蛋白質(zhì)的基本機(jī)構(gòu)和功能.ppt

第二章 蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能,Chapter 2 Structure and Function of Protein,主 要 內(nèi) 容,蛋白質(zhì)的分子組成 蛋白質(zhì)的分子結(jié)構(gòu) 蛋白質(zhì)的理化性質(zhì) 蛋白質(zhì)的分離純化,蛋白質(zhì)(Protein)的種類繁多,大腸桿菌約含蛋白質(zhì)3 000種，人體內(nèi)含蛋白質(zhì)10萬 余種。,蛋白質(zhì)是細(xì)胞中含量最豐富的生物大分子,約占人體固體成分的45% ，可達(dá)細(xì)胞干重的70%。,蛋白質(zhì)是生命的物質(zhì)基礎(chǔ),1.催化功能 2.調(diào)節(jié)功能 3.支持功能 4.運(yùn)輸功能 5.營(yíng)養(yǎng)功能,6.運(yùn)動(dòng)功能 7.防御功能 8.識(shí)別功能 9.信息傳遞功能 10.凝血與抗凝血功能,蛋白質(zhì)的生物學(xué)功能,第一節(jié) 蛋白質(zhì)的分子組成,C 5055% H 67% O 1924% N 1319% S 04% 有些蛋白質(zhì)還含有P、Fe、Cu、Mn、Zn、Se等。 各種蛋白質(zhì)含氮量接近，平均為16%；樣品測(cè)定中1克氮相當(dāng)于含6.25克蛋白質(zhì)（凱氏定氮法） 。,一、蛋白質(zhì)的元素組成,二、蛋白質(zhì)的基本組成單位氨基酸,蛋白質(zhì)受酸、堿或蛋白酶水解產(chǎn)生游離氨基酸。因此，組成蛋白質(zhì)的基本單位是氨基酸(amino acid) 。,（一）氨基酸的分類,根據(jù)R側(cè)鏈基團(tuán)的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)的不同，可將 20種氨基酸分為4類： 1.非極性疏水性氨基酸 2.極性中性氨基酸 3.酸性氨基酸 4.堿性氨基酸,1.非極性疏水氨基酸 側(cè)鏈為烴基、吲哚環(huán)、甲硫基等疏水性基團(tuán)。這類氨基酸在水中的溶解度小于極性中性氨基酸。,2.極性中性氨基酸 側(cè)鏈為羥基、巰基、或酰氨基等極性基團(tuán)，有親水性，但在中性水溶液中不電離的氨基酸。,3.酸性氨基酸 側(cè)鏈上有羧基，在水溶液中能釋放出H+而帶負(fù)電荷的氨基酸。有谷氨酸、天冬氨酸。,4.堿性氨基酸 側(cè)鏈上有氨基、胍基或咪唑基，在水溶液中能結(jié)合H+而帶正電荷的氨基酸。有賴氨酸、精氨酸和組氨酸等。,POLAR,NON- POLAR,Tyr,His,Gly,Acidic,Neutral,Basic,Asp,Glu,Gln,Cys,Asn,Ser,Thr,Lys,Arg,Ala,Val,Ile,Leu,Met,Phe,Trp,Pro,氨基酸按照極性分類,極性或非極性，是氨基酸性質(zhì)的基礎(chǔ),-C-C-CONH2,-C-CONH2,-C-COOH,-C-C-COOH,-H,-CH3,-C-OH,-C-SH,-C-C-S-C,-C-C-C-C-NH3+,South line,Circular line,Central line,Northwest line,Aliphatic,Amide,Acidic,Imino, Circular,Basic,Sulfur,Hydroxy,Aromatic,氨基酸代謝圖,(二)氨基酸的理化性質(zhì),1.物理性質(zhì) 都是白色晶體，熔點(diǎn)較高。能溶于強(qiáng)酸和強(qiáng)堿溶液；在水中的溶解度各不相同。 2.兩性解離與等電點(diǎn) 氨基酸是兩性電解質(zhì)，其解離方式取決于所處溶液的酸堿度。,氨基酸的等電點(diǎn)（isoelectric point,pI),在某一pH溶液中，氨基酸解離成陽離子和 陰離子的趨勢(shì)及程度相等，成為兼性離子，呈電 中性，此時(shí)溶液的pH稱為該蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)。,3.