNA和蛋白質(zhì)技術(shù)課題1 DNA的粗提取與鑒定實(shí)驗(yàn)案例案例一 以雞血為實(shí)驗(yàn)材料進(jìn)行DNA的粗提取課前準(zhǔn)備本實(shí)驗(yàn)用雞血細(xì)胞做實(shí)驗(yàn)材料有兩個原因。一是因?yàn)殡u血細(xì)胞核的DNA含量豐富，材料易得；二是雞血細(xì)胞極易吸水脹破，而用動物肝臟細(xì)胞作實(shí)驗(yàn)材料常常需要勻漿和離心，對設(shè)備要求較高，操作繁瑣，歷時較長。教師可以到市場售活雞處索取雞血，所帶燒杯中必須提前放入抗凝劑檸檬酸鈉溶液。具體制備方法如下。取質(zhì)量濃度為0.1 g/mL的檸檬酸鈉溶液100 mL，置于500 mL燒杯中，注入新鮮的雞血（約180 mL），同時用玻璃棒攪拌，使血液與檸檬酸鈉溶液充分混合，以免血液凝結(jié)。將燒杯中的血液置于冰箱內(nèi)，靜置1 d，使血細(xì)胞自行沉淀。有條件的學(xué)校也可以將血液倒入離心管內(nèi)進(jìn)行離心，用2 000 r/min或3 000 r/min的轉(zhuǎn)速，離心2 min，使血細(xì)胞沉淀于離心管底部，這樣可以使血細(xì)胞沉淀更完全。用吸管除去上部的澄清液，就可以得到雞血細(xì)胞液。值得注意的是雞血細(xì)胞破碎以后釋放出的DNA，容易被玻璃容器吸附，所以在提取過程中為了減少DNA的損失，最好使用塑料的燒杯和試管盛放雞血細(xì)胞液。提取DNA的具體步驟1.破碎細(xì)胞，釋放DNA雞血細(xì)胞中的DNA與核蛋白結(jié)合，位于雞血細(xì)胞的細(xì)胞核中，正常情況下是不會釋放出來的。為了使DNA從細(xì)胞核中釋放出來，需要向雞血細(xì)胞液中加入蒸餾水，并且攪拌，從而使血細(xì)胞膜和核膜脹破。用玻璃棒攪拌可以加速細(xì)胞的破裂。注意應(yīng)沿一個方向快速攪拌，但也不能太快太猛，防止打碎DNA。一般510 mL的雞血細(xì)胞液加入20 mL蒸餾水?dāng)嚢? min。釋放出來的大量DNA和RNA往往與蛋白質(zhì)結(jié)合在一起，應(yīng)用34層紗布進(jìn)行過濾，除去一些顆粒較大的雜質(zhì)。2溶解細(xì)胞核內(nèi)的DNA在濃度較高的NaCl溶液中核蛋白容易解聚，游離出的DNA溶解在溶液中。在溶液中加入兩倍體積的濃度為2 mol/L的NaCl溶液，攪拌1 min。注意應(yīng)沿一個方向攪拌，使DNA充分溶解。3DNA的析出將溶液中的DNA與其他雜質(zhì)分離，這一步驟是實(shí)驗(yàn)成敗的關(guān)鍵。教材中列舉了提取DNA的三種方案，本案例選取方案一。加蒸餾水降低NaCl溶液濃度，使DNA析出。實(shí)驗(yàn)中應(yīng)該緩慢貼壁加入蒸餾水，并輕輕地沿一個方向不停地均勻攪拌，以利于DNA分子的附著和纏繞。同時應(yīng)注意控制加水量，使NaCl溶液的終濃度為0.10.2 mol/L。加水過程一般分三次進(jìn)行，當(dāng)總加水量為300 mL左右時，DNA已基本析出。加水太多、溶液過稀，會使DNA分子又重新溶解。用34層紗布對DNA稀釋液進(jìn)行過濾，濾去蛋白質(zhì)，收集DNA的黏稠物。如果采用離心法，效果更好。用4 000 r/min轉(zhuǎn)速的離心機(jī)，離心15 min，除去上清液(含有蛋白質(zhì))，留下的沉淀物中含有DNA。此時注意觀察DNA黏稠物的顏色。