生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo).docVIP

生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)須知一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?培養(yǎng)學(xué)生嚴(yán)謹(jǐn)?shù)目茖W(xué)作風(fēng)，獨(dú)立工作能力及科學(xué)的思維方法。2學(xué)習(xí)基礎(chǔ)的生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)方法，為今后的學(xué)習(xí)與研究準(zhǔn)備更好的條件。3培養(yǎng)學(xué)生愛護(hù)國家財物、愛護(hù)集體、團(tuán)結(jié)互助的優(yōu)良道德品質(zhì)。4培養(yǎng)學(xué)生的書面及口頭表達(dá)能力。二、實(shí)驗(yàn)的總要求1按教研室予先公布的實(shí)驗(yàn)進(jìn)度表，了解各次實(shí)驗(yàn)的具體內(nèi)容，并認(rèn)真做好預(yù)習(xí)。弄清各步驟的意義，避免教條或機(jī)械式做實(shí)驗(yàn)。2進(jìn)行實(shí)驗(yàn)不僅要求結(jié)果良好，而且要求敏捷高效。為達(dá)到此目的，實(shí)驗(yàn)者應(yīng)注意：一切步驟都按正規(guī)操作法進(jìn)行；樣品與試劑勿過量取用；宜粗者勿細(xì)（例如粗天平稱量物品即足夠準(zhǔn)確時，不用分析天平，用量筒取液足夠準(zhǔn)確時，不用吸量管）；試劑、儀器防止污染及破損，保持實(shí)驗(yàn)環(huán)境的整潔。注意力集中，避免差錯。 3實(shí)驗(yàn)中觀察要仔細(xì)，記錄要詳盡、及時與客觀，不得于實(shí)驗(yàn)后追記，應(yīng)直接記在實(shí)驗(yàn)報告本中，而且無論實(shí)驗(yàn)成功與失敗，都應(yīng)記下。對于失敗的實(shí)驗(yàn)，要分析其原因。4實(shí)驗(yàn)室是集體學(xué)習(xí)與工作的場所，實(shí)驗(yàn)時應(yīng)保持肅靜，不得大聲喧嘩，以免影響他人的工作與思考。對師長尊敬，對同學(xué)要團(tuán)結(jié)友愛。實(shí)驗(yàn)后應(yīng)清洗整理用過的儀器及清理自己的實(shí)驗(yàn)場所。三、實(shí)驗(yàn)報告實(shí)驗(yàn)報告的書寫是培養(yǎng)學(xué)生書面表達(dá)能力和科學(xué)作風(fēng)的重要手段之一，實(shí)驗(yàn)者應(yīng)該重視。實(shí)驗(yàn)報告的內(nèi)容包括下列各項(xiàng)：實(shí)驗(yàn)名稱、實(shí)驗(yàn)日期、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、?shí)驗(yàn)原理、實(shí)驗(yàn)步驟、實(shí)驗(yàn)記錄、計(jì)算（定量測定、解釋）、討論或小結(jié)。實(shí)驗(yàn)記錄除應(yīng)包括“實(shí)驗(yàn)總要求”的第3項(xiàng)要求外，還應(yīng)包括原始記錄。原始記錄是隨做隨記的第一手記錄，應(yīng)由指導(dǎo)教師簽字認(rèn)可。書寫實(shí)驗(yàn)報告要字跡工整，語句通順。書寫工整的實(shí)驗(yàn)報告，是尊師的重要表現(xiàn)之一。四、組織與分組1每一個班學(xué)習(xí)委員負(fù)責(zé)實(shí)驗(yàn)報告的收集與分發(fā)；安排清掃值日名單；反映同學(xué)學(xué)習(xí)情況及對教學(xué)工作的意見；其它臨時性的工作。2一般實(shí)驗(yàn)都為兩個學(xué)生單獨(dú)進(jìn)行。