紫外吸收性質(zhì) 色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸對(duì)紫外光有吸 收作用。其最大吸收峰在280nm附近，以色氨酸吸收最強(qiáng)。 利用此性質(zhì)可采用紫外分分光度法測(cè)定溶液中蛋白質(zhì)的含量。,4.氨基酸的化學(xué)反應(yīng) （1）茚三酮反應(yīng) 氨基酸與水合茚三酮在溶液中共熱，發(fā)生一系列反應(yīng)，生成藍(lán)紫色化合物，其最大吸收峰在570nm。此反應(yīng)可用于氨基酸的定性和定量分析。 注：脯氨酸、羥脯氨酸與茚三酮反應(yīng)產(chǎn)生 黃色化合物。,氨基酸分析儀圖解,（2）與亞硝酸反應(yīng):Van Slyke 法測(cè)定氨基酸 氨基酸的氨基在室溫下與亞硝酸作用，生成氮?dú)?。通過在標(biāo)準(zhǔn)條件下測(cè)定生成的氮?dú)怏w積，即可計(jì)算出氨基酸的量。 生成的氮?dú)庵挥幸话雭碜园被帷?可用于氨基酸定量和蛋白質(zhì)水解程度的測(cè)定。,（3）桑格（Sanger) 反應(yīng) 氨基酸的NH2與2，4一二硝基氟苯（DNFB）反應(yīng)，生成DNP-氨基酸；黃色，提取、層析法鑒定來測(cè)定氨基酸。,（4）丹磺酰氯（DNS-Cl）反應(yīng) 氨基酸的NH2與DNS反應(yīng)；由于丹磺酰氯基具有強(qiáng)烈的熒光，靈敏度比DNFB法高100倍，并且水解后的DNS氨基酸不需要提取，可直接用紙電泳或薄層層析加以鑒定。,(5)埃德曼反應(yīng)(Edman reaction） 苯異硫氰酸酯，PITC 苯乙內(nèi)酰硫脲衍生物（PTH-氨基酸），無色，可以用層析法分離鑒定。 被Edman用來鑒定多肽的NH2末端氨基酸,三、氨基酸在蛋白質(zhì)分子中的連接方式,（一）肽鍵和肽 肽鍵（peptide bond)是由一個(gè)氨基酸分 子的-羧基與另一個(gè)氨基酸的-氨基脫水縮合 形成的化學(xué)鍵。,命名、編號(hào),第二節(jié) 蛋白質(zhì)的分子結(jié)構(gòu),蛋白質(zhì)是由許多氨基酸單位通過肽鍵連接形成的具有特定分子結(jié)構(gòu)的高分子化合物。 蛋白質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)可分為一級(jí)、二級(jí)、三級(jí)和四級(jí)。一級(jí)結(jié)構(gòu)是蛋白質(zhì)的基本結(jié)構(gòu)，二級(jí)、三級(jí)、四級(jí)結(jié)構(gòu)稱為高級(jí)或空間構(gòu)象。,一、蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu),概念 是指蛋白質(zhì)分子中氨基酸的排列順序。 主要的化學(xué)鍵 肽鍵、有些蛋白質(zhì)還含有二硫鍵。 一級(jí)結(jié)構(gòu)是決定蛋白質(zhì)空間構(gòu)象和特異生物學(xué)功能的基礎(chǔ)，但不是決定蛋白質(zhì)空間構(gòu)象唯一因素。,二、蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu),空間結(jié)構(gòu) 指蛋白質(zhì)分子內(nèi)各原子圍繞某些共 價(jià)鍵的旋轉(zhuǎn)而形成的各種空間排布及相互關(guān)系，稱為蛋白質(zhì)的構(gòu)象。 蛋白質(zhì)的構(gòu)象分為主鏈構(gòu)象和側(cè)鏈構(gòu)象。,（一）蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu),概念 是指蛋白質(zhì)多肽鏈主鏈原子局部的空間排列，不涉及氨基酸殘基側(cè)鏈的構(gòu)象。 維系蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的主要化學(xué)鍵是氫鍵。,2.蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的主要形式,-螺旋 -折疊 -轉(zhuǎn)角 無規(guī)卷曲,（1） -螺旋,-螺旋的結(jié)構(gòu)特點(diǎn) 多肽鏈以肽鍵平面為單位，-碳原子為 轉(zhuǎn)折點(diǎn)，有規(guī)律的盤繞成右手螺旋結(jié)構(gòu)。 