4.DNA的初步純化如果提取的DNA量不夠多且其中含有較多雜質(zhì)，或者加入溶液和攪拌等操作過程不規(guī)范，都會導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象不明顯，常常使制取的DNA粗制品不能顯示出DNA的本色白色。為了增進(jìn)實(shí)驗(yàn)效果，需要對DNA粗制品進(jìn)行簡單的提純，下面的方案可供參考。將DNA黏稠物再溶解，繼續(xù)用2 mol/L的NaCl溶液20 mL溶解DNA黏稠物，仍舊沿一個方向不停攪拌3 min，使DNA充分溶解，以免損失。用34層紗布進(jìn)行過濾（或離心），濾去雜質(zhì)，收集含有DNA的濾液。向?yàn)V液中貼壁緩慢加入50 mL預(yù)冷的體積分?jǐn)?shù)為95的乙醇，并用玻璃棒朝一個方向緩慢、均勻地?cái)嚢?，溶液中會出現(xiàn)DNA絲狀物。實(shí)驗(yàn)一般要求采用預(yù)冷的95的乙醇，但對比結(jié)果顯示，常溫下的乙醇溶液也可產(chǎn)生明顯效果。從理論上分析，預(yù)冷的乙醇溶液具有以下優(yōu)點(diǎn)。一是抑制核酸水解酶活性，防止DNA降解；二是降低分子運(yùn)動，易于形成沉淀析出；三是低溫有利于增加DNA分子柔韌性，減少斷裂。此時懸浮于溶液中的DNA絲狀物相對含雜質(zhì)較少，如果出現(xiàn)的絲狀物較少，可以將此混合液再放入冰箱中冷卻幾分鐘。濃縮后的DNA絲狀物，可以用緩緩旋轉(zhuǎn)玻璃棒的方法卷起(因?yàn)椴ＡО粲形紻NA的作用)。如果DNA絲狀物較少，不易吸附在玻璃棒上，也可以用筷子等表面粗糙的用具來幫助DNA分子纏繞。DNA的純化還有許多其他方法。例如，添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為25的十二烷基磺酸鈉(SDS)溶液，使蛋白質(zhì)變性后與DNA分開。隨后，加入氯仿異丙醇混合液（體積比為241），通過離心將蛋白質(zhì)及其他雜質(zhì)除去,取上清液。可重復(fù)上述操作幾次，直至上清液變成透明的黏稠液體。此外苯酚可以迅速使蛋白質(zhì)變性，抑制核酸酶的活性。利用苯酚處理后，離心分層，DNA溶于上層水相，蛋白質(zhì)變性存在于酚層中，這時可用分液漏斗或吸管等儀器將二者分開。教師可以根據(jù)學(xué)校的條件讓學(xué)生自己設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)方案，比較實(shí)驗(yàn)結(jié)果。5DNA的鑒定二苯胺法二苯胺試劑的配制及鑒定DNA的方法參見教科書。需要注意的是，二苯胺試劑在冰箱內(nèi)可保存6個月，使用前需搖勻。紫外燈照射法用蒸餾水配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.05%的溴化乙錠(EB)溶液，將玻璃棒上纏繞的白色絮狀物抹到蠟紙上，再滴1滴EB溶液染色。將蠟紙放在紫外燈(260 nm)下照射(暗室中)，可呈現(xiàn)橙紅色的螢光(DNA的紫外吸收高峰在260 nm處)。電泳法此方法適合鑒定純度較高的DNA。有條件的學(xué)校可以參考本專題課題2的實(shí)驗(yàn)案例和參考資料部分。案例二 以菜花為實(shí)驗(yàn)材料進(jìn)行DNA的粗提取課前準(zhǔn)備 將新鮮菜花和體積分?jǐn)?shù)為95的乙醇溶液放入冰箱冷凍室24 h。提取DNA的具體步驟1.取材 稱取30 g菜花，去梗取花，切碎。2.研磨 將碎菜花放入研缽中，倒入10 mL研磨液，充分研磨10 min。