有的實(shí)驗(yàn)要4人一組，由相鄰兩學(xué)生組成固定小組。小組的成員在指導(dǎo)教師的同意下，可作適當(dāng)?shù)恼{(diào)整。五、儀器1每個實(shí)驗(yàn)小組的常用儀器在各自的抽屜里，請各位同學(xué)愛惜公用儀器，用完及時清洗干凈。2公用儀器（包拈貴重儀器，如分光光度計(jì)、電動離心機(jī)等）使用時時間不宜過長，以免妨礙他人工作。設(shè)有使用登記薄的儀器，使用后必須登記，以示負(fù)責(zé)。對于不熟悉儀器，切勿隨意亂動應(yīng)請教師指導(dǎo)。六、試劑1每兩小組合用一份試劑，在一般情況下，使用的試劑應(yīng)該固定。2取試劑瓶塞與量取用具（如吸管或滴管）不應(yīng)與試劑瓶分開放置，用后應(yīng)立即放回原處，量取用具應(yīng)按規(guī)定放置。瓶塞與量具一旦弄錯，試劑即受污染，實(shí)驗(yàn)就可能失敗。3標(biāo)準(zhǔn)試劑不應(yīng)用潮濕之吸管與之直接接觸，取出后不得再放入原瓶。七、玻璃器皿的洗滌一般玻璃皿器用肥皂或去污粉以毛刷洗滌即足以滿足要求，洗后應(yīng)將肥皂或去污粉仔細(xì)沖掉，將水傾去后，器壁不掛水珠，視為合格。鉻酸洗液僅用于毛刷不能洗凈的器皿，切勿濫用于普通玻璃器皿洗滌。使用鉻酸洗液時，玻璃器皿應(yīng)干燥；過多的水份將使洗液迅速失效。用過的鉻酸洗液須加以保存以反復(fù)使用，直至變?yōu)榫G色后方可舍棄；其舍棄法與濃硫酸液相同。用洗液浸洗過的玻璃器皿，應(yīng)先用自來水沖洗，然后再用蒸餾水或去離子水清洗，清洗時，宜采用“少量多次”原則以節(jié)約蒸餾水，同時清洗的效率也高。八、舍棄物的處理舍棄物必須依照其性質(zhì)作適當(dāng)處理。以免造成實(shí)驗(yàn)材料浪費(fèi)，損壞水槽及下水管道，或污染實(shí)驗(yàn)環(huán)境。1所有固體舍棄物（例如用過的濾紙、損壞的軟木塞及橡皮物、玻璃渣、火柴梗等）。必須放入廢物筒或簍中，切勿丟于水槽中。2廢硫酸或洗液，應(yīng)先傾入大量水中，再倒入水槽中，并以大量水沖走。3實(shí)驗(yàn)完成后的沉淀或混合物，若含有可提取或收回的貴重物品者，不可隨意舍棄，應(yīng)放入教師指定的回收器中。生化實(shí)驗(yàn)基本操作一. 玻璃儀器的洗滌在生化實(shí)驗(yàn)中，玻璃儀器潔凈與否，是獲得準(zhǔn)確結(jié)果的重要環(huán)節(jié)。潔凈的玻璃儀器內(nèi)壁應(yīng)十分明亮光潔，無水珠附著在玻壁上。 常用的洗滌方法：1.一般儀器，如燒杯、試管等可用毛刷蘸肥皂液、合成洗滌劑仔細(xì)刷洗。然后用自來水反復(fù)沖洗，最后用少量蒸餾水沖洗23次，倒置在器皿架上晾干或置于烘箱烤干備用。2.容量分析儀器如吸量管、容量瓶、滴定管等，不能用毛刷刷洗。用后應(yīng)及時用自來水多次沖洗，細(xì)心檢查潔凈程度，根據(jù)掛不掛水珠采取不同處理方法。（1）如不掛水珠，用蒸餾水沖洗、干燥，方法同上；（2）如掛水珠，則應(yīng)瀝干后用重鉻酸鉀洗液浸泡46小時，然后按上法順序操作，即先用自來水沖洗，再用蒸餾水沖洗，最后干燥。3.粘附有血漿的刻度吸量管等，有三種洗滌方法：（1）先用45%尿素溶液浸泡，使血漿蛋白溶解，然后用自來水沖洗；（2）也可用1%氨水浸泡，使血漿溶解，然后再依次用1%稀鹽酸溶液、自來水沖洗；（3）以上二法如達(dá)不到清潔要求，可浸泡于重鉻酸鉀洗液46小時，再用大量自來水沖洗，最后用蒸餾水沖洗23次。4.新購置的玻璃儀器，應(yīng)先置于12%稀鹽酸溶液中浸泡26小時，除去附著的游離堿，再用自來水沖洗干凈，最后用蒸餾水沖洗23次。5.凡用過的玻璃儀器，均應(yīng)立即洗滌，久置干涸后洗滌十分困難。如不能及時洗滌，先用流水初步?jīng)_洗后浸泡在清水中，待后按常規(guī)處理。 使用重鉻酸鉀洗液（以下簡稱洗液）時應(yīng)注意以下幾點(diǎn)：1.需用洗液浸泡的容器，在浸泡前應(yīng)盡量瀝干。