每3.6個(gè)氨基酸殘基盤繞一圈，螺距為0.54 nm。 相鄰螺旋的肽鍵之間形成氫鍵，方向與長(zhǎng) 軸基本平行，維持螺旋的穩(wěn)定。 R基團(tuán)伸向螺旋外側(cè)，其大小、形狀及電荷性質(zhì)均影響-螺旋的形成。,（2）-折疊,-折疊的結(jié)構(gòu)特點(diǎn) 多肽鏈呈伸展?fàn)顟B(tài)，肽鍵平面沿長(zhǎng)軸折疊呈 鋸齒狀，兩平面間夾角為110，R基交替地伸向鋸 齒狀結(jié)構(gòu)的上下方。 若干肽段互相靠攏，平行排列，通過氫鍵連 接。氫鍵的方向與長(zhǎng)軸垂直。 若兩條肽段走向一致（N端、C端方向相同） ，稱為順向平行；反之，稱之為逆向平行，逆向更 穩(wěn)定。,-折疊包括平行式和反平行式兩種類型,（3）-轉(zhuǎn)角,-轉(zhuǎn)角的特點(diǎn) 主鏈骨架本身以大約180回折 回折部分通常由4個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成 構(gòu)象依靠第一殘基的-CO基與第四殘基的- NH 基之間形成氫鍵來維系。,（4）無規(guī)卷曲,是指多肽鏈中除了以上幾種比較規(guī)則 的構(gòu)象外，其余沒有確定規(guī)律性的那部分 肽鏈構(gòu)象。,（二）蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu),概念 是指整條肽鏈中所有原子的空間排布，它包括主鏈構(gòu)象和側(cè)鏈構(gòu)象。 主要化學(xué)鍵 疏水鍵、氫鍵、鹽鍵等非共價(jià)鍵和二硫鍵。疏水鍵是維持三級(jí)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的最主要作用力。,結(jié)構(gòu)域（domain） 分子量大的蛋白質(zhì)在形成三級(jí)結(jié)構(gòu)時(shí)，肽鏈中某些局部的二級(jí)結(jié)構(gòu)匯集在一起，形成發(fā)揮生物學(xué)功能的特定區(qū)域，稱為結(jié)構(gòu)域。 由一條多肽鏈形成的蛋白質(zhì)，其最高級(jí)結(jié)構(gòu)為三級(jí)結(jié)構(gòu)。只有具有三級(jí)結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)才具有生物學(xué)活性。,（三）蛋白質(zhì)的四級(jí)結(jié)構(gòu) 體內(nèi)有許多蛋白質(zhì)分子是由兩條或兩條以上具 有獨(dú)立三級(jí)結(jié)構(gòu)的多肽鏈通過非共價(jià)鍵聚合而成，中 每條具有獨(dú)立三級(jí)結(jié)構(gòu)的多肽鏈稱為亞基。 概念 蛋白質(zhì)分子中各亞基之間的空間排布和相互接觸關(guān)系。 化學(xué)鍵 氫鍵、鹽鍵、范氏引力、疏水鍵等非共價(jià)鍵。,蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中應(yīng)注意的幾個(gè)問題,由一條多肽鏈形成的蛋白質(zhì)其最高級(jí)結(jié)構(gòu)為三 級(jí)，具有三級(jí)結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)才具有生物學(xué)活性。 形成蛋白質(zhì)的四級(jí)結(jié)構(gòu)至少要有兩條多肽鏈。 兩條或兩條以上的多肽鏈靠共價(jià)鍵連接的蛋白質(zhì)沒有四級(jí)結(jié)構(gòu)。 由一條多肽鏈形成的蛋白質(zhì)與亞基不同。,三、蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能,蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系 一級(jí)結(jié)構(gòu)決定蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)； 一級(jí)結(jié)構(gòu)決定蛋白質(zhì)的生物學(xué)功能。 蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系 蛋白質(zhì)構(gòu)象是其生物學(xué)功能的基礎(chǔ)， 構(gòu)象改變功能改變。,第三節(jié) 蛋白質(zhì)的理化性質(zhì),一、蛋白質(zhì)的兩性解離與等電點(diǎn),1. 蛋白質(zhì)是兩性電解質(zhì) 蛋白質(zhì)分子中可解離的基團(tuán) 多肽兩端游離的-氨基和-羧基 多肽側(cè)鏈R上解離的基團(tuán) 決定蛋白質(zhì)解離成正負(fù)離子的因素 蛋白質(zhì)所含酸性和堿性基團(tuán)的數(shù)目 蛋白質(zhì)所在溶液的pH值,2.蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)（pI） 當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)溶液處于某一pH時(shí)，蛋白質(zhì)解離 成正、負(fù)離子的趨勢(shì)相等，即成為兼性離子， 凈電荷為零，此時(shí)溶液的pH稱為蛋白質(zhì)的等電 點(diǎn)。蛋白質(zhì)等電點(diǎn)性質(zhì)為電泳分離的依據(jù)。,體內(nèi)大多數(shù)蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)在pH5.0 左右，因而在生理?xiàng)l件下以陰離子形式存在 。,3.電泳 帶電粒子在電場(chǎng)中向電性相反的電極移動(dòng)的 現(xiàn)象。 蛋白質(zhì)在帶電場(chǎng)中泳動(dòng)的速度和方向與其所 帶電荷的性質(zhì)、數(shù)量及分子的大小、形狀有關(guān)。 帶電荷多，分子小的泳動(dòng)速度較快；反之則泳動(dòng) 較慢，從而達(dá)到分離蛋白質(zhì)的目的。,二、蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì),1.蛋白質(zhì)有膠體性質(zhì) 蛋白質(zhì)是生物大分子，分子量在1萬10萬Da之間，分子直徑在膠體顆粒的范圍（1100nm），因此，蛋白質(zhì)具有膠體的性質(zhì)。,2.蛋白質(zhì)親水膠體穩(wěn)定的因素 蛋白質(zhì)分子表面的水化膜和同種電荷。去掉兩個(gè)穩(wěn)定因素，則蛋白質(zhì)從溶液中析出而產(chǎn)生沉淀。 3.蛋白質(zhì)膠體性質(zhì)的應(yīng)用 透析用于分離純化蛋白質(zhì) 超速離心用于蛋白質(zhì)的分離純化及分子量的測(cè)定。,變性的概念 在某些物理或化學(xué)因素的作用下，蛋白質(zhì) 特定的空間構(gòu)象被破壞，從而導(dǎo)致其理化性質(zhì)改 變和生物活性喪失，稱為蛋白質(zhì)的變性。 變性的實(shí)質(zhì) 次級(jí)鍵斷裂，空間結(jié)構(gòu)破壞,三、蛋白質(zhì)的變性、沉淀和凝固,引起變性的因素 物理因素 高溫、高壓、紫外線、電離輻射、超聲波等。 化學(xué)因素 強(qiáng)酸、強(qiáng)堿、有機(jī)溶劑、尿素、重金屬鹽等。,變性蛋白質(zhì)的特點(diǎn) A.生物學(xué)活性喪失 B.溶解度降低，易于沉淀 C.粘度增加 D.結(jié)晶能力消失 E.易被蛋白酶水解,蛋白質(zhì)變性的應(yīng)用,應(yīng)用變性的因素進(jìn)行消毒、滅菌。 保存生物制劑則要防止蛋白質(zhì)變性。,蛋白質(zhì)的復(fù)性 大多數(shù)蛋白質(zhì)變性后，空間構(gòu)象嚴(yán)重破壞，不能恢復(fù)其天然狀態(tài)，稱為不可逆性變性；若蛋白質(zhì)變性程度較輕，去除變性因素，有些可恢復(fù)其天然構(gòu)象和生物活性,稱為蛋白質(zhì)的復(fù)性。,牛核糖核酸酶的變性與復(fù)性,蛋白質(zhì)沉淀,概念 蛋白質(zhì)從溶液中析出的現(xiàn)象稱為沉淀。 方法 鹽析法、有機(jī)溶劑的沉淀、重金屬鹽沉淀、生物堿試劑沉淀。 