基因工程之基因操作的工具酶培訓(xùn)課件.ppt

3.3 DNA聚合酶 DNA聚合酶 ：能夠催化脫氧核糖核苷酸連續(xù)加到雙鏈DNA分子引物鏈的游離3-OH末端，使核苷酸發(fā)生聚合作用，而不從模板上解離。 反應(yīng)特點(diǎn) ： (1) 以四種三磷酸脫氧核糖核苷（dNTP）為底物 (2) 反應(yīng)需要模板的指導(dǎo)，加入的核苷酸由模板鏈所決定 (3) 聚合反應(yīng)需要有引物存在，且引物要有3-OH游離基團(tuán) (4) DNA鏈的生長方向?yàn)? 3 (5) 產(chǎn)物DNA鏈的性質(zhì)與模板相同（半保留復(fù)制）,DNA聚合酶只能在已有的核酸鏈上延伸DNA鏈，而不能從無到有開始DNA鏈的合成。 種類 ： 到目前為止，已從E.coli 中發(fā)現(xiàn)了Pol I、Pol II、Pol III三種DNA聚合酶 。其中Pol I 和Pol II的主要功能是參與DNA的修復(fù)過程，Pol III與DNA的復(fù)制有關(guān)。三種聚合酶中，只有Pol I 同分子克隆關(guān)系密切。,3.3.1 大腸桿菌DNA聚合酶 I（E.coli DNA Pol I） DNA Pol I是從大腸桿菌細(xì)胞中分離得到的，該酶是由單一多肽組成的球蛋白，MW=109000，直徑=65 DNA Pol I已得到高度純化，從100 kg大腸桿菌中可以分離到約500 mg純化的酶蛋白。每個成熟的大腸桿菌細(xì)胞中約有400個分子的Pol I。,1. DNA Pol I在空間結(jié)構(gòu)上有三個位點(diǎn)： (1) DNA模板結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合模板 (2) 核苷酸-磷酸結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合引物 (3) dNTP結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合底物,2. DNA Pol I是一種多功能酶： (1) 5 3的聚合酶活性 催化單核苷酸逐個地結(jié)合到DNA模板的3-OH末端，沿著引物的3-OH方向按模板順序從5 3延伸。 每分子DNA pol I每分鐘可以催化約1000個核苷酸的聚合。,(2) 5 3的外切酶活性 只作用于雙鏈DNA（dsDNA） ，從5端切割下一個個單核苷酸。,(3) 3 5的外切酶活性 能從游離的3末端降解單鏈DNA（ssDNA）成為單核苷酸，通常對雙鏈DNA不作用。,在正常聚合條件下，該酶對dsDNA的3 5外切酶活性受到5 3聚合酶活性的抑制。但一旦出現(xiàn)錯配堿基時，聚合反應(yīng)立即停止，由3 5外切酶迅速除去錯誤進(jìn)入的核苷酸，然后聚合反應(yīng)才得以繼續(xù)進(jìn)行下去。所以3 5核酸外切酶活力被認(rèn)為起著校對功能，對DNA復(fù)制的忠實(shí)性極為重要。,3. E.coli DNA Pol I在基因工程中的用途: (1) 可用于填補(bǔ)dsDNA上的缺口，以便有效地進(jìn)行DNA重組 (2) 用于DNA序列分析 (3) 用于制備DNA探針 在DNA分子的單鏈缺口上，DNA聚合酶I的5 3核酸外切酶活性和聚合作用可以同時發(fā)生。當(dāng)外切酶活性從缺口的5一側(cè)移去一個5核苷酸后，聚合作用就會在缺口的3一側(cè)補(bǔ)上一個新的核苷酸。隨著反應(yīng)的進(jìn)行，5一側(cè)的核苷酸不斷地被移去，3一側(cè)的核苷酸又按序地增補(bǔ)，于是缺口便沿著DNA分子按合成的方向移動缺口平移（Nick Translation）。