否則會因洗液被稀釋而降低洗液的氧化力。2.Hg2+、Ba2+、Pb2+ 等離子可與洗液發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，生成不溶性化合物沉積在容器壁上。因此，凡接觸過上述離子的容器，應(yīng)先除去上述離子（可用稀硝酸或510%EDTA鈉清除）。3.油類、有機(jī)溶劑等有機(jī)化合物可使洗液還原失效。因此，容器壁上附有大量油類、有機(jī)物時，應(yīng)先除去。4.洗液的酸性和氧化性很強(qiáng)，使用時應(yīng)格外注意，千萬不要滴落在皮膚或衣物上，以免灼傷或燒壞。5.洗液顏色由深棕色變?yōu)榫G色時，說明洗液已經(jīng)失效，應(yīng)停止使用，更換新液。因重鉻酸變成硫酸鉻后不再具有氧化性。注：重鉻酸鉀洗液的配制 取重鉻酸鉀20g溶于20ml蒸餾水中，加熱至沸。冷卻后再將200ml濃硫酸慢慢加入，邊加邊攪拌。注意：此時可產(chǎn)生高熱。為防止容器破裂，應(yīng)選用耐酸搪瓷缸或耐高溫的玻璃器皿，切忌用量筒及試劑瓶等配制。為防止洗液吸收空氣中的水分而被稀釋變質(zhì)，洗液應(yīng)貯存于帶蓋的容器中。當(dāng)清潔效力降低時，再加入少量重鉻酸鉀及濃硫酸就可繼續(xù)使用。二. 吸量管的使用 吸量管和定量吸(移)液器(微量加樣器)均為用來轉(zhuǎn)移一定體積溶液的量器。 吸量管：生化實(shí)驗(yàn)中常用的有三種，最常用的是刻度吸量管。1.刻度吸量管：刻度吸量管的種類： 按容量規(guī)格來分，有0.1、0.2、0.25、0.5、1、2、5、10ml等數(shù)種。其精密度按不同的容積可達(dá)移取量的0.11%。通常將管身標(biāo)明的總?cè)萘糠挚虨?00等分。因此，10ml的吸量管一格代表0.1ml；1ml的吸量管一格代表0.01ml,其余類推。 按“零”點(diǎn)位置來分，有“O”點(diǎn)在吸量管上端的（即讀數(shù)從上而下逐漸增大），也有“O”點(diǎn)在吸量管下端的（讀數(shù)從下而上逐漸增大)。兩種標(biāo)示方法，在使用時各有方便之處。 按刻度方法來分，刻度吸量管也有兩種，一種是刻度刻到尖端的，將液體放出時，應(yīng)吹出殘留在吸量管尖端的少量液體(我實(shí)驗(yàn)室的刻度吸量管全部是這一種)，另一種是刻度不刻到尖端的。 刻度吸量管的正確使用方法：用右手拇指和中指夾住管身，將吸量管的尖端伸入試液深處，左手持洗耳球把試液吸入管內(nèi)至高過刻度以上時，迅速用右手食指按住吸量管的上口，以控制試液的泄放。吸液后應(yīng)盡量使吸量管保持垂直，使右眼與刻度等高，稍微輕抬食指或輕輕轉(zhuǎn)動吸量管，使試液面緩慢降落，至管內(nèi)試液彎月面的最低點(diǎn)與吸量管的刻度線相齊為止。然后將吸量管插到需加試劑的容器中，讓尖端與容器內(nèi)壁靠緊，松開食指讓液體流出。液體流完后再等15秒鐘，捻動一下吸量管后移去（如需吹的吸量管，則吹出尖端的液體后再捻轉(zhuǎn)一下吸量管移去）。 使用刻度吸量管的注意事項(xiàng)： 選擇適當(dāng)規(guī)格的吸量管：吸量管的最大容積應(yīng)等于或略大于所需容積（ml數(shù)）。 仔細(xì)看清吸量管的刻度情況：刻度是否包括吸量管尖端的液體？讀數(shù)方向是從上而下，還是從下而上？ 拿吸量管時，刻度一定要面向自己，以便讀數(shù)。 吸取試劑時應(yīng)注意三點(diǎn)：一是先吹去吸量管內(nèi)可能存在的殘留液體，二是將吸量管插入試劑液面深部(以免吸液過程中因液面降低而吸入空氣產(chǎn)生氣泡或管內(nèi)試劑進(jìn)入洗耳球)，三是使用洗耳球(不可直接用口吸)。 按吸量管上口時應(yīng)該用食指，不能用拇指。 吸取粘滯性大的液體(如血液、血漿、血清等)時，除選用合適的吸管(奧氏管)外，應(yīng)注意拭凈管尖附著的液體，盡量減慢放液速度(用食指壓力控制)，待液體流盡后吹出管尖殘留的最后一滴液體。 