研磨液的配制方法如下。將10.1 g Tris加入到50 mL蒸餾水中，使其溶解，然后，用2 moL/L的HCl溶液調(diào)節(jié)pH至8.0，再加入8.76 g NaCl 、37.2 g EDTA 、20 g SDS。待上述藥品全部溶解后，再用蒸餾水定容至1 000 mL。教材中建議采用洗發(fā)香波、洗滌劑等一些去污劑，使植物細(xì)胞膜破碎，釋放DNA。學(xué)生可以設(shè)置對照實(shí)驗(yàn)，比較哪一種方法可以提取到純度更高的DNA。一般實(shí)驗(yàn)室提取高純度的DNA都采用一種陽離子去污劑十六烷三甲基溴化銨分離緩沖液，使細(xì)胞膜破碎，同時將DNA與植物中多糖等雜質(zhì)分開，再用氯仿異丙醇混合液（體積比為241）抽提去除雜質(zhì)蛋白，得到高純度的DNA。3.過濾 在漏斗中墊上尼龍紗布，將菜花研磨液過濾到燒杯中(有條件的學(xué)校可將濾液倒入塑料離心管中進(jìn)行離心，用1000 r/min的轉(zhuǎn)速，離心25 min，取上清液放入燒杯中)。在4 冰箱中放置幾分鐘后，再取上清液。4.沉淀 將一倍體積的上清液倒入兩倍體積的體積分?jǐn)?shù)為95的預(yù)冷乙醇溶液中，并用玻璃棒緩緩、輕輕地?cái)嚢枞芤?玻璃棒不要直插到燒杯底部)。沉淀35 min后，可見白色的DNA絮狀物出現(xiàn)。用玻璃棒緩緩旋轉(zhuǎn)，將絮狀物纏繞在玻璃棒上。課題成果評價（一）是否提取出了DNA觀察你提取的DNA顏色，如果不是白色絲狀物，說明DNA中的雜質(zhì)較多；二苯胺鑒定出現(xiàn)藍(lán)色說明實(shí)驗(yàn)基本成功，如果不呈現(xiàn)藍(lán)色，可能所提取的DNA含量低，或是實(shí)驗(yàn)操作中出現(xiàn)錯誤，需要重新制備。（二）分析DNA中的雜質(zhì)本實(shí)驗(yàn)提取的DNA粗制品有可能仍然含有核蛋白、多糖等雜質(zhì)。（三）不同實(shí)驗(yàn)方法的比較對于不同的實(shí)驗(yàn)方法，本課題可以采用分組的方法進(jìn)行研究。首先選取不同的實(shí)驗(yàn)材料，其次同種材料還可以采用不同方法，從多方面比較實(shí)驗(yàn)結(jié)果，如DNA的純度、DNA的顏色、二苯胺顯色的深淺等，看看哪種實(shí)驗(yàn)材料、哪種提取方法的效果更好。答案和提示（一）旁欄思考題1為什么加入蒸餾水能使雞血細(xì)胞破裂？答：蒸餾水對于雞血細(xì)胞來說是一種低滲液體，水分可以大量進(jìn)入血細(xì)胞內(nèi)，使血細(xì)胞脹裂，再加上攪拌的機(jī)械作用，就加速了雞血細(xì)胞的破裂(細(xì)胞膜和核膜的破裂)，從而釋放出DNA。2加入洗滌劑和食鹽的作用分別是什么？答：洗滌劑是一些離子去污劑，能溶解細(xì)胞膜，有利于DNA的釋放；食鹽的主要成分是NaCl，有利于DNA的溶解。3如果研磨不充分，會對實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生怎樣的影響？答：研磨不充分會使細(xì)胞核內(nèi)的DNA釋放不完全，提取的DNA量變少，影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果，導(dǎo)致看不到絲狀沉淀物、用二苯胺鑒定不顯示藍(lán)色等。4此步驟獲得的濾液中可能含有哪些細(xì)胞成分？答：可能含有核蛋白、多糖和RNA等雜質(zhì)。5為什么反復(fù)地溶解與析出DNA，能夠去除雜質(zhì)？