,應(yīng)用缺口平移法制備DNA雜交探針，其典型的反應(yīng)體系是：在25 l總體積中含有1 g純化的特定的DNA片段，并加入適量的DNase I、pol I、32PdNTP和未標(biāo)記的dNTP。 脫氧核糖核苷酸酶 I（DNase I）是一種內(nèi)切酶，它能夠水解單鏈或雙鏈DNA，形成帶有5-磷酸末端的單（寡）核苷酸。,由于32PdNTP比較昂貴，所以一般都采用低濃度的32PdNTP（2 mol/L）和高濃度的未標(biāo)記的dNTP（20 mol/L）。而且就大多數(shù)實(shí)驗(yàn)的要求，使用一種32PdNTP就足夠了，其他3種均可采用未標(biāo)記的dNTP，或是用適量的未標(biāo)記的dNTP稀釋每種32PdNTP。 改變反應(yīng)體系中DNase I的數(shù)量，可以控制32PdNTP的參入程度，一般希望有30%左右的32PdNTP參入DNA鏈。,3.3.2 大腸桿菌DNA聚合酶 I的Klenow片段 （E.coli DNA Pol I Klenow fragment） 用蛋白酶將DNA Pol I 作有限水解，可得到分子量為75000 dal和36000 dal的兩個片段，大片段即稱為Klenow片段，它具有5 3的聚合酶活性和3 5的核酸外切酶活性，但失去了全酶的5 3的核酸外切酶活性。 Klenow聚合酶可以標(biāo)記DNA片段末端（5延伸末端）。,對于限制性核酸內(nèi)切酶EcoR I切割后形成的5延伸末端可用32PdATP標(biāo)記： 而BamH I切割后形成的5延伸末端可用32PdGTP標(biāo)記：,3.3.3 T4 DNA聚合酶 是從T4噬菌體感染的大腸桿菌中分離純化的一種特殊的DNA聚合酶。 1. T4 DNA聚合酶也是一種多功能酶： (1) 5 3的聚合酶活性 (2) 3 5的外切酶活性 其外切酶活性比E.coli DNA Pol I 的活性高200倍。 (3) 取代反應(yīng)活性 如果在反應(yīng)混合物中僅存在一種dNTP，則此酶的3 5外切酶活性將從dsDNA的3末端降解，直到互補(bǔ)于這個dNTP的堿基出現(xiàn)為止，然后在這一位置發(fā)生取代反應(yīng)。,2. T4 DNA聚合酶在基因工程中的應(yīng)用 (1) 以填充反應(yīng)標(biāo)記帶有5延伸末端的dsDNA片段 (2) 將DNA的3延伸末端切成平末端 (3) 以取代反應(yīng)標(biāo)記帶有3延伸末端或平末端的dsDNA片段 (4) 以部分消化dsDNA法標(biāo)記DNA片段作為雜交探針（鏈特異的探針）,3.3.4 逆轉(zhuǎn)錄酶 是一種有效的轉(zhuǎn)錄RNA成為DNA的酶，又稱RNA依賴的DNA聚合酶，其產(chǎn)物DNA稱cDNA，即互補(bǔ)DNA。 1. 逆轉(zhuǎn)錄酶也是一個多功能酶： (1) RNA依賴的DNA聚合酶 以RNA鏈為模板，以帶有3-OH末端的DNA片段為引物，沿5 3方向合成DNA鏈。 幾乎所有真核生物的mRNA分子3末端都有一段Poly A，故加入寡聚dT后，mRNA就可以成為逆轉(zhuǎn)錄酶很好的模板，由此可合成cDNA。,(2) DNA依賴的DNA聚合酶 以ssDNA為模板，以帶有3-OH末端的DNA片段為引物，沿5 3方向合成DNA鏈。 可在新合成的DNA鏈上合成另一條互補(bǔ)DNA。,(3) 外切RNA酶活性 底物是RNA-DNA雜交分子中的RNA鏈，其水解方向有兩種： * 從RNA鏈 5末端外切：稱5 3外切RNA酶 * 從RNA鏈 3末端外切：稱3 5外切RNA酶 2. 逆轉(zhuǎn)錄酶在基因工程中的應(yīng)用： 主要用途是轉(zhuǎn)錄真核生物的mRNA成為cDNA，從而制備基因片段。