使用的吸量管應(yīng)干凈、干燥無水。如急用而又有水時，可用少量欲取試劑沖洗3次，以免試劑被稀釋。 2.移液吸量管：也有兩種，常見的一種是吸量管的上端只有一個刻度，另一種是除了在吸量管上端有刻度外，在吸量管下端狹窄處也有一刻度線。無論哪一種，在使用時將量取的液體放出后，只需將吸量管的尖端觸及受器壁約半分鐘即可，不得吹出尖端的液體。3.奧氏吸量管：準(zhǔn)確度最高，使用時必需吹出留在尖端的液體。 定量吸(移)液器(微量加樣器)：定量吸液器是吸量管的革新產(chǎn)品。由塑料制成。目前，因產(chǎn)地廠家不同其質(zhì)量、價格差異十分懸殊。 1.定量吸液器的優(yōu)點(diǎn)：使用方便，取、加樣迅速，計(jì)量準(zhǔn)確，不易破損，能吸取多種樣品（只換吸嘴即可）。2.定量吸液器的類型：有兩種類型。 固定式：只能取加一定容量的試劑，不能隨意調(diào)節(jié)取加樣量。其規(guī)格有10l、20l、25l、30l、50l、100l、200l、250l、300l、400l、500l、1000l等。 可調(diào)式：在一定容量范圍內(nèi)可根據(jù)需要進(jìn)行調(diào)節(jié)取加樣量。例如規(guī)格為50200l的可調(diào)式定量吸液器，可以在50到200l的范圍內(nèi)根據(jù)需要調(diào)節(jié)成設(shè)計(jì)容許的各種取加樣容量（60l、85l、110l、170l、200l等）。 一般來講，固定式吸液器比較準(zhǔn)確，可調(diào)式吸液器使用較為方便。3.定量吸液器的使用方法： 選擇適當(dāng)?shù)奈浩?。吸液前先把吸嘴套在吸引管上，套上后要輕輕旋緊一下，以保證結(jié)合嚴(yán)密。 持法：右手四指（除大拇指外）并攏握住吸液器外殼（使外殼突起部分搭在食指近端），大拇指輕輕放在吸液器的按鈕上。 取樣(吸液)：用大拇指按下按鈕到第一停止點(diǎn)，以排出一定容量的空氣，隨后把吸嘴尖浸入取樣液內(nèi)，徐徐松開大拇指，讓按鈕慢慢自行復(fù)原，取樣即告完成。 排液：將吸液器的吸嘴尖置于加樣容器壁上，用大拇指慢慢地將按鈕按下到第一停止點(diǎn)，停留1秒鐘（粘性較高的溶液停留時間應(yīng)適當(dāng)延長）。然后再把按鈕按到第二停止點(diǎn)上，讓吸嘴沿管壁向上滑動。當(dāng)吸嘴尖與容器壁或溶液離開時，方可釋放按鈕，使其恢復(fù)到初始位置。 吸液器用后應(yīng)及時取下吸嘴。將吸嘴用自來水沖洗后浸入盛水的容器內(nèi)（以防干涸），待實(shí)驗(yàn)結(jié)束后集中仔細(xì)清洗。三. 溶液的混勻 1 混勻的目的： 使反應(yīng)體系內(nèi)的各種物質(zhì)分子很好地互相接觸，充分進(jìn)行反應(yīng)；使欲稀釋的溶液成為濃度均一的溶液。 混勻的方法通常有以下幾種： 使盛器作離心運(yùn)動。 左手持試管上端，用右手指輕擊試管下半部，使管內(nèi)溶液作旋轉(zhuǎn)運(yùn)動。 利用旋渦混合（振蕩）器混勻。 不得已時可用干燥清潔的玻璃棒攪勻。 混勻的注意事項(xiàng)：防止盛器內(nèi)的液體濺出或被污染。嚴(yán)禁用手指堵塞管口或瓶口震蕩混勻。 實(shí)驗(yàn)一、蛋白質(zhì)的性質(zhì)實(shí)驗(yàn)（一） 蛋白質(zhì)及氨基酸的呈色反應(yīng)一、 實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?、 了解構(gòu)成蛋白質(zhì)的基本結(jié)構(gòu)單位及主要連接方式。2、 了解蛋白質(zhì)和某些氨基酸的呈色反應(yīng)原理。3、 學(xué)習(xí)幾種常用的鑒定蛋白質(zhì)和氨基酸的方法。二、 實(shí)驗(yàn)原理（呈色反應(yīng)）蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)中某種化學(xué)鍵或氨基酸殘基中的某些化學(xué)基團(tuán)能與特定的化學(xué)試劑產(chǎn)生特定的有色物質(zhì)，稱為蛋白質(zhì)的呈色反應(yīng)。