答：用高鹽濃度的溶液溶解DNA，能除去在高鹽中不能溶解的雜質(zhì)；用低鹽濃度使DNA析出，能除去溶解在低鹽溶液中的雜質(zhì)。因此，通過反復(fù)溶解與析出DNA，就能夠除去與DNA溶解度不同的多種雜質(zhì)。6方案二與方案三的原理有什么不同？答：方案二是利用蛋白酶分解雜質(zhì)蛋白，從而使提取的DNA與蛋白質(zhì)分開；方案三利用的是DNA和蛋白質(zhì)對高溫耐受性的不同，從而使蛋白質(zhì)變性，與DNA分離。（二）練習(xí)1答：提取DNA的第一步是材料的選取，其目的是一定要選取DNA含量較高的生物材料，否則會由于實(shí)驗(yàn)過程中或多或少的損失而造成檢測的困難；第二步是DNA的釋放和溶解，這一步是實(shí)驗(yàn)成功與否的關(guān)鍵，要盡可能使細(xì)胞內(nèi)的DNA全部溶解；第三步是DNA的純化，即根據(jù)DNA的溶解特性、對酶及高溫的耐受性的不同等特性，最大限度地將DNA與雜質(zhì)分開；最后一步是對DNA進(jìn)行鑒定，這是對整個實(shí)驗(yàn)的結(jié)果的檢測。2答：提取蛋白質(zhì)比提取DNA的難度大。這是因?yàn)?，與DNA相比，蛋白質(zhì)對溫度、鹽濃度、pH等條件要敏感得多，很容易失活；并且蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)多種多樣，理化性質(zhì)各不相同，使得蛋白質(zhì)的提取沒有一種統(tǒng)一的方法，只能根據(jù)特定蛋白質(zhì)的特性摸索提取的條件，設(shè)計(jì)特定的方法。課題2 多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段實(shí)驗(yàn)案例PCR擴(kuò)增雙歧桿菌編碼16SrRNA的DNA片段1.雙歧桿菌的培養(yǎng)。本實(shí)驗(yàn)用雙歧桿菌作為實(shí)驗(yàn)材料，需要在實(shí)驗(yàn)前一天培養(yǎng)雙歧桿菌。雙歧桿菌的培養(yǎng)基配方如下。大豆蛋白胨5.0 g 胰胨5.0 g 酵母提取物10 g葡萄糖10 g 微量鹽溶液40 mL 半胱氨酸鹽酸鹽0.5 g0.1%（0.1 g/100 mL）刃天青 1 mL將上述物質(zhì)溶解后，用蒸餾水定容至1 000 mL，調(diào)節(jié)pH至7.0。 其中，微量鹽溶液的配方如下。CaCl2 0.2 g MgSO47H2O 0.48 g K2HPO4 1 gKH2PO4 1 g NaHCO3 10 g NaCl 2 g培養(yǎng)雙歧桿菌24 h后，將菌液進(jìn)行離心，雙歧桿菌將沉淀在試管底部。 2PCR操作。往雙歧桿菌的沉淀中加入0.2 mL裂解液（裂解液配方為50 mmol/ L 的Tris-HCl , 0.5 %的Tween 20, 1 mg/ mL的蛋白酶K，pH為8.0），使細(xì)胞裂解，釋放出DNA。將裂解液在55 溫度下加熱孵育3 h后，再在95 溫度下加熱10 min，然后立即放入冰水中冷卻。冷卻后離心，將10 L上清液轉(zhuǎn)移到0.5 mL的離心管中，然后依次加入10倍濃縮的擴(kuò)增緩沖液5 L、25 mmol/ L 的MgCl2溶液3 L，20 mmol/L的4種脫氧核苷酸的等量混合液1 L，Taq DNA聚合酶1 L(2U/L)，蒸餾水29 L，兩種引物(25 mol/ L) 各0.5 L。混勻后按教科書表格中的數(shù)據(jù)設(shè)定PCR程序，進(jìn)行