,3. 商品化的逆轉(zhuǎn)錄酶有兩種： (1) 禽成髓細(xì)胞瘤病毒（AMV）逆轉(zhuǎn)錄酶 (2) Moloney鼠白血病病毒（Mo-MLV）逆轉(zhuǎn)錄酶 AMV逆轉(zhuǎn)錄酶雖能更有效地拷貝復(fù)雜的mRNA，但它有很強(qiáng)的外切RNA酶活性。而Mo-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶的外切RNA酶活性較弱，更有利于制備全長的cDNA。 兩種逆轉(zhuǎn)錄酶均無3 5外切DNA酶活性，故不具備校對功能，在高濃度dNTP和Mn2+存在下，容易出現(xiàn)核苷酸錯誤摻入。,3.4 DNA和RNA的修飾酶 3.4.1 核酸酶SI 1. 作用特點(diǎn)： 此酶是從米曲霉（Aspergillus oryzae）中提取的，可降解ssDNA或ssRNA，又稱單鏈特異性酶，其降解產(chǎn)物是5-磷酸末端的單或寡核苷酸片段。,核酸酶SI對DNA底物的活性比對RNA強(qiáng)。高濃度的核酸酶SI可從缺口（nick）或小裂縫（gap）處降解dsDNA。 2. 作用條件： 需要Zn2+作為輔助因子，最適pH是4.5，這是與基因工程的其它工具酶不同的兩個特點(diǎn)。 3. 在基因工程中的應(yīng)用： 由于核酸酶SI能從DNA片段中切除單鏈尾巴，因而在質(zhì)粒的重建和DNA重組中被廣泛使用。 切除單鏈粘性末端，產(chǎn)生平末端，再用T4連接酶連接。 切除cDNA的發(fā)夾結(jié)構(gòu)。,3.4.2 末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶 1. 作用特點(diǎn)： 此酶是從小牛胸腺中提取的，可催化單核苷酸轉(zhuǎn)移到另一個DNA分子的3-OH末端上，不需要模板，其引物是帶3-OH末端的ssDNA （Mg2+為輔因子）。平末端的dsDNA只有CO2+存在時才能作引物。 2. 在基因工程中的應(yīng)用： 在連接平末端DNA片段時加上互補(bǔ)的同源多聚物（同聚物加尾法）。,3.4.3 外核酸酶III 1. 作用特點(diǎn)： 此酶是從E.coli中分離得到的，是一種從dsDNA的3-OH末端降解產(chǎn)生5單核苷酸的外切酶。 2. 在基因工程中的應(yīng)用： 產(chǎn)生具有5延伸末端的DNA片段 制備特異的DNA探針,3.4.4 外核酸酶Bal 31 1. 作用特點(diǎn)： 此酶是從乳白短桿菌（Brevibacerium aldidum）中提取的。能以漸進(jìn)的方式從線型DNA分子的3，5兩端同時降解，產(chǎn)物是單核苷酸或寡核苷酸片段。底物可以是帶延伸末端或是平末端的dsDNA，對3、5兩端的降解速度相同。 2. 作用條件： 降解時需要Ca2+作輔助因子，以EDTA作螯合劑，可使Bal 31失活。,3. 在基因工程中的應(yīng)用： 可用于組建DNA的物理圖譜，以及造成克隆DNA分子的末端缺失。,3.4.5 T4多核苷酸激酶 1. 作用特點(diǎn)： 此酶是從噬菌體T4感染的E.coli中分離的。能催化ATP的-磷酸轉(zhuǎn)移到DNA或RNA的5-OH末端上。,2. 在基因工程中的應(yīng)用： 可用于缺乏5-磷酸的待連接DNA片段的5端磷酸化：反轉(zhuǎn)錄mRNA生成的cDNA、人工合成的DNA片段及PCR擴(kuò)增得到的DNA都缺少5-磷酸基，在與克隆載體連接之前，需用T4多核苷酸激酶將DNA的5-磷酸化。,3.4.6 堿性磷酸化酶（堿性磷酸酯酶） 1. 作用特點(diǎn)： 從細(xì)菌中分離的堿性磷酸化酶簡稱BAP，從小牛腸中分離的簡稱CAP。它能特異性地切去DNA或RNA的5-磷