各種蛋白質(zhì)分子中氨基酸殘基不完全相同，因此產(chǎn)生的顏色也不完全一樣。當(dāng)然呈色反應(yīng)并不一定是蛋白質(zhì)的專一反應(yīng)，某些非蛋白質(zhì)類物質(zhì)也能產(chǎn)生類似折顏色。因此，不能僅僅根據(jù)呈色反應(yīng)的結(jié)果來判斷被測物質(zhì)是否為蛋白質(zhì)。 （一）雙縮脲反應(yīng)（Birut reaction） 1、原理尿素加熱至180左右，生成雙縮脲并放出一分子氨。雙縮脲在堿性環(huán)境中能與Cu2+結(jié)合生成紫紅色化合物，此反應(yīng)稱為雙縮脲反應(yīng)。蛋白質(zhì)分子有肽鍵。其結(jié)構(gòu)與雙縮脲相似，也能發(fā)生此反應(yīng)?？捎糜诘鞍踪|(zhì)的定性或定量測定。硫酸銅加熱注意：雙縮脲反應(yīng)不僅含有兩個以上肽鍵的物質(zhì)所有。含有一個肽鍵和一個CSNH2， CRHNH2，CH2NH2CHNH2CH2OH，或CHOHCH2NH2等基團(tuán)的物質(zhì)以及乙二酰二胺（O=C（NH2）C（NH2）=O等物質(zhì)有此反應(yīng)。 NH3也干擾此反應(yīng)，因?yàn)镹H3與Cu2+可生成暗藍(lán)色的絡(luò)離子Cu(NH3)42+，一切蛋白質(zhì)或二肽以上的多肽都有雙縮脲反應(yīng)，但有雙縮脲反應(yīng)的物質(zhì)不一定都是蛋白質(zhì)或多肽。2、 試劑1）尿素 10g 3）2%硫酸銅溶液 60mL2)10%氫氧化鈉溶液 250mL 5）0.5 %Glu溶液4）2%卵清蛋白溶液 (1:6) 80mL 雞蛋清用蒸餾水稀釋6倍，通過23層紗布濾去不溶物即得。 3、 操作取少量尿素結(jié)晶（火柴頭大小），放在干燥試管中。用微火加熱使尿素熔化。熔化的尿素開始硬化時，停止加熱，尿素放出氨基酸，形成雙縮脲。冷卻備用，為1號。再取兩支：分別加入卵清蛋白溶液和Glu溶液，為2號和3號。編 號123雙縮脲（少許）卵清蛋白（1ml）Glu(1ml)10% NaOH （滴）5552% CuSO4 (滴)111現(xiàn) 象在上述三支試管中分別進(jìn)行如下操作：加10%氫氧化鈉溶液約5滴，振蕩混勻，再加2%硫酸銅溶液1滴，再振蕩。觀察出現(xiàn)的粉紅顏色。要避免添加過量硫酸銅，否則，生成的藍(lán)色氫氧化銅能掩蓋粉紅色。搖勻，再加2%硫酸銅溶液1滴，隨加隨振蕩。觀察紫玫瑰色的出現(xiàn)。（二）茚三酮反應(yīng) 1、原理除脯氨酸、羥脯氨酸和茚三酮反應(yīng)產(chǎn)生黃色物質(zhì)外，所有-氨基酸及一切蛋白質(zhì)都能和茚三酮反應(yīng)生成藍(lán)紫色物質(zhì)。該反應(yīng)十分靈敏，1：1500000濃度的氨基酸水溶液即能反應(yīng)，是一種常用的氨基酸定量測定方法。-丙氨酸、氨和許多一級胺都呈正反應(yīng)。尿素、馬尿酸、二酮吡嗪和肽鍵上的亞氨基不呈現(xiàn)此反應(yīng)。因此，雖然蛋白質(zhì)和氨基酸均有茚三酮反應(yīng)，但能與茚三酮呈陽性反應(yīng)的不一定就是蛋白質(zhì)或氨基酸。在定性、定量測定中，應(yīng)嚴(yán)防干擾物存在。茚三酮反應(yīng)分為兩步：第一步是氨基酸被氧化形成CO2、NH3和醛，水合茚三酮被還原成還原型茚三酮；第二步是所形成的還原型茚三酮與另一個水合基本分子和氨縮合生成有色物質(zhì)。反應(yīng)機(jī)理如下： 此反應(yīng)的適宜pH為57，同一濃度的蛋白質(zhì)或氨基酸在不同pH條件下的顏色深淺不同，酸度過在時甚至不顯色。 2、試劑 1）蛋白質(zhì)溶液 100mL 2%卵清蛋白或新鮮雞蛋清溶液（蛋清：水=1：6）2）0.3% Glu溶液 80mL 3）0.1% 茚三酮水溶液 50mL3、操作取2支試管分別加入蛋白質(zhì)溶液和Glu氨酸溶液1mL，再各加23滴0.1%茚三酮水溶液，混勻，在沸水浴中加熱12分鐘，觀察顏色由粉紅色變紫紅色再變藍(lán)。