變性的蛋白質(zhì)易于沉淀，但不一定都發(fā)生沉淀。沉淀的蛋白質(zhì)易發(fā)生變性，但并不都變性，如鹽析。,四、蛋白質(zhì)的紫外吸收性質(zhì),蛋白質(zhì)分子中含有共軛雙鍵的苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸殘基，具有紫外吸收能力，在280nm處有最大吸收峰。此特性常用于蛋白質(zhì)含量的測(cè)定。,五、蛋白質(zhì)的免疫學(xué)性質(zhì),蛋白質(zhì)作為大分子，往往具有免疫原性，同時(shí)，抗體也是蛋白質(zhì)。 抗原（免疫原）：凡能刺激機(jī)體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生免疫應(yīng)答，并能與相應(yīng)抗體或致敏淋巴細(xì)胞受體發(fā)生特異性結(jié)合的物質(zhì)。 抗體：機(jī)體中因抗原刺激而產(chǎn)生的能與相應(yīng)抗原特異結(jié)合并具免疫功能的免疫球蛋白。 單克隆抗體：由針對(duì)某一個(gè)特定抗原決定簇而分化、增殖而來的B淋巴細(xì)胞群合成并分泌的抗體。,六、蛋白質(zhì)的呈色反應(yīng),1. 雙縮脲反應(yīng)： 肽鍵與雙縮脲試劑反應(yīng)呈紫色；氨基酸無此反應(yīng)，可用于檢查蛋白質(zhì)的水解程度。 堿性溶液中與Cu2+產(chǎn)生藍(lán)色，mg級(jí)測(cè)定 2. 茚三酮反應(yīng): 酸性條件下，與茚三酮共熱產(chǎn)生藍(lán)紫色 3. Folin酚試劑反應(yīng) 堿性+Cu2+磷鉬酸-磷鎢酸藍(lán)色 范圍:25-250g(Tyr,Trp的反應(yīng)),1. 紫外分光光度法: 280nm, 0.1-0.5mg/ml (樣品含核酸時(shí))蛋白質(zhì)(mg/ml)=1.55A280-0.75A260 2. 福林-酚試劑法: 堿性+Cu2+磷鉬酸-磷鎢酸藍(lán)色 范圍:25-250g(Tyr,Trp的反應(yīng)),七、蛋白質(zhì)的含量測(cè)定,3. Biuret法： 蛋白質(zhì)+堿性+Cu2+BCA試劑(4,4-二羧酸-2,2-二喹啉鈉)紫色(562nm) 范圍:10-1200g/ml 4. Bradford蛋白分析法: 考馬斯亮藍(lán)G-250+乙醇+酸性淡紅色+蛋白質(zhì)藍(lán)色(595nm) 范圍:10-100g/ml,5.雙縮脲法 肽鍵+堿性+Cu2+紫紅色 范圍:0.5-10mg/ml 6.凱氏定氮法 1g氮相當(dāng)于樣品含有6.25g蛋白質(zhì),第四節(jié) 蛋白質(zhì)的分離純化,一、蛋白質(zhì)的提取 1. 選材：新鮮、富含目的蛋白且來源方便 2. 組織細(xì)胞的粉碎：胞內(nèi)及膜中蛋白 物理法：如超聲、勻漿、加砂研磨、高壓擠壓等 化學(xué)法：如EDTA、SDS等 酶法：如自溶法、外加酶法（纖維素酶、果膠酶、溶菌酶等） 3. 提?。哼m當(dāng)溶媒、適當(dāng)條件、適當(dāng)提取時(shí)間和次數(shù),二、蛋白質(zhì)的分離純化,（一）根據(jù)溶解度不同 1. 等電點(diǎn)沉淀:蛋白質(zhì)在pI時(shí)溶解度最小 2. 鹽析(分級(jí)):大量中性鹽如(NH4)2SO4、Na2SO4、NaCl加入蛋白質(zhì)溶液中,破壞蛋白質(zhì)在水溶液中的穩(wěn)定性因素而沉淀.各種蛋白質(zhì)鹽析時(shí)需鹽濃度及pH不同. 3. 低溫有機(jī)溶劑沉淀(分級(jí)):降低水的介電常數(shù),（二）根據(jù)分子大小不同 1. 透析和超濾(分級(jí)):根據(jù)分子量的大小，用透析袋或?yàn)V膜將大、小分子物質(zhì)分開 2. 凝膠過濾(分子排阻層析):又稱分子篩，柱內(nèi)填滿帶有小孔的顆粒，一般為葡聚糖 3. 密度梯度離心:根據(jù)粒子密度差進(jìn)行分離。蔗糖,CsCl,(三)根據(jù)電離性質(zhì)不同 1.電泳法:蛋白質(zhì)泳動(dòng)的方向和速度取決于蛋白質(zhì)分子所帶電荷的性質(zhì)、數(shù)量及質(zhì)點(diǎn)的大小和形狀 1)醋酸纖維素薄膜電泳 2)聚丙