1（卵清蛋白）2（Glu）3 (Tyr)體積（ml）111茚三酮（滴）333實(shí)驗(yàn)三、蛋白質(zhì)的性質(zhì)實(shí)驗(yàn)（三） 蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)測定一、 實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?、 了解蛋白質(zhì)的兩性解離性質(zhì)。2、 學(xué)習(xí)測定蛋白質(zhì)等電點(diǎn)的一種方法。二、 實(shí)驗(yàn)原理蛋白質(zhì)是兩性電解質(zhì)。在蛋白質(zhì)溶液中存在下列平衡：其分子中所含的自由氨基和羧基均可能解離。當(dāng)溶液的pH值大于蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)，氨基的解離胺到抑制而羧基的解離度增大，此時蛋白質(zhì)分子為帶負(fù)電荷的陰離子。反之，當(dāng)溶液的pH小于蛋白質(zhì)等電點(diǎn)時，羧基的解離受到抑制而氨基的解離增加，而使蛋白質(zhì)分子帶正電荷。蛋白質(zhì)分子的解離狀態(tài)和解離程度受溶液的酸堿度影響。當(dāng)溶液的pH 達(dá)到一定數(shù)值時，蛋白質(zhì)顆粒上正負(fù)電荷的數(shù)目相等，在電場中，蛋白質(zhì)既不向陰極移動，也不向陽極移動，此時溶液的pH值稱為此種蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)。不同蛋白質(zhì)各有其等電點(diǎn)。在等電點(diǎn)時，蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)都有變化，可利用此種性質(zhì)的變化測定各種蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)。最常用的方法是測其溶解度最低時的溶液pH值。 本實(shí)驗(yàn)借觀察在不同pH 溶液中的溶解度以測定酪蛋白的等電點(diǎn)。用醋酸與醋酸鈉（醋酸鈉混合在酪蛋白溶液中）配制成各種不同pH值的緩沖液。向諸緩沖溶液中加入酪蛋白后，沉淀出現(xiàn)最多的緩沖液的pH即為酪蛋白的等電點(diǎn)。三、 實(shí)驗(yàn)器材水浴鈉、溫度計(jì)、200ml錐形瓶、100mL容量瓶、吸管、試管、試管架、乳缽四、 實(shí)驗(yàn)試劑1、0.5%酪蛋白醋酸鈉溶液 200mL取純酪蛋白（干酪素）0.05 g加蒸餾水20mL及1mol/LNaOH溶液5mL，混合使之溶解，再加1mol/L HAc溶液5mL，定容至50mL即可。2、1.00mol/L醋酸溶液 100mL3、0.10mol/L醋酸溶液 100mL4、0.01mol/L醋酸溶液 50mL五、 實(shí)驗(yàn)操作1） 取同樣規(guī)格的試管5支，按下表順序分別精確地加入各試劑，然后混勻。 試 劑編 號蒸餾水（mL）0.01mol/L 醋酸(mL)0.1mol/L 醋酸(mL)1.0mol/L 醋酸(mL)pH14.190.315.924.370.135.334.00.54.742.52.04.153.70.83.5pI2) 向以上試管中各加酪蛋白的醋酸鈉溶液1mL，加一管，搖勻一管。此時1、2、3、4、5管的pH依次為5.9、5.3、4.7、4.1、3.5。 觀察其混濁度，靜置10分鐘，再觀察其混濁度。最混濁的一管即為酪蛋白的等電點(diǎn)。實(shí)驗(yàn)十四、酶的性質(zhì)一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?.通過本實(shí)驗(yàn)觀察、驗(yàn)證酶的專一性和溫度、pH、激動劑及抑制劑對酶活性的影響。2.熟悉淀粉及其酶解產(chǎn)物的特殊顯色方法；電熱恒溫水浴的使用。 3.了解唾液淀粉酶的收集與預(yù)處理。二、實(shí)驗(yàn)原理酶具有高度專一性，一種酶只能催化一種或一類底物發(fā)生反應(yīng)，如淀粉酶只能水解淀粉，不能水解蔗糖。當(dāng)?shù)矸郾坏矸勖笍氐姿鉃檫€原性麥芽糖和葡萄糖時，能使班氏試劑的Cu2+還原成Cu1+，生成磚紅色Cu2O沉淀。淀粉酶的活性受溫度、pH、激動劑及抑制劑、酶濃度以及作用時間等多種因素影響，因而水解淀粉生成一系列分子大小不同的糊精。不同程度的水解糊精可與碘反應(yīng)生成紫色、棕色或紅色絡(luò)合物。通過上述特征性反應(yīng)，并以蔗糖等作對照，便可觀察、驗(yàn)證淀粉酶是否具有專一性以及它的催化活性是否受到影響。三、試劑和器材（一）、器材1、滴管、燒杯、試管（架）及試管夾 。2、恒溫水浴箱與水浴鍋。3、脫脂棉、漏斗及紗布。4、白瓷反應(yīng)盤（二）試劑1、1淀粉 稱取淀粉1g，加少量水調(diào)成糊狀，加入煮沸的0.3NaCl溶液至100m1。2、1蔗糖溶液3、班氏試劑 A液：取檸檬酸鈉173，無水碳酸鈉100，加水600ml，加熱溶解，冷卻后稀釋至850ml；B液：取結(jié)晶硫酸銅（CuSO45H2O）17.3溶于100ml預(yù)熱的蒸餾水中，冷卻后加水至150ml。將A液緩慢倒入B液中混勻置試劑瓶備用。4、碘液：稱取碘4g、碘化鉀6g溶于l000ml蒸餾水中，置棕色瓶內(nèi)貯存?zhèn)溆谩?、各種pH緩沖液（1）pH6.8緩沖液：取0.2mol/LNa2HPO4溶液772ml，0.1mol/L檸檬酸溶液228ml混合即成。（2） pH4.0緩沖液：取0.2mol/LNa2HPO4溶液385.5ml，0.1mol/L檸檬酸溶液614.5ml混合即成。（3）pH8.0緩沖液：取0.2mol/LNa2HPO4溶液972ml，0.1mol/L檸檬酸溶液28ml混合即成。6、0.9 NaCl 溶液 7、1CuSO4 溶液8、1Na2SO4溶液四、操作步驟（一）、唾液淀粉酶的收集與處理1.制備唾液實(shí)驗(yàn)者先將痰咳盡，用自來水漱口，以清除口腔內(nèi)食物殘?jiān)僭诳谇粌?nèi)含蒸餾水約15ml，并作咀嚼咕漱運(yùn)動，3分鐘后吐入墊有兩層經(jīng)潤濕處理的脫脂紗布的漏斗內(nèi)，過濾于小燒杯中備用，為與下面稀釋唾液相區(qū)別，此稱制備唾液。2.煮沸唾液 取上述唾液約2ml，盛入1中號試管中,置沸水浴煮沸5分鐘備用。3.稀釋唾液 調(diào)整唾液淀粉酶活性，使之在pH6.8、37和既無激動劑又無抑制劑條件下，作用5min，水解淀粉至紅色糊精為宜。具體做法是取12凹白瓷反應(yīng)板一塊，按下列步驟操作：第1排每凹各加1滴制備唾液，12、13、14凹分別加生理鹽水1、2、3滴，用滴管采用抽吸法，由稀到濃（1412）小心混勻各凹，勿使濺入相鄰凹中。每混勻一凹便取其1滴放入同列的2排凹中，剩余稀釋唾液應(yīng)全部放回原凹中。在盛有不同稀釋度唾液的第2排各凹中，均加入4滴緩沖液（pH6.8），2滴1%的淀粉液和2滴蒸餾水，用混勻法充分混勻，置37下5min。在第2排各凹中加I液一滴，混勻，觀察比較各凹顏色，以淺棕-紅色對應(yīng)的稀釋倍數(shù)，用生理鹽水稀釋3ml制備唾液備用。（二）唾液淀粉酶的專一性以及溫度、pH、激活劑和抑制劑對唾液淀粉酶活性影響的觀察1、取試管3支編號，按下表1操作表1 唾液淀粉酶專一性的實(shí)驗(yàn)觀察試劑 試管pH6.8緩沖液1淀粉溶液1蔗糖溶液制備唾液煮沸唾液120滴10滴5滴220滴10滴5滴320滴10滴5滴將上述各管混勻后，置37水浴中保溫10分鐘，然后每管加入班氏試劑20滴，再放入沸水浴中煮沸約15分鐘，觀察各管顏色反應(yīng)，并說明原因。（三）溫度影響酶促反應(yīng)的實(shí)驗(yàn)觀察1.取試管3支編號，按下表2操作：表2 溫度影響酶促反應(yīng)的實(shí)驗(yàn)觀察管號試劑1231.pH6.8緩沖液20滴20滴20滴2.1淀粉溶液10滴10滴10滴3.預(yù)熱5min37水浴沸水浴冰浴4.直接加入稀釋唾液，立即混勻、計(jì)時5滴5滴5滴5.保溫10min37水浴沸水浴冰浴2.將一、二管移入冰水浴中，待各管溫度一致后速向各管加入碘液1滴，混勻后觀察各管顏色的區(qū)別，并說明溫度對酶促反應(yīng)的影響。（四）、pH影響酶促反應(yīng)的實(shí)驗(yàn)觀察1. 取試管3支編號，按下表3操作：表3 pH影響酶促反應(yīng)的實(shí)驗(yàn)觀察pH4.0緩沖液pH6.8緩沖液pH8.0緩沖液1淀粉溶液稀釋唾液試管120滴10滴5滴試管220滴10滴5滴試管320滴10滴5滴2.將上述各管混勻后，置37水浴中保溫10分鐘，然后每管加入碘液1滴，混勻后觀察各管顏色的區(qū)別，并說明pH對酶促反應(yīng)的影響。（五）、激動劑和抑制劑影響酶活性的實(shí)驗(yàn)觀察1. 取試管4支編號，按下操作：表4 激動劑和抑制劑影響酶活性的實(shí)驗(yàn)觀察管號pH 6.8緩沖液1淀粉溶液蒸餾水0.9NaCl1CuSO41Na2SO4稀釋唾液120滴10滴10滴5滴220滴10滴10滴5滴320滴10滴10滴5滴420滴10滴10滴5滴2. 將上述各管放入37水浴中保溫10分鐘，然后每管加入碘液1滴，混勻后觀各管顏色的區(qū)別，并說明激動劑和抑制劑對酶促反應(yīng)的影響。注意事項(xiàng)1.反應(yīng)試管應(yīng)清洗干凈，不同酶液、試劑及其滴管不能交叉混用；2.使用混合唾液，或通過預(yù)試選出合適的唾液稀釋度，效果更為顯著。思考題1.簡述溫度、pH、激動劑及抑制劑、酶濃度等因素影響對淀粉酶活性的影響。2.簡述淀粉酶活性測定的原理及注意事項(xiàng)。實(shí)驗(yàn)十五 維生素C的定量測定（2,6-二氯酚靛酚滴定法）一、目的要求（1）學(xué)習(xí)并掌握定量測定維生素C的原理和方法。（2）了解蔬菜、水果中維生素C含量情況。二、實(shí)驗(yàn)原理 維生素C是人類營養(yǎng)中最重要的維生素之一，缺少它時會產(chǎn)生壞血病，因此又稱為抗壞血酸（ascorbic acid）。它對物質(zhì)代謝的調(diào)節(jié)具有重要的作用。近年來，發(fā)現(xiàn)它還有增強(qiáng)機(jī)體對腫瘤的抵抗力，并具有化學(xué)致癌物的阻斷作用。 維生素C是具有L系糖型的不飽和多羥基物，屬于水溶性維生素。它分布很廣，植物的綠色部分及許多水果（如橘子、蘋果、草莓、山楂等）、蔬菜（黃瓜、洋白菜、西紅柿等）中的含量更為豐富。 維生素C具有很強(qiáng)的還原性。它可分為還原性和脫氫型。金屬銅和酶（抗壞血酸氧化酶）可以催化維生素C氧化為脫氫型。根據(jù)它具有還原性質(zhì)可測定其金屬含量。 還原型抗壞血酸能還原染料2,6-二氯酚靛酚（DCPIP），本身則氧化為脫氫型。在酸性溶液中，2,6-二氯酚靛酚呈紅色，還原后變?yōu)闊o色。因此，當(dāng)用此染料滴定含有維生素C的酸性溶液時，維生素C尚未全部被氧化前，則滴下的染料立即被還原成無色。一旦溶液中的維生素C已全部被氧化時，則滴下的染料立即使溶液變成粉紅色。所以，當(dāng)溶液從無色變成微紅色時即表示溶液中的維生素C剛剛?cè)勘谎趸藭r即為滴定終點(diǎn)。如無其它雜質(zhì)干擾，樣品提取液所還原的標(biāo)準(zhǔn)染料量與樣品中所含還原型抗壞血酸量成正比。本法用于測定還原型抗壞血酸，總抗壞血酸的量常用2,4-二硝基苯肼法和熒光分光光度法測定。三、實(shí)驗(yàn)器材.錐形瓶（100ml），組織搗碎器，吸量管（10ml），漏斗，濾紙，微量滴定管（5ml），容量瓶（100ml，250ml）。四、實(shí)驗(yàn)試劑1、蘋果、卷心菜等。2、2%草酸溶液: 草酸2g溶于100ml蒸餾水中。3、1%草酸溶液: 草酸1g溶于100ml蒸餾水中。4